细胞工程与食品产业

1、广东药学院食品科学学院广东药学院食品科学学院食品生物技术课件E-mail:z_c_ 手机手机郑 传传 进进第六章细胞工程与食品产业第六章细胞工程与食品产业主要内容n细胞工程的概念、研究范畴细胞工程的概念、研究范畴n植物细胞培养植物细胞培养n动物细胞培养动物细胞培养n细胞融合技术细胞融合技术n细胞拆合技术细胞拆合技术第一节、概述第一节、概述 利用细胞生物学和分子生物学技术，利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品

2、或新生物品种的一门综合的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。性科学技术。概念概念1 1 细胞工程的概念及研究范畴细胞工程的概念及研究范畴研究范畴研究范畴动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞融合细胞核移植（细胞拆合）细胞核移植（细胞拆合）染色体工程染色体工程胚胎工程胚胎工程干细胞与组织工程干细胞与组织工程细胞生物反应器细胞生物反应器 1 1）植物细胞和组织培养技术）植物细胞和组织培养技术 2 2）动物细胞和组织培养技术）动物细胞和组织培养技术 3 3）细胞融合技术）细胞融合技术（体细胞杂交技术）（体细胞杂交技术） 4 4） 细胞拆合细胞

3、拆合核核移植技术移植技术5 5）染色体工程技术）染色体工程技术染色体工程是按人们的需要来添加、削减或染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程植物染色体工程6 6）胚胎工程技术）胚胎工程技术7 7）干细胞和组织工程）干细胞和组织工程8 8）细胞培养生物反应器）细胞培养生物反应器2 2、植物细胞工程的应用、植物细胞工程的应用 紫杉醇紫杉醇( (taxoltaxol) )是从红是从红豆杉属豆杉属( (TaxusTaxus

4、L.) L.)植物中植物中分离出的一个具有独特抗分离出的一个具有独特抗肿瘤活性的二萜类化合物，肿瘤活性的二萜类化合物，现已应用于临床治疗卵巢现已应用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌。癌和乳腺癌。三、三、动物细胞工程的应用动物细胞工程的应用1.1.在疫苗生在疫苗生产产上的上的应应用用 。 将将乙型肝炎表面抗原基因乙型肝炎表面抗原基因插插入哺乳入哺乳动动物物细细胞胞内内进进行高效表行高效表达达，已生，已生产产出乙型肝炎疫苗。出乙型肝炎疫苗。2. 2. 生生产产单单克隆抗体克隆抗体 单单克隆抗体可以克隆抗体可以检测检测出多出多种种病毒中非常病毒中非常细细微的微的株株间间差差异异，鉴鉴定定细细菌的菌的种种型和

5、型和亚种亚种。3.3.繁育繁育优优良品良品种种。 目前，人工受精、胚胎移植等技目前，人工受精、胚胎移植等技术术已广泛已广泛应应用用于畜牧于畜牧业业生生产产。4. 4. 在干在干扰扰素生素生产产上的上的应应用用 是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再形成组织的一项技术。形成组织的一项技术。细胞培养细胞培养第二节、植物细胞培养技术第二节、植物细胞培养技术一、一、 植物细胞工程的发展植物细胞工程的发展细胞学说细胞学说的创立：的创立：1838183818391839年间由年间由德国

6、的植物学家施莱登（德国的植物学家施莱登（SchleidenSchleiden）和）和动物学家施旺（动物学家施旺（SchwannSchwann）所提出）所提出, ,直到直到18185858年才较完善。年才较完善。 理论基础和探索理论基础和探索19021902年，德国著名植物生理学年，德国著名植物生理学家家HaberlandtHaberlandt, , 提出提出细胞全能性学细胞全能性学说说，并，并首次进行高等植物的细胞培养首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。殖。17561756年，年，MonceanMoncean首先发现植物首先发现植物在在

7、受伤愈合的组织皮层能产生芽受伤愈合的组织皮层能产生芽，因而预言这一途径可以成为一种繁因而预言这一途径可以成为一种繁殖方式殖方式培养技术建立培养技术建立植物细胞培养技术应用发展植物细胞培养技术应用发展20世纪世纪40年代：年代：J.Bonner 银胶菊组织培养生产橡银胶菊组织培养生产橡胶。胶。20世纪世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。年代：植物细胞培养生产药用成份。20世纪世纪80年代：年代：400多种植物，多种植物，600多种代谢产物。多种代谢产物。40多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。20世纪世纪90年代：年代：1000多种植物。多种植物。

