发酵罐操作与发酵过程中主要生化指标测定

1、小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定华南农业大学为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测 OD 值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。结果表明大肠杆菌在发酵的前三个小时处于生长延迟期，发酵 36 小时为对数生长期，发酵 6 小时后该菌开始进入平衡期，第 8 小时时结束发酵实验。发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约 1L 至数百升或稍大些。一般来说，5L

2、以下是用耐压玻璃制作罐体，10L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备1。在当今市场上，各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基本结构是类似的。本实验使用的是BIOTECH-7BGZ 发酵罐，其结构主要又罐体和控制器两大部分组成，罐体为一硬质玻璃圆筒，底和顶两端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成，容积为 5L,顶盖上有多个孔口，分别是加料及接种口补料口、放置 DO（溶解氧）电极口、放置 pH 电极口、放置消泡电极口、放置取样管口等2;本罐可配置不同性能的控制器，控制器能完成最基本

3、的功能，它由下列几部分构成：（1）参数输入及显示装置，用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度，pH、DO（溶氧）的测定数值。碱泵和酸泵分别用以向发酵罐加入碱液和酸液以调节培养液中的 pH;消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂，以消除发酵过程中产生过多的泡沫。（4）自动或人工控制按钮用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。电极连接导线：有三条连接导线，分别与 pH、DO 和 AF（消泡）电极连接。1 .材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种大肠杆菌（E.coil）1.1.2 培养基配方种子培养基：葡萄糖 1.0g,蛋白陈 1.0g,酵母膏 0.5g,牛肉膏 1.0

4、g,氯化钠 0.5g,水 1000mL,pH7.0。发酵培养基：葡萄糖 20g,蛋白陈 10g,酵母膏 5g,牛肉膏 10g,氯化钠 5g,氯化镂 5g,水 1000mL,pH7.0。1.1.3 仪器设备BIOTECH-7BGZ 发酵罐一套（配套蠕动泵、pH 电极、溶氧 DO 电极、空压机及所有连接管）、光光度计、旋转式摇床、离心机、冷藏箱、滴点装置、电子天平、电磁炉等。1.1.4 用具烧杯、三角瓶、量筒、保鲜膜、玻璃棒、比色杯、试管、离心管、移液管、波珠等。1.1.5 试剂泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。1.2 实验方法1.2.1 菌种准备1.2.1.1配制种子培养

5、基(1)配制种子固体培养基 100mL,分装试管，0.1MPa(121C)灭菌 20min,然后摆成斜面。配制种子培养液 500mL,各分装 50mL 于两个 250mL 三角瓶中(作一级种子瓶)，余下的培养液装进三个 500mL 的三角瓶中(作二级种子瓶),0.1MPa(121C)灭菌 20min。1.2.1.2接种与培养(1)上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37c 培养 24h。上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37c 振荡(125r/min)培养 12h,然后转接二级种子瓶，37C 振荡(125r/min)培养 10h。1.2.2 上罐前的准备及实罐灭菌(1)洗净发酵罐及各联接

6、胶管。配制发酵培养基 4000ml,置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。安装好发酵罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套溢流口 V2、进水阀 W1,使夹套充满水。用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀 V4,启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速 300r/min,开启冷凝水出水阀 V1,开进水阀门 S1,进行在位灭菌。将灭菌温度设为 115C,保温时间 0.33h,设为自动。当达到 795s 时，灭菌温度达到 121C。(6)灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。用 75%酒精消毒 pH 电极和 DO 电极，接入发酵罐，连接各电极导

7、线。流加碱的管线与泵和罐体连接， 通过面板操作开关选择碱泵， 打开手动开关， 使胶管内充满液体， 将输出上限设为 15%,下限设为 0,待一切准备就绪，将手动”开关调节到自动”状态。设定搅拌转速为 300r/min,空气流量 23L/min、pH7.0、DO100%,系统进入发酵状态。1.2.3 发酵操作(1)当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样(用于接种前培养基成分分析)：松开弹簧夹 J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧 J2,将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹 J3,发酵液被压入接料瓶，开J2、J3 排出取样管内残料，夹紧 J2、J3o接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松

8、接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移取火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌 OD 值。1.2.4 发酵管理(1)控制发酵过程的各项参数(温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等)，如参数出现异常现象，则应及时排除。每小时取一次样， 每次取样 50mlo 取样时先将空气流量计旋钮调至 01L/min,松开弹簧夹 J2,用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧 J2,将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹 J3,发酵液被压入量筒，当达到 40mL,开 J2 排出取样管内残料，夹紧 J3、J2o 将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜封

