第三章酶化学

1、酶化学一、酶的化学本质、组成及结构一、酶的化学本质、组成及结构二、酶催化作用的特点二、酶催化作用的特点 酶是活细胞产生的，具有催化生酶是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸。物反应功能的蛋白质大分子及核酸。 1、大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质：基本单位氨基酸基本单位氨基酸 化学结构与空间结构；化学结构与空间结构；理化性质理化性质:两性性质；胶体性质；两性性质；胶体性质；变性失活；可被蛋白酶分解；具有蛋白质的显色应。变性失活；可被蛋白酶分解；具有蛋白质的显色应。2、某些某些RNA具有催化活性具有催化活性,将本质为将本质为RNA 的酶称的酶称核酶（核酶（ribozymes)。（

2、1）、单纯酶）、单纯酶（简单蛋白质）：（简单蛋白质）： 其活性仅取决于其蛋白质结构。其活性仅取决于其蛋白质结构。 如：胃蛋白酶、淀粉酶等。如：胃蛋白酶、淀粉酶等。 辅助因子辅助因子(cofacter)：热稳定的非蛋白小分热稳定的非蛋白小分子。子。l按分子组成：按分子组成： 金属离子金属离子：Mg2+、Mn2+ 小分子有机物小分子有机物：NAD + 、NADP + 各种维生素各种维生素辅酶辅酶(coenzyme): 结合较结合较松松，可透析去除可透析去除； 辅基辅基(prosthetic grup)： 结合较结合较紧紧，透析不易除去透析不易除去。酶蛋白酶蛋白负责专一性；负责专一性；辅助因子辅助因

3、子负责电子、原子或基团转移。负责电子、原子或基团转移。 同一辅因子可与多种不同酶蛋白结同一辅因子可与多种不同酶蛋白结合，显示不同催化活性。合，显示不同催化活性。与一般化学催化剂相比，与一般化学催化剂相比，其共性有其共性有：1、酶易失活、酶易失活2、催化效率高；、催化效率高；3、酶的催化具有高度的专一性、酶的催化具有高度的专一性l凡使凡使pr变性的因素都可使酶破坏变性的因素都可使酶破坏,l酶在温和条件下作用。酶在温和条件下作用。 l通常要高出非生物催化剂催化活性的通常要高出非生物催化剂催化活性的1061013倍。倍。2H2O22H2O + O21mol过氧化氢酶过氧化氢酶 5106molH2O2

4、1molFe+2 610-4molH2O2l 一种酶只能催化一种酶只能催化一种一种或或一类一类十分相似的反应。十分相似的反应。l底物（底物（substrate ，S)：酶作用的物质：酶作用的物质。l绝对专一性绝对专一性：只作用：只作用一种一种底物。底物。l相对专一性相对专一性：作用于：作用于一类一类底物。底物。酶的专一性酶的专一性：一种酶仅能作用于一种：一种酶仅能作用于一种底物，或一类分子结构相似的物质，底物，或一类分子结构相似的物质，并催化某种类型的反应。这种特性并催化某种类型的反应。这种特性称为酶的专一性，又叫做酶的特异称为酶的专一性，又叫做酶的特异性或选择性。性或选择性。酶作用的酶作用的

5、专一性专一性非立体化学非立体化学专一性专一性立体化学专一性立体化学专一性基团和键的专一性基团和键的专一性绝对专一性绝对专一性族族（基团）（基团）专一性：可作用于一类或一些结构很相似专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。的底物。RCOO- +R OH + H+酯酶酯酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2胰蛋白酶的基团专一性胰蛋白酶的基团专一性l酶只能催化一种立体异构体发生某种化

6、酶只能催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对另一种立体异构体则无作学反应，而对另一种立体异构体则无作用。用。（一）（一）锁钥学说锁钥学说：1894年年E.Fischer 提出：提出：S分子或分子或其一部分像钥匙其一部分像钥匙一样楔入一样楔入E活性活性中心部位。中心部位。 此学说强调此学说强调E与与S结构互相吻合结构互相吻合(刚性模板刚性模板)。1958年年Koshland 提提出：当出：当E与与S接近时，接近时，E蛋白受蛋白受S分子的诱分子的诱导，其构象发生有导，其构象发生有利于利于S结合的变化结合的变化，E与与S在此基础上互在此基础上互补契合、进行反应。补契合、进行反应。（一）（一）酶的活