8、 1.首先，首先，要取材和除菌要取材和除菌。用一定的化学试剂对。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。长的细胞。 常用的消毒灭菌剂常用的消毒灭菌剂: :效果较好的有几种化学试剂，效果较好的有几种化学试剂，如如次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。等。二、细胞培养一般步骤二、细胞培养一般步骤 2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作养基，

9、对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将技术，将生物材料接种于培养基生物材料接种于培养基中。中。3. 最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。 三三. .植物细胞培养基植物细胞培养基植物细胞的培养基植物细胞的培养基: :通常包括通常包括无机盐、碳源、无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂维生素、生长调节素、有机添加剂等。等。 用于植物细胞培养的基础培养基营养成分用于植物细胞培养的基础培养

10、基营养成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的要求要求无机盐无机盐：有不少盐可用来提供有不少盐可用来提供“大量元素大量元素”和和“微量元素微量元素”，表中给出了常用培养基中，表中给出了常用培养基中无机盐的含量。无机盐的含量。培养中的细胞对培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖蔗糖和葡萄糖都能利用，都能利用，果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用

11、其它糖作能源，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。但效果不佳。碳源和能源碳源和能源 培养中的植物细胞都需要培养中的植物细胞都需要硫胺素硫胺素，加入，加入烟烟酸、泛酸、生物素和叶酸酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。质体培养通常需要大多数必需维生素。维生素维生素虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入的氨基酸，但加入L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺或其他氨基酸混合或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基

12、酸。其它有机添加剂如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸氨基酸激素分为两类，激素分为两类，生长素和分裂素生长素和分裂素。生长素促进。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙吲哚乙酸和萘乙酸酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是物。使用最多的是6-6-苄氨基嘌呤和玉米素苄氨基嘌呤和玉米素，对芽，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。使用，来促进细

13、胞的分裂、生长。植物生长激素植物生长激素四四. .愈伤组织和悬浮细胞培养技术愈伤组织和悬浮细胞培养技术愈伤组织愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。而且还未形成组织的结构。外植体：外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。的植物材料。 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶选择适宜的培养基：选择适宜的培养基：MSMS，B5B5，N6N6较高激素

14、浓度较高激素浓度丰富的有机附加物。丰富的有机附加物。培养基中有较高含量的无机氮源培养基中有较高含量的无机氮源较低的蔗糖浓度较低的蔗糖浓度适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易碎愈伤组织的形成。碎愈伤组织的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎适宜悬浮培养适宜悬浮培养适宜再生植株适宜再生植株悬浮系的建立与培养悬浮系的建立与培养callus150250ml flaskcentrifuge isolati

15、onsubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm高表达细胞系的筛选建立高表达细胞系的筛选建立一是悬浮培养物分散性好，外观疏松、色泽鲜艳一是悬浮培养物分散性好，外观疏松、色泽鲜艳二是均一性好二是均一性好三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强五五. .单细胞培养技术单细胞培养技术机械法机械法将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。化细胞。优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手

16、工操作难度大，获得完整的细化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。胞数量少。1 1、单细胞分离方法、单细胞分离方法酶法酶法利用利用果胶酶、纤维素酶果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。外植物体，使细胞分离。加渗透压保护剂如加渗透压保护剂如甘露醇甘露醇以防酶对细胞的损以防酶对细胞的损伤。伤。加加硫酸葡聚糖钾盐硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。可提高游离细胞的产量。化学法化学法 利用利用化学药剂使细胞分离的方法。利用利用化学药剂使细胞分离的方法。 草酸钙草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。得分散细胞。秋

17、水仙碱、秋水仙碱、2，4D或或LH。看护培养看护培养2 2、单细胞培养方法、单细胞培养方法用一块活跃生长的愈伤组织来促用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。进培养细胞持续分裂和增殖的方法。优点：优点：简便易行，效果好。简便易行，效果好。缺点：缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。平板培养平板培养平板培养平板培养平板培养植板率平板培养植板率优点：优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显单细

