细胞工程第二章

1、第二章 细胞全能性第一节 培养细胞展现生命特征属性第二节 脱分化与再分化第一节 培养细胞展现生命特征属性1. 细胞全能性的概念2. 植物活细胞具有生命特征属性3. 离体培养细胞展现该物种的生命特性 一、细胞全能性(cell totipotency)的概念任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有产生完整生物个体的潜在能力，即细胞具有全能性。（一株植株，为什么有的细胞分化成芽、有的分化成根，有的分化成花芽? 某些基因表达） 细胞全能性概念随着实践的发展逐步完善。 1902年，德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性的假想。 1934年，White首次

2、定义为: 每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。 70年代，扩大了以上定义范围，认为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。 80年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。 目前细胞全能性定义为：每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。二、植物活细胞具有生命特征属性（一）、生命特征属性生命特征属性：新陈代谢、应激性、自我复制。 1. 新陈代谢：是指维持生命各种活动过程中的化学变化的总称。 生物体总是不断地从环境中摄取物

3、质和能量，来维持自身。又有同等量的能，以热或者其他形式排出体外。一旦新陈代谢停止，生命活动也就停止，生物体就会瓦解。 即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。（如动物）2. 应激性：是指生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特征。 生物体的生存离不开环境条件，而环境又是不断变化的。除四季有规律的变化外，还有些急剧变化，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生物体具有“某种机制”来感知和正确估计环境的变化，以便在体内加以校正，保证体内平衡，来应付突变的环境。如有些植物种子休眠期很长，可以避开旱、涝、冷、热等恶劣环境（如：500年前莲子发芽,沙漠绿洲）。有的植物对虫蛀有应激反应，虫蛀后，非但不减产，

4、甚至还能增产。变色龙的变色、壁虎的尾巴等。3. 自我复制：是指生物体利用自身作模板，通过代谢作用，复制出完全相同的结构，或产生也具有相同的自体繁殖能力的突变结构。 前者为“遗传”，后者为“变异”。自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一。“遗传”保证了物种的纯化，“变异”为物种的进化提供依据。 自我复制方式因繁殖方式不同而不同。无性繁殖植物通过体细胞分裂即可实现自我复制。 有性繁殖植物自我复制必须通过配子体世代和孢子体世代，即： 细胞分裂 受精卵 组织分化、器官形成减数分裂精子 性成熟 配子 卵子 合子（受精卵）（二）、细胞具有生命特征属性 生物体由细胞组成，所以细胞也具有生命特征属性。 细胞是生物

5、体结构和功能的基本单位。核酸是构成细胞的重要物质，携带着遗传信息，并具有自我复制的能力，但当单独存在时，不能表现出生命特征属性。只有组成细胞时，才能表现完整的生命活动（病毒，核酸必须与蛋白质结合）。 同一个体每一个体细胞所含的基因是相同的，但细胞结构和功能往往不同（如根细胞具有吸收水分和养分的作用；叶片具有光和、蒸腾作用等）。 所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息都表达出来。有的基因在这些细胞中表达，另一些基因在另一些细胞中表达。即，生命的全部属性在不同的细胞中分别表达。三、离体培养细胞展现该物种的生命特性 （一）、培养细胞的新陈代谢 在适宜条件下，离体细胞能够存活，则具有新陈代谢特性。如：绿

6、色细胞具有光自养能力；固氮植物细胞具有固氮特性；培养细胞具有该物种的“药物生物合成的能力” 。（二）、应激性 在适宜培养条件下，离体细胞具有应激性，表现在： 非绿色细胞应变出对培养和环境的对应方式，以异养方式生存并发展。依靠培养基供给营养来生存。 植物组织切割损伤后，应激于培养条件而出现脱分化，并在适宜的条件下再分化（芽和根）。（三）、培养细胞展现自体复制特性 脱分化 植物组织 愈伤组织（脱分化细胞） 再分化 植株 脱分化 细胞、原生质体 再分化愈伤组织 植株 细胞分裂再分化原生质体融合愈伤组织 植株细胞分裂以及植株再生展现了 培养细胞自体复制的特征属性。 第二节 脱分化与再分化 脱分化（de