7、性中心酶的活性中心概念：概念：活性中心：活性中心：酶分子中能同底物结合并起催化作用酶分子中能同底物结合并起催化作用的空间部位。的空间部位。羧肽酶的活性中心羧肽酶的活性中心l实验：实验：酶蛋白经酶蛋白经水解切去部分肽水解切去部分肽链后，残留部分链后，残留部分仍有活性。仍有活性。l说明：说明：参与催化参与催化反应的只是其中反应的只是其中一小部分，即一小部分，即活活性中心。性中心。活性中心即酶分子活性中心即酶分子中在三维结构上中在三维结构上相互靠近的几个相互靠近的几个aa残基或其上的残基或其上的某些基团。某些基团。活性中心以外的部活性中心以外的部分对酶催化次要分对酶催化次要但对活性中心形但对活性中心

8、形成提供结构基础。成提供结构基础。胰凝乳蛋白酶的活性中心胰凝乳蛋白酶的活性中心1、仅为酶体积的很小部分；、仅为酶体积的很小部分；2、具有一定的空间构象；、具有一定的空间构象；3、是由特定空间构象维持、是由特定空间构象维持的一个的一个裂隙裂隙4、酶的活性中心具有可运、酶的活性中心具有可运动性和柔性动性和柔性5、酶的活性中心与酶作用、酶的活性中心与酶作用的专一性有关的专一性有关酶促反应机理酶促反应机理溶菌酶活性中心l酶的催化作用，过渡态，活化能酶的催化作用，过渡态，活化能l中间产物学说中间产物学说l过渡态互补过渡态互补l使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素1、 酶的催化作用与分子活化能

9、酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式化学反应自由能方程式G =H -TS（ G是总自由能的变化，是总自由能的变化， H 是总热能的变化，是总热能的变化，S是熵是熵的变化）的变化）当当G0，反应不能自发进行。，反应不能自发进行。当当G0，反应能自发进行。，反应能自发进行。活化能活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自反应物全部进入活化状态所需的自由能。由能。促使化学反应进行的途径：促使化学反应进行的途径：1. 用加热或光照给反应体系提供能量。用加热或光照给反应体系提供能量。

10、2. 使用催化剂降低反应活化能。使用催化剂降低反应活化能。酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。速度加快。l活化能活化能(Activation energy)：l分子由常态转变为活化状态所需的能量。在一分子由常态转变为活化状态所需的能量。在一定温度下定温度下1mol 底物全部进入活化态所需要的底物全部进入活化态所需要的自由能。自由能。1、学说认为：、学说认为：当酶催化一化学反应时，首当酶催化一化学反应时，首先先 E和和 S结合形成中间产物结合形成中间产物 ES，然后它，然

11、后它再分解成产物再分解成产物P并释放酶并释放酶E。1）中间产物比底物需较少的活化能就可分）中间产物比底物需较少的活化能就可分解成产物并放出酶。解成产物并放出酶。2）ES 决定酶促反应速度。决定酶促反应速度。3）中间产物形成的实验依据：）中间产物形成的实验依据：1.同位素同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。A:未结合底物未结合底物B:E-S中间复合物中间复合物 S分子向分子向E活性中心靠近，且趋向活性中心靠近，且趋向E催化部位，催化部位，使活性中心这一局部区域使活性

12、中心这一局部区域S增加，并使增加，并使S分子分子发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。从而加快反应速度。从而加快反应速度。lX衍射证实：衍射证实：E使使S分子中敏感键中某分子中敏感键中某些基团的电子密度些基团的电子密度变化，产生电子张变化，产生电子张力力，使其发生变形，使其发生变形，更易于断裂。更易于断裂。酶高效的因素酶高效的因素A：S变形变形B：S和和E都变形都变形指指E分子上某分子上某些基团作为质些基团作为质子供体和质子子供体和质子受体对受体对S进行进行（广义的）酸（广义的）酸碱催化。碱催化。1、醛的水合作用2、肽的水解作用酶高效的因素酶高效的因素