18、胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。选量大、操作简便。缺点：缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成通气状况不好，排泄物质易积累造成 毒毒害或影响组织吸收。害或影响组织吸收。微室培养微室培养在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。胞团的方法。置培养皿中置培养皿中2628 恒温培养恒温培养优点：优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂

19、、分化等过程。个细胞的生长、分裂、分化等过程。缺点：缺点：培养基少，营养和水分难以保持，培养基少，营养和水分难以保持，pH变动变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。幅度大，培养细胞仅能短期分裂。六六. .提高植物细胞次级代谢产物含量的方法提高植物细胞次级代谢产物含量的方法加入前体物或诱导物加入前体物或诱导物前体物：前体物：次生代谢合成途径中的某一中次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。间化合物或是合成的起始物。诱导物：诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。变化或代谢途径改变的物质。毛状根培养毛状根培养毛状根毛状根(hairy roots

20、)是发根农杆菌是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其感染植物后，其Ri质粒上的质粒上的TDNA片断整片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 冠瘿瘤培养冠瘿瘤培养植物细胞大规模培养在食品工业中的应用植物细胞大规模培养在食品工业中的应用（1 1）利用植物细胞工程生产香料）利用植物细胞工程生产香料（2 2）生产食品添加剂）生产食品添加剂（3 3）生产天然食品）生产天然食品 七、植物细胞大规模培养七、植物细胞大规模培养植物细胞大规模培养的特点植物细胞大规模培养的特点植物细胞对剪切力敏感。植物细胞对剪

21、切力敏感。 植物细胞培养通常形成细胞团。植物细胞培养通常形成细胞团。 植物细胞生长速度慢，操作周期长植物细胞生长速度慢，操作周期长 多泡沫。多泡沫。植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。大多数植物细胞培养需要光照。大多数植物细胞培养需要光照。几种流体特征几种流体特征1-宾汉型 2-假塑性 3-牛顿型 4-涨塑性 1-涨塑性 2-牛顿型 3-假塑性 1.1.植物细胞悬浮细胞培养植物细胞悬浮细胞培养悬浮细胞培养技术悬浮细胞培养技术悬浮培养优势悬浮培养优势把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增

22、殖培养把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养1 1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。2 2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。浓度过高的问题。3 3）能充分保证氧的供给。）能充分保证氧的供给。2.2.植物细胞固定化培养植物细胞固定化培养 植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。技术。固定化培养技术固定化培养技术（1）有利于次生物质的合成、积累；）

23、有利于次生物质的合成、积累；（2）减弱剪切力损伤；减弱剪切力损伤；（3）有利于连续培养和产物的收集；）有利于连续培养和产物的收集；固定化培养优势固定化培养优势1 1）悬浮培养生物反应器）悬浮培养生物反应器 植物细胞大规模培养的初期（植物细胞大规模培养的初期（20世纪世纪70年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。应器。 1972年，年，Kato首先用机械搅拌反应器培养首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞以获取烟碱。烟草细胞以获取烟碱。Fujita利用这种反应器利用这种反应器生产紫草宁。生产紫草宁。3.3.植物细胞培养生物反应器植物细胞培养生物反应器机械

24、搅拌反应器机械搅拌反应器机械搅拌植物细胞反应器机械搅拌植物细胞反应器 机械搅拌反应器的优点及存在的问题机械搅拌反应器的优点及存在的问题 优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得得高的溶氧系数高的溶氧系数 (KLa 100h-1)，植物细胞培养一植物细胞培养一般只需要般只需要KLa在在5-20 h-1之间就够了；再是反应器的之间就够了；再是反应器的温度、温度、pH值、溶氧及营养物质的浓度较易控制值、溶氧及营养物质的浓度较易控制。 存在的问题：主要问题是存在的问题：主要问题是剪切力问题剪切力问题；对只需；对只需较低较低kLa的植物细胞培养，促进氧传递的机械

