第9章分子发光分析

1、第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法u概论概论u 荧光及磷光光谱法荧光及磷光光谱法u 化学发光化学发光一、概论一、概论1 1、分子发光：、分子发光：1 1）、定义：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光）、定义：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光 能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。至基态并发射出光子，此种现象称为发光。2 2）、分子发光的类型）、分子发光的类型 按激发模式分：光致发光（荧光、磷光）、化学按激发模式分：光致发光（荧光、磷光）、化学/ /生物发光生物发光 按分子激发态类型

2、：荧光、磷光按分子激发态类型：荧光、磷光3 3）、分子发光分析法：以分子发光作为检测手段）、分子发光分析法：以分子发光作为检测手段4 4）、分子发光分析法包括：荧光、磷光、化学发光分析法）、分子发光分析法包括：荧光、磷光、化学发光分析法 2 2、分子发光分析法的特点：、分子发光分析法的特点：1）灵敏度高：视不同物质，检测下限在）灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001 g/mL之间。可之间。可 见比见比UV-Vis的灵敏度高得多！的灵敏度高得多！WHY？2）选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。）选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。3）试样少、操作简便、线性范围宽。）

3、试样少、操作简便、线性范围宽。4）可测定参数多）可测定参数多二、二、 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法1. 1. 荧光及磷光的产生荧光及磷光的产生 如下图：如下图：S0PFA2A1T1S1VRVRS2VR21V=021V=0321V=0iciscic21V=0isc 图8-1. 分子内的激发和衰变过程A1, A2. 吸收；F. 荧光；P. 磷光；ic. 内转化；isc. 系间窜跃；VR. 振动弛豫.S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2T2内转换振动弛豫振动弛豫2、荧光、磷光的寿命和量子产

4、率、荧光、磷光的寿命和量子产率 1、发光寿命：荧光分子处于发光寿命：荧光分子处于S S1 1激发态的平均寿命激发态的平均寿命 f f = 1 / = 1 /（ k kf f + + K K） 荧光（或磷光）强度的衰变，通常遵从以下方程式荧光（或磷光）强度的衰变，通常遵从以下方程式ln I0 - ln It = t / ln I0 - ln It = t / 2 2、荧光量子产率、荧光量子产率 ：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值的激发光的光子数之比值 f f = k= kf f / (k/ (kf f + + K )K

5、) 荧光量子产率的数值，可通过参比法加以测定荧光量子产率的数值，可通过参比法加以测定。该法是通过比较待测荧光物该法是通过比较待测荧光物质和已知荧光量子产率的参比荧光物质两者的稀溶液在同样激发条件下所测质和已知荧光量子产率的参比荧光物质两者的稀溶液在同样激发条件下所测得的积分荧光强度（即校准的发射光谱所包含的面积）和对该激发波长入射得的积分荧光强度（即校准的发射光谱所包含的面积）和对该激发波长入射光的吸光度而加以测量的。光的吸光度而加以测量的。 U U 、F FU U 和和A AU U 分别表示待测物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度；分别表示待测物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度；

6、S 、F FS和和A As s分别表示参比物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度分别表示参比物质的荧光量子产率、积分荧光强度和吸光度 USUSSUFAFA3、荧光、磷光与分子结构的关系、荧光、磷光与分子结构的关系1）、内因）、内因 （1 1）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。共轭效应：共轭度越大，荧光越强。 （2 2）刚性结构：分子刚性越强，分子振动少，与其它分）刚性结构：分子刚性越强，分子振动少，与其它分 子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 如荧光素如荧光素（ 大）大）与酚酞与酚酞（ =0=0）；芴；芴（ =1=1）与联苯与联苯（ =0.18 =

7、0.18）。）。（3 3）取代基：）取代基： 给电子取代基增强荧光（给电子取代基增强荧光（p-p- 共轭），共轭），-NH-NH2 2、-CN-CN、NRNR2 2等；等； 吸电子基降低荧光，如吸电子基降低荧光，如 -COOH-COOH、-NO-NO2 2、-X-X等；等； 重原子降重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。弱到消失，该现象也称重原子效应。（4 4）最低电子激发单重态的性质）最低电子激发单重态的性质 * *较较nn * * 跃迁荧光强跃迁荧光强2 2）、影响分子

8、发光的环境因素）、影响分子发光的环境因素 （1 1）、）、 溶剂效应：溶剂效应： 一般来说，溶剂介电常数增大，荧光峰的一般来说，溶剂介电常数增大，荧光峰的波长增大，量子产率也增大。含有重原子的溶剂使荧光减弱波长增大，量子产率也增大。含有重原子的溶剂使荧光减弱 （2 2）、温度与黏度的影响）、温度与黏度的影响温度升高，碰撞加强，荧光和磷光下降；黏度影响相反温度升高，碰撞加强，荧光和磷光下降；黏度影响相反 （3 3）、有序介质的影响）、有序介质的影响增稳、增敏、增溶；相同电荷增敏较差增稳、增敏、增溶；相同电荷增敏较差4 4、 荧光、磷光的猝灭荧光、磷光的猝灭 荧光（或磷光）猝灭：导致发光强度下降的