13、 E分子中的亲核基团提分子中的亲核基团提供电子，对供电子，对S中亲电子中亲电子的碳原子进行攻击，的碳原子进行攻击，生成生成ES使反应活化能使反应活化能降低，降低，S可越过较低的可越过较低的能垒而形成产物。能垒而形成产物。酶高效的因素酶高效的因素二、酶原的激活二、酶原的激活没有活性的酶的前体称为没有活性的酶的前体称为酶原酶原。酶原转变成有活。酶原转变成有活性的酶的过程称为性的酶的过程称为酶原的激活酶原的激活。这个过程实质上。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。是酶活性部位形成和暴露的过程。在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织

14、细胞不被水解破坏保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。缬缬 天天 天天天天天天赖赖缬缬 甘甘组组缬缬 天天 天天天天天天赖赖甘甘 组组SS缬缬SS一：酶活力的测定：一：酶活力的测定： 1. 酶活力（酶活性酶活力（酶活性enzyme activity): ： 指酶催化一定化学反应的能力。指酶催化一定化学反应的能力。 用酶所催化的某一用酶所催化的某一化学反应速度化学反应速度的快的快慢来表示酶的含量和存在。慢来表示酶的含量和存在。酶促反应速度的测定：酶促反应速度的测定：（1）测定单位时间底物的消耗量）测定单位时间底物的消耗量（2）测定单位时间产物的生成量）测定单位时间产物的生成量（1）、酶活力单位（

15、）、酶活力单位（active unit, U，I.U）：）： 特定条件下（特定条件下（25 ），在），在1分钟内能转分钟内能转化化1微摩尔底物的酶量。微摩尔底物的酶量。（2）、酶的转换数（）、酶的转换数（katal，kat）：）： 在最适条件下（在最适条件下（30 ）,每秒钟可使每秒钟可使1mol底物转化的酶量。底物转化的酶量。 1 kat = 6107 I.U 指每指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用酶蛋白所具有的酶活力，一般用 U/ mg蛋白表示。蛋白表示。 （4）、）、用反应用反应初速度初速度（ v ） 来表示来表示：l 测单位时间内、单测单位时间内、单 位体积中底物减少位体积中底物减少

16、 或产物增加量来表示或产物增加量来表示 浓度浓度/单位时间单位时间.酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速是研究酶促反应的速度及影响此速度的各种因素的科学。度及影响此速度的各种因素的科学。1.酶浓度对酶作用的影响酶浓度对酶作用的影响 在底物足够过量，不含抑制酶活性的在底物足够过量，不含抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素物质及其他不利于酶发挥作用的因素时时 V=k E （二）酶浓度对酶作用的影响（二）酶浓度对酶作用的影响在有足够底物足够底物和其他条件不变的情况下： v = k E 本人认为不完善本人认为不完善 v0 = k E原因：原因：1.逆反应速度增加逆反应速度增加2.底物

17、底物浓度下降浓度下降3.酶会因环境因素的影响而失活酶会因环境因素的影响而失活4.产物成为酶的产物成为酶的抑制剂抑制剂SvVmax一级反应 v = k S零级反应 v = k E Michaelis & Menten根据中间产根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称物浓度与反应速度关系的公式称 。米氏方程：米氏方程：Km + SV S=根据中间产物学说：根据中间产物学说： 式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知： ES形成速度= K1 E S ES分解速度=(K2, + K3 ) ES当反应达恒稳态时,二速度相等,即: K1 E

18、S =(K2, + K3 ) ESK1K2K3整理并令：由于E 与ES之和为总的酶浓度Et ,即: Et= E + ES E = EtES将代入:ESK1= =E S (K2, + K3 )KmES=(EtES) SKm整理得:酶促反应速度由ES决定,而= K3 ES ES=将代入整理得:ES=EtSKm+SK3=EtSKm+SK3此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 Et 将代入,得米氏方程:=SKm+SVmaxa、 Km S 时时： =VS/ Km 初速度与初速度与S成正比的成正比的一级反应。一级反应。b、若若SKm 时时： =V 零级反应零级反应c、若若S = Km 时时：