25、搅的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每拌，每单位体积消耗的功率比气体搅拌要大单位体积消耗的功率比气体搅拌要大；机；机械搅拌需搅拌轴，由此又带来了械搅拌需搅拌轴，由此又带来了无菌密封无菌密封问题。问题。非机械搅拌反应器非机械搅拌反应器 通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓鼓泡式反应器泡式反应器和和气升式反应器气升式反应器，气升式反应器又，气升式反应器又可分为外循环和内循环式。可分为外循环和内循环式。 我国的刘大陆、查丽杭等发明了我国的刘大陆、查丽杭等发明了“气升内气升内错流式错流

26、式”植物细胞培养反应器用于培养紫草，植物细胞培养反应器用于培养紫草，紫草宁含量达到了干细胞重的紫草宁含量达到了干细胞重的10%，是天然，是天然植株的植株的2-8倍。倍。气体搅拌反应器的优点及存在的问题气体搅拌反应器的优点及存在的问题 优点：优点：剪切力小剪切力小，对植物细胞损伤小；，对植物细胞损伤小；因没有搅拌轴而更因没有搅拌轴而更易保持无菌易保持无菌；操作费用低操作费用低。 不足：因气体搅拌强度低，不足：因气体搅拌强度低，高密度培养时混高密度培养时混合不够均匀合不够均匀。靠大量的通气输入动量和能量，以。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。但保证反应器内培养液的良

27、好传质、传热。但过量过量的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯，对于，对于细胞生长有阻碍作用。再是细胞生长有阻碍作用。再是过高的溶氧对植物细过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利胞合成次级代谢产物不利。2)2)固定化细胞生物反应器固定化细胞生物反应器固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。剂利用。优点：单位体积细胞多，受剪切力小。优点：单位体积细胞多，受剪切力小。缺点：由于其混合效果低，对必要的氧缺点：由于其混合效果低，对必

28、要的氧传递，传递，pH值、温度控制和气体产物值、温度控制和气体产物(如如C02)的排除造成了困难。再者支持物颗的排除造成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。粒破碎易堵塞填充床。填充床反应器填充床反应器Jones 在填充床反应器中进行了固定化胡萝在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培养，卜的培养，Kargi 采用这种反应器培养长春采用这种反应器培养长春花花流化床反应器流化床反应器优点：良好的传质特性。优点：良好的传质特性。缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。使之难以放大。 典型的流化床反

29、应器是利用液体或气体典型的流化床反应器是利用液体或气体的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。Hamilton 用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。膜反应器膜反应器优点：可以重复使用。另外，流体易控制，优点：可以重复使用。另外，流体易控制，易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有选择性，有利于产品分离。选择性，有利于产品分离。 缺点是构建膜反应器的成本较高。缺点是构建膜反应器的成本较高。第三节、动物细胞培养技术第三节、动物细胞培养技术 1919世纪世纪3030年代，年代，Muller,

30、Schwann, VircMuller, Schwann, Virchowhow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到理组织中观察到多核细胞多核细胞现象。现象。 1849 1849年年LobingLobing在骨髓中也发现了多核现象在骨髓中也发现了多核现象的存在，的存在，18551855年年18581858年，科学家们在肺组织年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。核细胞。 1 1融合现象的发现融合现象的发现一、一、动物物细胞工程的发展动物物细胞工程的发展18591859年，年，

31、A. A. BarliBarli在研究黏虫的生活史时发在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个核细胞融合形成多现，某些黏虫存在着由单个核细胞融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的是由单个细胞彼此融合而形成的。2. 2. 动物组织细胞培养技术的建立动物组织细胞培养技术的建立19071907年，年，R. HarrisonR. Harrison将将蛙的胚神经管区蛙的胚神经管区的一片组织的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织组织存活了若干星期存活了若干星期，而且还，而且还长出了轴突长出

32、了轴突( (神神经纤维经纤维) )细胞。细胞。Carrel (1911)Carrel (1911)发现了鸡胚浸出液对于某发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，把些细胞的生长具有很强的促进效应，把无菌无菌技术引到了组织培养技术中技术引到了组织培养技术中。19141914年，年，ThomsonThomson创立了创立了器官培养法器官培养法，以，以后被后被StrangewaysStrangeways和和FellFell所发展。所发展。19401940年，年，EarleEarle建立了建立了小鼠的结缔组织细小鼠的结缔组织细胞系胞系L L系。系。19511951年，年，GayGay建立了