7、differentiation） ：具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程称为脱分化。（如根、茎、叶） 再分化(redifferentiation) ：是指离体培养物可以由脱分化状态再度分化。包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。细胞全能性的表达是通过脱分化和再分化实现的，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是最终体现。 1. 外植体脱分化2. 愈伤组织的生长3. 细胞分化和组织分化4. 器官分化和植株形成5. 体细胞胚胎发生一、外植体脱分化外植体：植物组织培养中，把由活性植物上切取下来进行培养的那部分组织或器官叫做外植体。如茎段、根段、叶柄段、叶

8、片、花药、花粉、幼胚等。脱分化是在启动分裂的过程中完成的，静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的标志。 （一）、诱导期间的细胞生物学变化 植物组织从母体上切割下来后，会发生一系列细胞学及生物化学方面的变化。 静止细胞：细胞核较小，核位于边缘，中央有大的液泡，核糖体密度较低，多聚核糖体数目较少，质体分为叶绿体、杂色体、白色体和淀粉体。 1）.细胞结构变化：泡质变浓，大液泡消失，核体积增加并移位至中央，细胞器增加，染色体的凝集，线粒体外形及数量改变等等。泡质变浓，和蛋白体的出现被认为是细胞开始脱分化的标志。 。 2）.代谢及生化变化：气体交换率增加，核糖体出现，RNA积累，DNA合成，有关酶的增加

9、等。脱分化过程被认为可分为3个阶段：启动阶段，表现为泡质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；演变阶段，核向中央移动，质体变成原质体；脱分化终结期，回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。（二）、与脱分化有关的因子及其作用 任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，即细胞具有全能性。这种植物所具有的全能性只是一种可能性，要使这种可能性成为现实性，即使植物细胞、组织或器官离体后，经脱分化，形成愈伤组织并再生植株，必须满足两个主要条件：一是离体损伤刺激；二是营养物质及激素的刺激。除此外，培养温度、光照等对脱分化也有影响。1. 离体损伤刺激 要使植物组织

10、或细胞经脱分化再生植株，必须从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，即处于离体条件 (正常植株叶片上不会再长植株或愈伤组织)。离体损伤刺激是细胞脱分化的重要条件之一。 损伤刺激会使细胞呼吸速度增大，称为“损伤呼吸”，酶的活性增加，代谢物含量变化。2生长调节物质的影响 细胞离体后，以异养方式生存，所以必须给与营养物质（培养基）。另外，还必须给与激素刺激，以打破抑制力，恢复细胞分裂。 抑制假说认为：静止细胞仍然保存着在分生组织状态时的那种细胞分裂潜能，只不过存在一种抑制物质或抑制力，使细胞分裂能力不能表现。如果去除这种抑制，细胞就恢复到分裂状态。 这种抑制剂的作用原理及作用位点尚不清楚，但其抑制效

11、应可能会在生长调节物质（激素）的作用下而失掉，从而使细胞恢复分裂能力，实现脱分化。 不同植物细胞内，抑制剂的质和量可能是不同的。因此，在组织培养中，往往因植物不同，培养基中添加激素的种类和浓度以及配比也不同。3光照和温度的影响 各种植物对光照和温度的要求不同。有的植物需要在黑暗条件下诱导愈伤组织；但也有的植物在光照条件下诱导愈伤组织，其植株再生率更高。 对温度的要求，往往耐高温植物或起源热带植物，所需培养温度较高（如甘薯）；而耐低温植物，培养温度较低。一般植物培养温度在25左右。4培养细胞的异质性 在组织培养中，往往某一部分细胞能脱分化，而其它细胞则不能，表现为异质性。培养32h的烟草叶片外植