19、=1/2V 酶反应速度与酶反应速度与S的关系的关系a、概念概念： 反应速度为最大反应速度一半时的底反应速度为最大反应速度一半时的底 物浓度物浓度。b、单位单位： mol/L 或或 mmol/L c、意义意义： Km是酶的特征性物理常数。是酶的特征性物理常数。 只与只与E性质有关，与性质有关，与E无关；测无关；测Km可鉴别酶。可鉴别酶。 在一定条件下某酶对某一底物有一定的在一定条件下某酶对某一底物有一定的Km值。值。 因此，测某酶的因此，测某酶的Km数值，可鉴别酶数值，可鉴别酶。同一同一E有几个有几个S就有几个就有几个Km， Km最小的为最适最小的为最适S或天然或天然S。Km大，大，E与与S亲和

20、力弱；亲和力弱； Km小，小， E与与S亲和力强亲和力强。d、实际用途：、实际用途： 1）可由所要求的）可由所要求的V求求S；例：求反应速度达最大反应速度例：求反应速度达最大反应速度99%时的底物浓时的底物浓度度 2）根据已知）根据已知S求该反应求该反应V。99%V=VSKm +S=S99Km将米氏方程两侧取倒数，以将米氏方程两侧取倒数，以1/对对1/S作图得直线作图得直线,得得Lineweaver-Burk方程：方程：Lineweaver-Burk作图法作图法（双倒数作图法）（双倒数作图法）Km求法求法: 1、量截距；、量截距； 2、量一个截距求斜率、量一个截距求斜率l在一定范围内（在一定范

21、围内（0-40） E活性随温度上升而加快；活性随温度上升而加快；l温度达到一定高度（温度达到一定高度（60 以上）以上）E活性不再增高，活性不再增高，反而下降。反而下降。酶的影响因素酶的影响因素 因因E种、种、E源不同而异。源不同而异。 (2)、温度影响酶促反应的机理：、温度影响酶促反应的机理：1）低于低于最适温度：反应最适温度：反应速度随温度上升速度随温度上升而而加快；加快；2）高于高于最适温度：最适温度：E蛋白蛋白随温度上升而变随温度上升而变性失活。性失活。酶的影响因素酶的影响因素l例例1、 蔬菜干制蔬菜干制 (霸王花、黄花菜霸王花、黄花菜) l酶促褐变条件：酚酶、酚类底物、酶促褐变条件：

22、酚酶、酚类底物、O2l例例2、 加工豆奶加工豆奶 l豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、O2l例例3、 加工绿茶加工绿茶 l工艺：鲜叶工艺：鲜叶 杀青杀青 揉捻揉捻 干燥干燥l红茶加工工艺：鲜叶红茶加工工艺：鲜叶 萎雕萎雕 揉捻揉捻 发酵发酵 干燥干燥(1)、最适、最适pH： 超出则酶活下降。超出则酶活下降。 植物、微生物：植物、微生物： 最适最适pH： 4-6.5 ； 动物动物： 最适最适pH：6.5 -8l为酶特性之一、受各种为酶特性之一、受各种因素影响。因素影响。酶的影响因素酶的影响因素1）pH影响影响E活性中心及附近有关基团的解活性中心及附近有关基团的解 离

23、离，使之，使之易易或或不易不易与与S 结合；结合；2）pH影响影响S的极性基团的极性基团，从而影响这些基，从而影响这些基 团与团与E的结合；的结合；3）过酸、过碱可）过酸、过碱可使酶变性失活使酶变性失活。酶的影响因素酶的影响因素(1)、概念、概念：凡能提高酶活力的物质称激活剂。凡能提高酶活力的物质称激活剂。 (2)、种类：、种类：1）无机离子的激活作用：）无机离子的激活作用： 作为作为活性部位的组分活性部位的组分； 作为作为辅助因子的组分辅助因子的组分； 由由无机离子无机离子与与E、S或或ES结合引起。结合引起。 如：如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+等。等。酶的影响因素酶的影响因素