33、第一个建立了第一个人人体细胞系体细胞系. .3. 3. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生19581958年年, Okada, Okada发现紫外灭活的发现紫外灭活的仙台病毒仙台病毒可可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。Harris(1965)Harris(1965)诱导诱导不同的动物体细胞融合不同的动物体细胞融合获得成功。获得成功。Lifflefield(1964)Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷根据亲本细胞的酶缺陷型，利用选择性培养基型，利用选择性培养基筛选异型融合细胞筛选异型融合细胞，并，并能不断地能不断地

34、增殖增殖。19751975年，免疫学家年，免疫学家KohlerKohler和和MilsteinMilstein利用利用小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌分泌单一抗体的杂种细胞单一抗体的杂种细胞。4. 4. 动物克隆技术的建立动物克隆技术的建立18911891，HeapeHeape等人首次报道了家等人首次报道了家兔胚胎移植兔胚胎移植成功的结果。成功的结果。2020世纪世纪3030年代以后，先后在羊、猪、牛等年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。动物的胚胎移植上获得成功。19621962年，英国学者年，英国学者GrudonGrudo

35、n把非洲把非洲爪蟾小爪蟾小肠上皮细胞的核肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵受精卵( (经紫外线照射杀死卵细胞核经紫外线照射杀死卵细胞核) )中，约中，约有有1 1的重组卵发育成为成熟蛙的重组卵发育成为成熟蛙。19971997年年2 2月，英国科学家月，英国科学家WilmutWilmut等报道等报道了世界第一只了世界第一只克隆羊克隆羊的诞生。的诞生。1.1.过程过程二、动物细胞培养二、动物细胞培养2.2.几个概念：几个概念： 动物细胞培养就是动物细胞培养就是从动物机体中取出相关从动物机体中取出相关的组织的组织, ,将它分散成单个将它分散成单个细胞细胞, ,然后然

36、后, ,放在适宜的放在适宜的培养基中培养基中, ,让这些细胞生让这些细胞生长和增殖长和增殖, ,并维持结构和并维持结构和功能的一门技术。功能的一门技术。动物细胞培养动物细胞培养将动物组织消化后的初次培养称为将动物组织消化后的初次培养称为原原代培养代培养。原代培养和传代培养原代培养和传代培养用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程叫叫传代培养传代培养。细胞系和细胞株细胞系和细胞株初次培养的细胞经第一次传代成功后，即称初次培养的

37、细胞经第一次传代成功后，即称之为之为细胞系细胞系。从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选方法，分离培养或通过筛选方法，由单细胞增殖形成由单细胞增殖形成的细胞群的细胞群，称，称细胞株细胞株。有限细胞系和无限细胞系有限细胞系和无限细胞系大多数细胞系在大多数细胞系在有限的代数内增殖有限的代数内增殖，当，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成无限细胞系或称衰老死亡，二是发育成无限细胞系或称连续细连续细胞系胞系。 有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转

38、换期，其转换过程在动物细胞培养中称为为转换期，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化体外转化。接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制3.3.动物细胞培养生长的特点动物细胞培养生长的特点贴附生长贴附生长贴附生长贴附生长 粘附型细胞粘附型细胞: :附着在某一固相支持物表面才能生附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。长的细胞。 悬浮型细胞悬浮型细胞: :不必附着于固相支持物表面，而不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞肿瘤细胞和白细胞

39、可在悬浮状态下可在悬浮状态下生长。生长。 细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止的现象。胞分裂和生长停止的现象。密度抑制密度抑制细胞培养过程中，细胞培养过程中，细胞密度增大，培养液细胞密度增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而导致的细胞分裂和生的枯竭和代谢物的影响而导致的细胞分裂和生长停止长停止。体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，体外：多数情况，细胞

40、只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同细胞在体内、外的粘附方式存在差异细胞在体内、外的粘附方式存在差异上皮细胞型上皮细胞型成纤维细胞型成纤维细胞型游走细胞型游走细胞型多型性细胞型多型性细胞型4 4、培养动物细胞形态、培养动物细胞形态类似体内的上皮细胞，类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，扁平，不规则多角形，中有圆形核中有圆形核。彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈。彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动上皮细胞型上皮细胞型胞体胞体梭形或不规则三角形梭形或不规则三角形；胞质向外伸出；胞质向外伸出2 23

