造血干细胞的动员与归巢中山大学附属第三医院血液科 范蕊芳 医师

1、造血干细胞的动员与归巢中山大学附属第三医院血液科 范蕊芳 医师v自1993年报道应用基因重组人G-CSF动员正 常供者外周血干细胞获得成功后，allo-HSCT 在临床上得到广泛应用，并在很大程度上超 过骨髓移植成为主要的移植方式。v当进行骨髓动员时，骨髓内的造血干细胞是 如何被动员并迁移到外周血？v经静脉输入受者体内的造血干细胞又是如何 定向归巢到骨髓发挥造血重建功能？v造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是 具有自我更新及自我复制并向骨髓各系细胞 分化能力的细胞。其表面标志随个体发育时 期的不同而变化，但都具有共同的表面标志 即CD34抗原。vDNA染料标记

2、定位造血干细胞，显示未分化造血干细胞主要是集中于长骨骨小梁区、骨髓腔骨内膜内侧，而分化的造血祖细胞主要分布在骨髓中央区。 v干细胞龛(niche)，包括基质细胞、细胞外基质和 各种造血因子，主要履行的功能严格指导和控制干 细胞的正常活动，干细胞活动的调节可能是由干细 胞自身的程序设计进行，也可能是对干细胞龛产生 的或外来的各种可溶性因子等刺激物做出的反应， 最有可能的是两者均起作用。这些调节作用可以维 持干细胞处于休眠、不循环、不分化的状态，也可 以决定以哪种方式复制和向哪个种系分化。v造血微环境对于骨髓干细胞的增殖和分化起着至关 重要的作用，而骨髓基质细胞是构成骨髓微环境的 重要组成部分，基

3、质为造血细胞提供了一个定居、 增殖、分化和发育的微环境。在造血干细胞、基质 细胞和髓窦内皮细胞及骨髓基质内有一系列黏附分 子受体或配体，它们之间的相互作用介导了造血微 环境对造血的调节，也影响着造血干细胞的动员。造血干细胞的动员 早在七、八十年代初，人们发现经化疗或细胞因子 刺激后，骨髓干/祖细胞能被释放到外周血中，这一 过程被称作“动员”。许多细胞因子如G-CSF、GM- CSF、IL-7、IL-3、IL-12、干细胞因子（SCF）、 趋化因子如IL-8、Mip-1、SDF-1和化疗试剂如环 磷酰胺（Cy）等具有骨髓动员功能，其中G-CSF和 SCF的协同使用能大大提高造血干/祖细胞向外周血

4、 的动员，以及移植后造血干/祖细胞的植入。造血干细胞的归巢v造血干细胞自静脉输人体内，与基质细胞、 髓窦内皮细胞及骨髓基质内一系列黏附分子 相互作用，并受细胞因子等的调节而植入骨 髓干细胞龛(Niche)内，开始执行造血功能， 这一过程被称为造血干细胞的归巢。v参与造血干细胞动员与归巢的细胞因子：一、细胞粘附分子 （1）免疫球蛋白家族 （2）整合素家族 （3）选择素家族二、趋化因子v细胞黏附分子是一类调节细胞与细胞、细胞 与细胞外基质间相互结合、起黏附作用的膜 表面糖蛋白，可参与细胞迁徙、锚定、增殖 分化和细胞内信号转导的调控。免疫球蛋白家族vVCAM-1 (vascular cell ad-

5、hesion molecule-1， VCAM-1)广泛分布在造血和非造血细胞表面， 包括内皮细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞等， 其受体是迟现抗原-4(very late antigen-4，VI A-4)， VCAM-1可选择性地促进单个核细胞的黏附，同时 还具有广泛的免疫生物学功能，包括参与调节炎症 反应、细胞和组织的分化和发育、免疫应答，以及 参与淋巴细胞归巢等。vICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1），是白细胞功能相关抗原-1(1eucocyte unction-associated antigen-1，LFA-1)的诱导配

6、 体 ，是在细胞 表面表达的具有介导细胞间或细胞 与细胞外基质相互作用的单链跨膜糖蛋白，ICAM-1 与LFA-1相互作用与体内抗原的呈递、T淋巴细胞 的激活及淋巴细胞与内皮 细胞的黏附、淋巴细胞活 化以及归巢过程密切相关。v在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员骨髓造 血干细胞的过程中，中性粒细胞弹性蛋白酶 和组织蛋白酶G能够裂解基质细胞表面的 VCAM-1分子，下凋基质细胞与造血干细胞 之间的黏附作用，实现干细胞的动员。vKikuta等将5 mgkg的抗VCAM-l抗体及抗VI A-l抗 体连续2 d注射入小鼠体内，结果发现其外周血克隆 形成细胞(CFCs)和脾集落形成单位(CFU-S)分