9、物理或化学作用过程。荧光（或磷光）猝灭：导致发光强度下降的物理或化学作用过程。猝灭剂：引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂。猝灭剂：引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂。动态猝灭：猝灭剂与激发态分子之间的相互作用，动态猝灭：猝灭剂与激发态分子之间的相互作用，静态猝灭：猝灭剂与基态分子之间的相互作用。静态猝灭：猝灭剂与基态分子之间的相互作用。荧光的动态猝灭过程可用以下的荧光的动态猝灭过程可用以下的Stern - Volmer Stern - Volmer 方程式加以表示方程式加以表示 F0 / F = 1 + kq F0 / F = 1 + kq 0 0 Q = 1 + Ksv Q Q = 1 +

10、Ksv Q 式中式中kq kq 为双分子猝灭过程的速率常数，为双分子猝灭过程的速率常数， 0 0为没有猝灭剂存在下测得的荧光为没有猝灭剂存在下测得的荧光寿命，寿命，QQ为猝灭剂的平衡浓度，为猝灭剂的平衡浓度，Ksv Ksv 称为称为Stern VolmerStern Volmer猝灭常数，猝灭常数，静态猝灭，源于发光分子和猝灭剂形成不发光的基态络合物，可以下式表示 M + Q MQ络合物的形成常数K为 K = MQ/ MQ 荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可以推导如下： M0 = M + MQ (F0 F) / F = (M0 M) / M = MQ / M = KQ即 F0 / F = 1

11、+ KQ M0为发光分子的总浓度，F0与F分别为猝灭剂加入前后所测得的发光强度。5. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱苝的苯溶液的吸收光谱和荧光发射光谱 6 6、荧光（磷光）强度和溶液浓度的关系、荧光（磷光）强度和溶液浓度的关系。，0.05lcKcIlcI3 . 2).3!lc).32(2!lc).32(-lc.321(1II),101(IIeer，B)101(IIII,IIf0320flc0flc0t0aaf否否则则校校正正曲曲线线发发生生弯弯曲曲定定溶溶液液中中才才可可用用于于定定量量测测即即荧荧光光测测定定必必须须在在极极稀稀时时才才成成立立该该式式只只有有当当或或者者即即定定律律又

12、又。 6、荧光和磷光分析仪器（光源与检测器处于相互垂直位置）、荧光和磷光分析仪器（光源与检测器处于相互垂直位置）1）、荧光分析仪器）、荧光分析仪器第一单色器第一单色器或滤光片或滤光片记录仪第二单色器第二单色器或滤光片或滤光片荧光荧光光源光源激发激发样品池样品池（1）光源（应具有强度大、适用波长范围宽等特点：氙灯、高压）光源（应具有强度大、适用波长范围宽等特点：氙灯、高压汞灯、激光；汞灯、激光；（2）样品池：石英（低荧光材料）；）样品池：石英（低荧光材料）；（3）两个单色器：选择激发光单色器；）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器分离荧光单色器；（4）检测器：光电倍增管。）检测器：光电倍

13、增管。2 2）、）、 磷光分析仪器磷光分析仪器 在荧光仪样品池上在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图瓦瓶和斩光片。如右图所示。所示。 斩光片的作用是利斩光片的作用是利用其分子受激所产生的用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射。获取磷光辐射。转筒式转筒式7、 荧光的常规测定方法荧光的常规测定方法1 1、直接测定法、直接测定法2 2、间接测定法：荧光衍生、荧光猝灭、敏化荧光、间接测定法：荧光衍生、荧光猝灭、敏化荧光3 3、多组分混合物的荧光分析、多组分混合物的荧光分析 8 8、磷光测定的方、磷光测定的方低温磷光分析低温磷光分

14、析固体基质表面室温磷光分析（固体基质表面室温磷光分析（SS-RTPSS-RTP）胶束稳定的室温磷光分析（胶束稳定的室温磷光分析（MS-RTPMS-RTP）敏化室温磷光分析（敏化室温磷光分析（S-RTPS-RTP）三、三、 化学发光化学发光1 1、概述、概述1 1）、化学发光：不是由光、热或电能而是化学反）、化学发光：不是由光、热或电能而是化学反应激发物质所产生的光辐射应激发物质所产生的光辐射2 2）、化学发光分析的特点：灵敏度高；仪器设备）、化学发光分析的特点：灵敏度高；仪器设备简单，不需要光源及单色器；无散射及杂散光背景；简单，不需要光源及单色器；无散射及杂散光背景；线性范围宽；分析速度快线

15、性范围宽；分析速度快二、化学发光分析的基本原理二、化学发光分析的基本原理化学发光反应化学发光反应A + B C* + DC* C + h化学发光效率 clcl ： clcl = =发射光子的分子数发射光子的分子数 / / 参加反应的参加反应的分子数分子数 = = cece emem化学发光反应的发光强度化学发光反应的发光强度I Iclcl以单位时间内发射的光子数以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度反应分子浓度有关。即有关。即 I Iclcl （t t）= = clcl dc/dt dc/dt定量分析

16、方式定量分析方式1 1、峰高：峰值与浓度呈线性、峰高：峰值与浓度呈线性2 2、峰面积：积分、峰面积：积分三、化学发光的类型三、化学发光的类型按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。（1）气相化学发光）气相化学发光 主要有主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气的化学发光反应，可用于监测空气中的中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。等。P146 臭氧与乙