41、 3个长短不等的个长短不等的细胞突起细胞突起；中有；中有卵圆形核卵圆形核。排列成放射。排列成放射状，漩涡状，不连成片。状，漩涡状，不连成片。成纤维细胞型成纤维细胞型游走细胞型游走细胞型外形不规则且不断外形不规则且不断变化变化，细胞内容易出，细胞内容易出现暗的现暗的吞噬性颗粒吞噬性颗粒。生长位置不固定，分生长位置不固定，分散，呈活跃的的游走散，呈活跃的的游走和变形运动。和变形运动。多型性细胞型多型性细胞型外形不规则，外形不规则，细胞由略呈细胞由略呈多角形的胞多角形的胞体体和细长的、类似伪足的和细长的、类似伪足的胞突胞突两部分组成，两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒胞内容易出现暗的吞噬性颗粒血

42、清血清：如：如HelaHela细胞系在高血清成纤维细胞样；细胞系在高血清成纤维细胞样；低血清上皮样细胞低血清上皮样细胞 pHpH：如如HelaHela细胞系，太酸或太碱成纤维细胞样；细胞系，太酸或太碱成纤维细胞样；标准标准pHpH上皮样细胞上皮样细胞细胞密度细胞密度：3T33T3，低密度成纤维细胞样；高密度，低密度成纤维细胞样；高密度上皮样细胞上皮样细胞生长状态改变生长状态改变：悬浮圆形悬浮；贴附成纤维：悬浮圆形悬浮；贴附成纤维或上皮样或上皮样 转化与否转化与否 ：未转化成纤维样；转化后可成上皮：未转化成纤维样；转化后可成上皮样样 培养细胞形态变化培养细胞形态变化三、培养细胞的生长和增殖过程三

43、、培养细胞的生长和增殖过程1.1.培养细胞生命期培养细胞生命期 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、原代培养期、传代培养期传代培养期及及衰退期衰退期。正常培养的细胞周期正常培养的细胞周期2.2.体外培养细胞一代生存期体外培养细胞一代生存期- -生长曲线生长曲线潜伏期潜伏期指数增长期指数增长期平衡期平衡期衰退期衰退期 所谓细胞的所谓细胞的“一代一代”是指从细胞接种到分离是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。再培养的一段时间。四、动物细胞培养的基本技术四、动物细胞培养的基本技术1. 1. 无菌、无毒

44、的环境无菌、无毒的环境添加一定量的抗生素，定期更换培养液。添加一定量的抗生素，定期更换培养液。2. 2. 温度和温度和pHpH温度温度pH与体内相近与体内相近 35-377.27.43. 3. 气体环境气体环境O O2 2COCO2 2细胞代谢所必需细胞代谢所必需维持维持pHpHu COCO2 2培养箱（培养箱（95% 95% 空气空气5% CO5% CO2 2 ）5 .5 .平衡盐溶液平衡盐溶液BSSBSS人工合成培养基的基础用液，用来洗涤人工合成培养基的基础用液，用来洗涤细胞。细胞。Hanks液、液、Earle液和液和PBS液等液等4. 4. 营养物质营养物质 糖、氨基酸、促生长因子、无机

45、盐、微量糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物或人血清等。元素、激素以及动物或人血清等。RPMI-1640 细胞培养基成分细胞培养基成分 （配制时添加碳酸氢钠（配制时添加碳酸氢钠2000mg/L）五、动物细胞大规模培养五、动物细胞大规模培养培养方式分为：培养方式分为： 分批式分批式 流加式流加式 半连续式半连续式 连续式连续式1.1.动物细胞大规模培养工艺方式动物细胞大规模培养工艺方式 分批式培养分批式培养分批式培养：指先将细胞和培养液分批式培养：指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，断生长，产

46、物不断形成，经一段时间后，终止培养。终止培养。特点：特点：分批式培养过程的环境随时间变化很大分批式培养过程的环境随时间变化很大细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。期、减速期、平稳期和衰退期。流加式培养流加式培养 特点：特点：u可避免某种营养成分的初始浓度过高；可避免某种营养成分的初始浓度过高；u能防止营养成分在培养过程中被耗尽；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；u整个过程反应体积是变化的。整个过程反应体积是变化的。 流加式培养是指先将终体积流加式培养是指先将终体积1/31/2的的培养液培养液装入反应器，接种细胞，进行培养，在培养过