24、包括还原剂（使二硫键还原）、包括还原剂（使二硫键还原）、 EDTA（去除重金属杂质）等。（去除重金属杂质）等。 激活酶原激活酶原、解除抑制剂的抑制作用解除抑制剂的抑制作用。如：如：pr与重金属离子结合，解除抑制剂的与重金属离子结合，解除抑制剂的 抑制。抑制。酶的影响因素酶的影响因素(1)、概念：、概念：l抑制剂（抑制剂（inhibitor, I ) ： 凡与凡与E结合后，使结合后，使E的活性部位结构和的活性部位结构和性质改变而引起性质改变而引起 E活性降低或丧失的物活性降低或丧失的物质，叫质，叫 。l抑制作用抑制作用(inhibition)： 任何使任何使E活性降低或丧失的作用统称为活性降低或

25、丧失的作用统称为.酶的影响因素酶的影响因素1）不可逆抑制：）不可逆抑制： 通常通常 I 以较牢固的共价键与以较牢固的共价键与E蛋白中的基蛋白中的基团结合团结合，引起，引起E失活。失活。l透析、超滤不能除去透析、超滤不能除去 I 。酶的影响因素酶的影响因素l有机磷、烷化剂：作用于有机磷、烷化剂：作用于Ser、Thr的的-OH； 如：有机磷农药、二战毒气等作用于催如：有机磷农药、二战毒气等作用于催 化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起 一系列神经中毒症状；一系列神经中毒症状； 临床用羟肟酸缓解症状。临床用羟肟酸缓解症状。常用农药常用农药:有机磷农药、有机氯农药、有机汞农药有

26、机磷农药、有机氯农药、有机汞农药抗菌素抗菌素: 酶的影响因素酶的影响因素lI与与E的结合往往是非共价键结合的结合往往是非共价键结合，是可，是可逆结合，可用透析法除去逆结合，可用透析法除去I。l可逆抑制根据可逆抑制根据I与与S的关系分三类：的关系分三类： 竞争性抑制：竞争性抑制： 非竞争性抑制：非竞争性抑制： 反竞争性抑制：反竞争性抑制：酶的影响因素酶的影响因素 I 在在分子结构上与分子结构上与S类似类似， I与与S竞争性竞争性与与E结合，使酶促反应速度下降。结合，使酶促反应速度下降。 但，若但，若S高，则此效应减小高，则此效应减小。酶的影响因素酶的影响因素 E + S S E E+P + I

27、EI特点：特点：I与与S结构类似；抑制程度取决于结构类似；抑制程度取决于 I和和S以及与以及与E的亲和力；可通过增加的亲和力；可通过增加S来减轻或解除抑制。来减轻或解除抑制。lI占了占了S的位子；的位子；l E与与I或或S结合后构结合后构象发生变化，象发生变化，l产生不利于另一个产生不利于另一个结合的构象。结合的构象。药物设计的依据。药物设计的依据。如磺胺、如磺胺、对氨基苯甲酸(PABA)对氨基苯磺酰胺lS与与I可可同时结合同时结合在在酶的不同部位上，酶的不同部位上，形成形成ESI，因此酶，因此酶活性降低。活性降低。l此类此类 I 与与E活性中活性中心以外的基团结合，心以外的基团结合，其结构可

28、能与其结构可能与S无无关。关。酶的影响因素酶的影响因素l改变酶结构和性质；改变酶结构和性质；lVmax减小；减小；l抑制取决于抑制取决于 I。非竞争抑制的通式反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成合后才能进一步形成ESI复合物。复合物。S + EESE + P + IESIE+Pv = V1 + Iki Skm1+ Iki+ SSvkmkml竞争性抑制：竞争性抑制：Vmax不变；不变；Km增大，增大， 增加增加S可克服。可克服。l非竞争性抑制：非竞争性抑制： Km 不变；不变； Vmax减小，减小， 增加增加S不可克服。不可克服。 反竞

29、争性抑制反竞争性抑制: Vmax减小减小;Km减小减小(1)、概念：、概念： 亦称亦称变构酶变构酶，是一类重，是一类重要的调节酶。要的调节酶。 一般为寡聚酶（两个以一般为寡聚酶（两个以上亚基组成），易发生构上亚基组成），易发生构象改变。其上有二个重要象改变。其上有二个重要部位：部位： 活性部位活性部位和和别构部位别构部位Asp转氨甲酰酶1）活性部位：）活性部位： 负责负责E对对S的结合与的结合与催化；催化；2）别构部位：）别构部位： 可结合调节物，负可结合调节物，负责调节酶反应速度责调节酶反应速度 。 这两部位可在不同亚基这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上或同一亚基不同部位上。1）概念：