7、别较 对照组增加11.4倍和21.6倍，而骨髓中的CFCs 和CFU-S较对照组明显减少。如果联合G-CSF(125 mgkg，2 d)动员，则CFCs和CFU-S分别较对照组 增加141.8倍和439.0倍，提示造血生长因子改变 了骨髓基质细胞对造血干细胞的黏附能力，从而达 到动员的目的。vVCAM-1可以增强造血干细胞向SDF-1的趋化 性及基质金属蛋白酶的分泌，显著提高了 NODSCID小鼠移植模型CD34 细胞的归巢。v采用抗CD49和VCAM-1抗体可分别阻止造血干细胞归巢于骨髓。v静息状态下VCAM -1、ICAM-l呈低水平表达，且 与配体的亲和力较低，在某些环境因素如药物作用

8、下可被快速诱导而迅速上调，斯伐他汀和肿瘤坏死 因子受体1能够增强细胞因子诱导的内皮细胞ICAM- 1、 VCAM-l的表达。v使用动员剂GCSF后VCAM -1在造血组织的骨髓细胞表达增加，在循环血及体腔中不表达。整合素家族v整合素家族的黏附分子都是由和两条链 通过非共价键连接组成的异源二聚体。v分类：迟现抗原组(1组)、白细胞黏附受 体组(2组)、血小板糖蛋白组(3组)、 4 组、 5组、 6组、 7组、 8组。v整合素家族中的淋巴细胞功能相关抗原1、迟 现抗原4 分别与ICAM-1 、VCAM-1相互作用 从而介导造血干/祖细胞与骨髓造血微环境中 的各种成分之间的黏附作用。选择素家族v选择

9、素是一类异亲型结合、Ca2+依赖的细胞 粘着分子，能与特异糖基识别并结合。主要 参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘 附。v分类：P- 选择素、E-选择素、 L-选择素。 vP-选择素主要集中分布于血小板颗粒和内 皮细胞的Webel-Palade小体，当内皮细胞或 血小板受到凝血酶、组胺等因子刺激后，P- 选择素在几分钟之内就被转运到细胞表面。vE-选择素表达于活化的内皮细胞表面，主要 集中在毛细血管后微静脉，内皮细胞受刺激 后，E-选择素于4 h表达至高峰，可维持24 h，然后从细胞膜上脱落进入血液，成为可溶 性E-选择素。vL-选择素表达于大多数白细胞表面， 包括淋巴细胞、中性粒细胞、造

10、血细胞、单 核细胞、嗜酸性粒细胞，但主要表达于中性粒细胞。v从人骨髓和胎肝中提取CD34 和CD34细胞，放 入有E、P-选择素流动室内，在不同剪切力下 流动，发现CD34 细胞在其表面滚动速度明显比 CD34一细胞慢，具有显著性差异，并被P-选择素 糖蛋白配体1单抗抑制。而CD34一细胞在无E、 P-选择素包被表面仍处流动状态。v将人的CD34 细胞移植到缺乏P-选择素、 E-选择素的NODSCID小鼠体内，发现 CD34 细胞在内皮细胞上的滚动以及在 骨髓龛中的滞留均明显减少(减少量90)。趋化因子vSDF-1属CXC型趋化因子，主要表达在骨髓基质细胞、骨髓内皮细胞以及CD34+CD38+

11、造血祖细胞。同时表达于多种组织，比如皮肤、肝胆管的上皮细胞、大脑内皮细胞和心肌。v一定的SDF-1浓度梯度维持了干细胞池的稳态。v当用G-CSF动员外周血时，各种蛋白水解酶不仅对胞外基质进行切割，还能切割SDF-1并使其失活。 v在进行骨髓动员的鼠中，骨髓SDF-1的浓度会下降，这种结果直接导致体内丝氨酸蛋白酶的积累，后者直接切割SDF-1导致其失活。 vSDF-1的受体CXCR4是一个有七个跨膜结构 域的G蛋白耦联的受体。在CD34+造血干细胞 /祖细胞表面都有广泛表达。v SDF-1CXCR4是目前明确的对造血干细胞趋化归巢起最重要作用的分子。v人的骨髓内皮细胞连续表达SDF-1 ，其通过

12、结合CD34+细胞表面的CXCR4而捕获造血干/祖细胞。v在黏附分子LFA-1/ICAM-1 和VLA-4/VCAM-1 的参与下，造血干/祖细胞与内皮细胞产生黏 附。内皮细胞表面表达的SDF-1不仅能捕获 迁移中的造血干/祖细胞，同时能通过CXCR4 介导的细胞反应，如上调黏附分子的表达， 激活干/祖细胞穿越内皮细胞层的迁移运动。vCD34 造血干细胞可依据SDF-1的浓度梯度迁 移，并且SDF-1在诱导造血干细胞趋化和转 移动员的同时，也具有刺激活性，增加造血 干细胞的增殖分化。vSCF、IL-6能诱导CXCR4在CD34+上的表达vC3aR- C3a的作用提高了SDF-1对CXCR4的识别敏感作用vCD26具有切割SDF的功能SDF-1与CXCR4信号传导通路示意图v造血干细胞与基质细胞间的粘附作用减弱Ca 破骨细胞VLA-4、c-kitMMP2、9弹性蛋白酶蛋白水解酶机体应激