9、口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。每次取样前（每隔 1 小时）记录发酵过程温度、PH 值、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。1.2.5 发酵过程中各生化指标的测定1.2.5.1测定 OD 值（1）大肠杆菌标准曲线的绘制：取 10mL 离心管，与 105c 烘 2h 至恒重，用镣子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0）,精确到小数后 4 位，然后准确取 10mL 发酵液，于 3000rpm 离心 10min,弃去上清液，用蒸储水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与 100c 烘至恒重，用镣子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1）,精确至小数后 4 位，得细胞干重为 W

10、1-W0o 取同一发酵液，稀释 2、5、10、20、50 倍，于 600nm 下测 OD 值。以 0D 值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。均匀取样品 5mL 于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在 721 分光光度计上测定 A600,根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。其余发酵液于 3C,2000r/min 条件下离心分离 8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。1.2.5.2测定葡萄糖（1）样品处理：用蒸储水对样品液进行稀释待用。标定碱性酒石酸铜溶液：分别吸取 5.0mL 碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL,加入玻

11、璃珠 2粒，混匀，从滴定管滴加约 9mL 葡萄糖标准溶液，控制在 2min 内加热至沸腾，趁沸以每 2 秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL（甲、乙液各 5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。样品溶液预标定：分别吸取 5.0mL 碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL,加入玻璃珠 2 粒，混匀，控制在 2min 内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒 1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色

12、刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。样品溶液测定：分别吸取 5.0mL 碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL,加入玻璃珠 2 粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少 1mL 的样品溶液，使在 2min 内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液， 直至溶液蓝色刚好褪去为终点， 记录样液消耗体积， 同法平行操作 3 份，得出平均消耗体积。结果计算：式中：c葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；1.%2标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL;2.%2测定时平均消耗样品溶液体积，mL;N被测样品稀释倍数。放罐(1)发酵 8 小时后，测 OD 值及还原糖量

13、，当发酵液的 PH 不断上升且为碱性、OD 值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。放罐操作同取样。将全部发酵液取出后，100C 煮沸 10 分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。清洗(1)放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。再次注入自来水?!洗，操作如 1。清洗结束，关闭电源。2.结果与分析实验结果发酵过程数据结果(1)每小时记录发酵过程温度、PH 值、DO、通风、转速的测定数值，结果如下表：表 1 发酵过程各参数值时间发酵时间h温度 CPH值DO%通风L/min转速r/min取样mL空白377.01002-33002008:

14、300377.0109.02-3300509:30136.96.98124.12.53045010:30236.86.97115.62.53035011:30336.96.9244.02.83035012:30436.96.7446.23.03035013:30537.06.7243.42.03035014:30637.06.9442.12.03035015:30736.97.3938.92.03035016:30836.98.0637.12.030350取完最后一次样品后放罐大肠杆菌标准曲线绘制如下所示：下表 2 为所测菌液浓度与 OD 值间的关系表。表 2 菌液浓度与 OD 值的关系表干菌

15、体浓度（g/L）1.1600.5800.2320.1160.0580.0232测得 OD 值1.4310.7710.4810.2690.1270.043根据表 2 得到两者的关系曲线图 1,如下图：图 1 菌液 OD 值与干菌体浓度关系图得大肠杆菌干菌体浓度 x 与菌液 OD 值 y 之间的关系为：y=0.8433x-0.0773则 x=（y+0.0773）/0.8433测定不同时间发酵液的 OD 值，确定对应时间的菌液浓度，结果如下表:表 3 发酵液 OD 值与菌液浓度关系表发酵时间（h）发酵液（mL）空白培养基（mL）稀释度OD 值（y 值）x=(y+0.0773)/0.8433干菌体浓度

16、（g/L）0501 倍0.0790.1850.1851501 倍0.2550.3940.3942501 倍0.6320.8410.8413145 倍0.4330.6053.024145 倍0.7500.9814.9051910 倍0.7290.9569.5661910 倍0.8721.1311.371910 倍0.8991.1611.681910 倍0.9301.1911.9测定不同时间发酵液的葡萄糖浓度，结果如下表:表 4 培养液中葡萄糖含量表编号0123456、7、8空白稀释彳 t 数/倍1815121063一一消耗体积/mL19.177.795.856.084.534.17一9.5129

17、.017.705.996.014.674.20一9.2839.4119966.094.514.16一9.61平均消耗体积/mL9.207.806.01664.574.18一9.47还原糖含量/g/L18.5318.2118.916315.12.436.80一一数据整理及分析由于 pH 值、DO 值、干菌体浓度（g/L）、葡萄糖浓度（g/L）等数据的数值范围相差较远，难以在同一个坐标图中综合分析，故根据发酵过程中，表 1 的 pH 值、DO 彳 1%,表 3 的干菌体浓度（g/L）,表 4 的葡萄糖浓度（g/L）等数据结果，整理成下表：表 5 发酵过程各参数数据表发酵时间 hpH 值（X0.1）