30、）概念： 当当S或或S以外的物质与以外的物质与E的别构部位非共价的别构部位非共价 结合后，通过结合后，通过E分子构象的变化影响分子构象的变化影响E催化催化 活性的效应称活性的效应称 。 引起别构效应的物质。分两种：引起别构效应的物质。分两种：l别构激活剂别构激活剂： 正协同，加快反应速度的，多为正协同，加快反应速度的，多为S 。 如：如：ATP对对ATCase(天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶)。l别构抑制剂：别构抑制剂： 负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。 如：如：CTP对对ATCase。大多数别构酶不大多数别构酶不符合米氏方程。符合米氏方程。1

31、、非调节酶曲线、非调节酶曲线2、正协同别构酶、正协同别构酶3、负协同别构酶、负协同别构酶曲线2中S的变化所引起的速度变化的反应几乎是“全”或“无”l分离纯化分离纯化l酶的应用酶的应用（一）目的：（一）目的： 1、为了研究酶的理化性质或鉴定酶；、为了研究酶的理化性质或鉴定酶； 2、作为生化试剂或药物。、作为生化试剂或药物。（二）根据酶在体内作用的部位分：（二）根据酶在体内作用的部位分： 胞外酶、胞内酶；胞外酶、胞内酶；（三）步骤：（三）步骤： 选材选材破碎破碎抽提抽提分离纯化分离纯化保存保存酶在细胞中的分布：酶在细胞中的分布： 胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，胞外酶：水解酶类，易收集，不

32、必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。即为含酶液。 胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。用适当的缓冲溶液或水抽提。 原则：原则： 在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧

33、失活力的一切操作过程。程。尽最大可能保存酶的活力。尽最大可能保存酶的活力。分离提纯：分离提纯：1.1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。 胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。可。 胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。 2. 2.酶的纯化：酶的纯化： 纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天纯化的关键是维持酶的活性，

34、因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。整个纯化过程应维持低温。（1 1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：A A盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。B B有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。批加入。（2 2）酶的纯化方法：）酶的纯化方法：有吸附层析、离子交换层析

35、、凝胶过滤层析、亲和层析等。有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。3.3.酶的结晶：酶的结晶：纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：酶的保存：一般在一般在-20以下低温保存。以下低温保存。 注意：注意：l 低温；低温；0-5，有机溶剂在，有机溶剂在-15 -20；l 加加EDTA，防止金属离子使酶失活；，防止金属离子使酶失活；l 加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；l 不要过度搅拌。应常测酶活。不要过度搅拌。应常测酶活。 酶的应用酶的应用工业上酶应用的优点：工业上酶应用的优点：1. 专一性高，

36、副反应很少，后处理容易。专一性高，副反应很少，后处理容易。2. 催化效率高，酶用量少。催化效率高，酶用量少。3. 反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。4.酶的催化活性可以进行人工控制。酶的催化活性可以进行人工控制。缺点：缺点：1.酶易失活，酶反应的温度、酶易失活，酶反应的温度、PH、离子强度等要、离子强度等要很好控制。很好控制。2.酶不易得到，价格昂贵。酶不易得到，价格昂贵。3.酶不易保存。酶不易保存。l1 1、酶在工业中的应用不断扩大。、酶在工业中的应用不断扩大。l酶在食品工业的应用：酶在食品工业的应用： l1)1)、酿造米酒、酿造米酒