12、体切口部位的半薄切片多数栅栏细胞已经完成第一次分裂，形成两个子细胞P 栅栏细胞；E 表皮细胞叶肉细胞脱分化第一次有丝分裂过程1-6 栅栏细胞；7-12 海绵细胞由烟草栅栏细胞发育而成的分生细胞团烟草愈伤组织（黑暗培养）二、愈伤组织的生长 经脱分化 导致 细胞具备了分裂能力 结果细胞不断增殖愈伤组织的生长 愈伤组织的生长并非一致进行，待细胞分裂到一定时期，便会停止分裂。但如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养，可维持其活跃生长。利用此特点，进行继代培养，可大量增殖。 也有例外，有的情况下，组织细胞经脱分化后，不形成愈伤组织，而是从脱分化的细胞上直接再分化器官。先形成愈伤组织，再

13、从其上再生植株先形成愈伤组织，再从其上再生植株脱分化细胞直接再生三、细胞分化和组织分化 （一）、细胞分化及其影响因素 细胞分裂分化成什么样的细胞，是拟分生组织细胞，还是维管组织细胞，或是其它细胞?影响细胞分化的因素： 1. 生长调节剂（激素）。培养基中添加生长素、细胞分裂素等的种类、浓度及配比。2. 培养基种类（营养成分）。3. 糖类物质。例如培养基中添加蔗糖浓度，过低、过高都不利，一般在2.5%3%比较适宜。4. 其它理化因子。如光照时间、光照强度、培养温度、培养基pH值等。 （二）、组织分化 在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织。其中，拟分生组织和维管组织是两种重要的组织。是形成不

14、定芽和不定根的基础。 拟分生组织：是指培养物中出现的类似分生组织的细胞群，它是脱分化后的培养物发生一系列细胞分裂而产生的一团小型、薄壁、液泡小的细胞组织。也叫做生长中心或分生组织结节。 拟分生组织可以从一个细胞或几个细胞形成，可以起源于愈伤组织的表面，也可以起源于组织内部。 在拟分生组织形成的同时或稍后，愈伤组织中会分化出维管组织结节。 维管组织结节：是指一个区域的愈伤组织转化为韧皮分子和木质分子的混合结构（类似形成层）。 这种形成层状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成芽原基或根原基。 四、器官分化和植株形成 脱分化组织（细胞）形成愈伤组织细胞分化组织分化（拟分生组织和维管组织节结）器官分化

15、（芽和根）植株形成 （一）、器官分化 器官分化主要指根和芽的分化。是否能够发生器官分化，与前培养有关，如脱分化、细胞分化、组织分化等。有了前边这些分化才会有器官分化。（二）、完整植株的形成植株再生途径外植体脱分化愈伤组织或脱分化细胞完整植株体细胞胚不定器官 到底通过哪个途径再生，取决于培养材料和培养基，尤其培养基中添加激素的种类、浓度及配比。 除上述之外，还有两种情况，不经脱分化而直接长成植株： 直接伸长茎尖培养（较大时）完整植株 发育幼胚培养（较大时）完整植株体细胞胚（Somatic embryo）的发生来源 1外植体细胞经脱分化后直接产生体胚 似种子胚发育过程。首先脱分化细胞经不等分裂，产生一个胚柄细胞和一个胚细胞，前者发育为类似胚柄，后者进一步分裂发育为球状胚 心形胚 鱼雷胚 子叶胚 成熟胚。五、体细胞胚胎发生石龙芮试管植株茎表皮产生的胚状体葡萄叶片外植体产生的胚状体A 成熟胚状体；b,c 再生植株2由胚性愈伤组织产生胚状体 胚性愈伤组织的表面是高度分生组织化的细胞团，其表面可以产生大量的胚状体。 一般培养过程：胚性愈伤组织诱导培养基 体细胞胚诱导培养基 体细胞胚发芽培养基 但也有的情况下，在胚性愈伤组织培养基上可以直接形成