47、程中，装入反应器，接种细胞，进行培养，在培养过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又不断补充至反应器内，使细胞持续生长代谢，到反不断补充至反应器内，使细胞持续生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。应终止时取出整个反应系。半连续式培养半连续式培养 指在分批式培养的基础上，将分批培养指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞半连续培养能够重复获得大量均一

48、的培养细胞供进一步利用。供进一步利用。特点：操作简便、生产效率高，可长期特点：操作简便、生产效率高，可长期生产，细胞密度和产品产量一直保持在较生产，细胞密度和产品产量一直保持在较高水平。高水平。连续式培养连续式培养连续式培养：指在培养过程中，以不断抽取连续式培养：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持反应条件处于一种恒不断得到养分补充，保持反应条件处于一种恒定状态。定状态。特点：特点： （1 1）反应器培养状态恒定，保持细胞在优化状）反应器培养状态恒定，保持细胞在优化状态下生长；态下生长；（2 2）适于大

49、规模工业化生产；）适于大规模工业化生产； (3) (3)操作复杂、增加污染机会、细胞变异、设操作复杂、增加污染机会、细胞变异、设备仪器要求高备仪器要求高 2 2、动物细胞大规模培养技术、动物细胞大规模培养技术悬浮培养悬浮培养贴壁培养贴壁培养固定化培养固定化培养微载体培养技术微载体培养技术大载体培养技术大载体培养技术多孔载体培养多孔载体培养微囊化培养技术微囊化培养技术中空纤维细胞培养技术中空纤维细胞培养技术第三节细胞融合技术第三节细胞融合技术是指在外力的作用下，两个以是指在外力的作用下，两个以上的异源（种、属）细胞或原生质体上的异源（种、属）细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜互相接触

50、，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。杂合细胞的现象。细胞融合（体细胞杂细胞融合（体细胞杂交）交） 植物体细胞融合应用示例植物体细胞融合应用示例杂交的两个细胞杂交的两个细胞用纤维素酶、果胶酶处用纤维素酶、果胶酶处理细胞壁理细胞壁原生质体、原生质体、经离心、振经离心、振动、电刺激动、电刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）诱导诱导融合后的原生质体融合后的原生质体再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化细胞分裂细胞分裂愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株再分化再分化（植物体细胞（植物体细胞融合完成的标融合完成的标志）志）植植物物细细胞

51、胞融融合合植物植物组织组织培养培养细胞在促融因子的作用下，出现细胞在促融因子的作用下，出现凝集凝集现象，现象，然后，细胞之间的然后，细胞之间的质膜发生粘连质膜发生粘连，细胞开始，细胞开始细胞细胞质融合质融合，然后在培养过程中，进而发生，然后在培养过程中，进而发生核融合核融合，形成杂种细胞。形成杂种细胞。细胞融合的过细胞融合的过程程细胞融合细胞融合一.诱导细胞融合的方法1 1、病毒诱导细胞融合、病毒诱导细胞融合病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒

52、最常用。等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或紫外线或-丙内酯灭活丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。留病毒的融合活性。 两个原生质体或细两个原生质体或细胞在胞在病毒黏结作用病毒黏结作用下彼下彼此靠近，使两个细胞膜、此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透胞质间互相渗透 、细胞、细胞核互相融合，进入正常核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，形成的细胞分裂途径，形成杂种细胞。杂种细胞。机制机制优点：优点：融合率较高融合率较高，适宜各种动物细胞适宜各种动物细胞，且仙台病毒，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，能在鸡胚中大

53、量繁殖，容易培养容易培养；缺点：仙台病毒缺点：仙台病毒不稳定不稳定，在保存过程中融合活性会降，在保存过程中融合活性会降低，并且低，并且制备过程比较烦琐制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，。此外，病毒引进细胞后，可能会可能会对细胞的生命活动产生干扰对细胞的生命活动产生干扰。病毒诱导融合优缺点病毒诱导融合优缺点常用的病毒：（Sendal virus),又称称日本血凝病毒（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 属属于副粘液病毒科，RNA病毒，圆圆球形， 1962年，日本仙台东东北大学学学学者冈冈田发现发现仙台病毒可诱导细诱导细胞融合。 仙台病毒仙台病毒利用化学