37、 浸米浸米蒸饭蒸饭拌曲拌曲装缸装缸糖化发酵糖化发酵压榨压榨成品成品l l 酒曲酒曲l2)2)、果葡糖浆酶法生产：、果葡糖浆酶法生产：l 液化酶液化酶 糖化酶糖化酶 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 l 淀粉乳淀粉乳-糊精糊精-葡萄糖葡萄糖-果葡糖浆果葡糖浆l3)3)、果汁澄清：、果汁澄清：l 果胶酶果胶酶l 果汁果汁-澄清果汁澄清果汁l酶在轻工、化工领域的应用：酶在轻工、化工领域的应用：l1)1)、蛋白酶用于皮革工业的脱毛。、蛋白酶用于皮革工业的脱毛。l2)2)、-淀粉酶、纤维素酶用了牛仔服的生产。淀粉酶、纤维素酶用了牛仔服的生产。l3)3)、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶应用于洗涤剂的生产。、碱性蛋白酶、碱

38、性脂肪酶应用于洗涤剂的生产。l2 2、酶在医学中应用、酶在医学中应用l1)1)、酶在疾病诊断中的地位越来越重要。、酶在疾病诊断中的地位越来越重要。l2)2)、酶作为治疗疾病的药物在临床上的应用不断扩大。、酶作为治疗疾病的药物在临床上的应用不断扩大。 l 某些作为药物使用的酶某些作为药物使用的酶l 酶酶 临床应用临床应用l 淀粉酶淀粉酶 治疗消化不良治疗消化不良l 菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶 治疗手术后的浮肿、炎症、伤口化脓、消化不良治疗手术后的浮肿、炎症、伤口化脓、消化不良l 尿激酶尿激酶 溶解血栓溶解血栓l 左旋糖酐酶左旋糖酐酶 预防龋齿预防龋齿l 天冬酰胺酶天冬酰胺酶 治辽癌症治辽癌症l3. 3

39、. 工具酶在生物学研究中的应用工具酶在生物学研究中的应用l 利用酶的专一性催化作用，可以进行生物大分子的分析、改造和利用酶的专一性催化作用，可以进行生物大分子的分析、改造和l生物物质的处理。用于这样目的酶称为生物物质的处理。用于这样目的酶称为-。l例如：各种例如：各种 蛋白酶蛋白酶 已用于蛋白质分子的一级结构分析。已用于蛋白质分子的一级结构分析。l DNADNA聚合酶聚合酶 已用于已用于DNADNA一级传结构分析。一级传结构分析。l 各种各种 DNADNA限制性内切酶限制性内切酶 能将地断裂能将地断裂DNADNA成为片断，这是基因工程能够实成为片断，这是基因工程能够实现的重要前提之一。现的重要

40、前提之一。l 在处理细菌细胞时，可以用在处理细菌细胞时，可以用 溶菌酶、纤维素酶溶菌酶、纤维素酶 等破碎细胞。等破碎细胞。酶工程：酶工程：指酶制剂在工业上的大规模生产指酶制剂在工业上的大规模生产和应用。和应用。1、化学酶工程：、化学酶工程： 由酶学与化学工程技术相结合而形成。由酶学与化学工程技术相结合而形成。 通过化学修饰、固定化处理、甚至化学通过化学修饰、固定化处理、甚至化学 合成法等手段改善酶的性质，以提高催合成法等手段改善酶的性质，以提高催 化效率及降低成本。化效率及降低成本。概念：概念：将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学的方法处理，使酶与载体（琼脂

41、糖、聚丙烯酰的方法处理，使酶与载体（琼脂糖、聚丙烯酰胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。应用：应用：此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使反应过程连续化、自动化，简化工艺；提高产反应过程连续化、自动化，简化工艺；提高产品质量。品质量。 此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、环境保护、生物化工等方面。环境保护、生物化工等方面。l 某些作为药物使用的酶某些作为药物使用的酶：l1)1)、重复使用、重复使用l2)2)、不污染产物、不污染产物 l3)3)、有利于连续化和自动化生产、有利于连续化和自动化生产 l4) 4) 、节约能源和设备投资、节约能源和设备投资 ：1)1)、酶经固定化后活力降低、酶经固定化后活力降低 2)2)、对、对大分子底物和气体底物不利大分子底物和气体底物不利. .l酶固定化方法：酶固定化方法： 1)1)、吸附法、吸附法 2)2)、共价偶联、共价偶联法法 3)3)、包埋法、包埋法 4)4)、交联法固定化、交联法固定化l酶的应用：酶的应用：1)1)、固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转、固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖变为果糖 l 2)2)、固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒、固定化