18、DO 彳 1%干菌体浓度（0.1）g/L葡萄糖浓度（X1/6）g/L0701091.85111.18169.8124.13.94109.23269.7115.68.41113.46369.24430.293.78467.446.24974.58567.243.495.640.8669.442.1113一773.938.9116一880.637.1119一根据上表，以发酵时间 h 为横坐标，以 pH 值（0.1）、DO 彳！、干菌体浓度（0.1）g/L、葡萄糖浓度（X1/6）g/L等 为 纵 坐 标 ， 绘 制 发 酵 过 程 中 各 参 数 的 变 化 规 律 的 坐 标 图 ， 观 察 并

19、分 析 其 变 化 规 律 ， 从 而得到发酵过程中大肠杆菌的生长情况和培养基的利用情况。注：由于 6、7、8 号样品中蛋白质含量较多，而葡萄糖较少，用直接滴定法难以滴定，因此 6、7、8 号样品不予测定和做分析。下图为发酵过程中各参数的变化规律曲线图：大肠杆菌经过 8 个小时的分批发酵培养，发酵过程中 pH 值（M.1）、DO 彳！、干菌体浓度（M.1）g/L、葡萄糖浓度（X1/6）g/L 等参数的变化规律曲线如图所示，可以分为 3 个阶段：第一个阶段：大肠杆菌生长的延迟期是 0h 到 2h。可以从曲线图看出：在该阶段内，DO 值曲线较原始 DO值上升了一点，但幅度不大，基本还是维持在原始

20、DO 值的附近值内，葡萄糖浓度曲线和干菌体浓度曲线平缓，无明显变化，即大肠杆菌利用葡萄糖发生发酵的呼吸作用低，说明大肠杆菌还在适应发酵环境。第二个阶段：大肠杆菌生长的对数生长期是 2h 到 6ho 可以从曲线图看出：在 2h 到 3h 内，DO 值急剧下降，说明大肠杆菌快速生长，需氧量急剧上升，直至 3h 到 6h 内，DO 值在 40%50%的范围内变化，大肠杆菌代谢能力持续在高水平上，需氧量也相对地维持在高水平范围内；葡萄糖浓度曲线在 2h 后就急剧下降，大肠杆菌在代谢过程中，利用葡萄糖含量大幅度上升；干菌体浓度曲线在 2h 到 6h 内急剧上升，大肠杆菌代谢旺盛，菌体快速生长，细菌很少死

21、亡或不死亡，增长速度呈对数生长。第三个阶段：大肠杆菌生长的稳定期是 6h 后。可以从曲线图看出：6h 后，菌体浓度曲线趋于平缓，此时生长速率下降，死亡率上升，细胞数达到最大值，新生的细菌数和死亡的细菌数相当；而 DO 值在 30%左右，是由于菌体数达到最大值，仍然需要大量供氧来代谢生长。由于葡萄糖浓度在 6h 后极低，合成蛋白质多，在滴点时生成大量气泡，无法测得，故不予讨论。由于实验发酵时间有限，无法完成整个发酵过程，故不能得到大肠杆菌生长的衰亡期。总体上看，大肠杆菌的分批发酵培养过程，在限制性条件下的生长，经历了延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。在发酵过程中，pH 值的影响也是不可忽视的。

22、pH 值影响基质水解、酶活性、代谢方向，pH 不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。若不控制 pH 值，在发酵过程中，葡萄糖的代谢分解成酸和醇，使 pH 下降，氮的代谢和产物的酸性也会使 pH 下降，从而影响发酵效果，故应严格控制好 pH,该实验中 pH 控制在 7.0o 由 pH 值曲线图可以看出， 在 6h 前， pH 严格控制在 7.0 左右， 菌体正常发酵生长， 6h 后，pH 值开始上升，说明菌体开始自溶，细胞死亡。温度对发酵的影响： 温度通过影响微生物的酶反应速度、 发酵液中溶解氧而影响发酵； 温度还能影响酶系组成及酶的特性、以及生物合成方向；温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制，可根据大肠杆菌菌种的生长阶段和培养条件综合考虑，以及发酵大肠杆菌的长期经验考虑，设定该实验发酵大肠杆菌的最适温度是 37C,从表 1 可以看出，温度已严格控制在最适温度要求范围内。在发酵过程中， 通风和搅拌的剧烈程度影响着泡沫的形成。 通风和搅拌程度小， 会使发酵液的溶氧量下降， 影响后续发酵，通风和搅拌程度大，则易生成泡沫，而增加染菌的机会，使菌体提早自溶，导致菌体产量下降，故应严格控制通风和搅拌的程度，该实验中，通风量是 23L/mi