54、融合剂，促使原生质体相互靠近、利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。粘连融合的方法。2 2、化学融合剂法、化学融合剂法机制机制：PEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, 存在不同分子存在不同分子量的多聚体量的多聚体,它可它可改变各类细胞的膜结构改变各类细胞的膜结构, 使两细使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能能,从而造成细胞之间发生融合从而造成细胞之间发生融合.。优缺点优缺点:聚乙二醇是化学试剂，聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方使用起来很

55、方便便，诱导细胞融合的频率比较高诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定，但是它有一定毒性毒性，对有些细胞，对有些细胞(如卵细胞如卵细胞)不适用。不适用。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）诱导融合）诱导融合 机制机制：一般认为是：一般认为是NaNa+ +造成了膜电位的改变。造成了膜电位的改变。存在的缺陷存在的缺陷：就是融合频率低，而且对于来源：就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。由由NaNONaNO3 3诱导的可重复、可控制的离体原生质体诱导的可重复、可控制的离体原生质体融合是由融合是由PowerPower等（等（19701970）报道

56、的。利用这一融合剂，）报道的。利用这一融合剂，CarlsonCarlson等（等（19721972）在植物中获得了第一个体细胞杂）在植物中获得了第一个体细胞杂种，种，NaNONaNO3 3处理诱发融合处理诱发融合高高CaCa2+2+高高pHpH诱发融合的机制尚不很清楚，一诱发融合的机制尚不很清楚，一般认为是改变了膜位及膜的物理结构。般认为是改变了膜位及膜的物理结构。烟草叶肉原生质体烟草叶肉原生质体在高在高CaCa2+2+（0.05M CaCl0.05M CaCl2 2）和高和高pHpH（10.510.5）条件下能很快诱发融合（）条件下能很快诱发融合（3737），），但融合频率不很高，高但融合频

57、率不很高，高pHpH也影响原生质体的存活率，也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合。且易诱发多个原生质体融合。 高高pHpH高浓度钙离子处理高浓度钙离子处理 19811981年，年，ScheurichScheurich和和ZimmermannZimmermann发明了电诱发明了电诱导细胞融合。导细胞融合。 采用直流电脉冲的诱导，可改变原采用直流电脉冲的诱导，可改变原生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、闭合、产生融合体。闭合、产生融合体。3 3、电诱导细胞

58、融合法、电诱导细胞融合法细细胞电电融合原理：悬于大小不同的两平行悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的电极间的低导电率溶液中的细胞，在交流电场中（细胞，在交流电场中（1 110100MHz0MHz和和1001001000V/cm1000V/cm ），），会向小电极移动，并会向小电极移动，并极化成极化成偶极子偶极子，并沿电场方向排列，并沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发产生可逆电降解，从而触发细胞融合。细胞融合。+-+-+-+-+偶极子偶极子电

59、诱导法原理电诱导法原理+-+ 电泳：在电极的作用下，原生质体电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。珠链。 融合：由于膜的可逆性电激穿，使融合：由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合。原生质体发生融合。电融合包括两个步骤：电融合包括两个步骤：原生质质体电电融合过过程1 1）在高频电流电场下的相互接触。）在高频电流电场下的相互接触。2 2）脉冲刺激后）脉冲刺激后30s30s3)503)50秒后秒后4 4）1.51.5分钟后分钟后5 5）6 6分钟后分钟后6 6）1515分钟后，原生质体融合完成。分钟后，原生质体融合完成。优点：

60、优点：融合率高，达融合率高，达70708080，甚至，甚至100100可在显微镜下定向诱导细胞融合可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞可直接挑选杂种细胞重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去单；免去PEGPEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。强等。缺点缺点：必须购置专用的细胞电融合设备。：必须购置专用的细胞电融合设备。电融合仪电融合仪激光诱导细胞融合激光诱导细胞融合光镊的原理光镊的原理光镊牵拉单细胞运动光镊牵拉单细胞运动光镊辅助细胞融合光镊辅助细胞融合离子束诱导细胞融合离子束诱导细胞融