PCR技术原理.

1、圈字的单链线团样结构的过程。一-在某些理化因素作用下，DNA扌子内碱基对之间的氢键断裂，使删隋序的双螺旋结构变为不规则(二Jll|y：T二v jJrr/m.srrjperEJL_八我测WL鯉融IMSk I I f I MKl HBusy( (KMHtoMJ r I I A I j I 1，M/ I “ I | f IwfI力I7 d J ) )JMI * i i |“：/ VJMH|Wk厂-J JW | v二.M=*i厂-$ (D260增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收 增加的现象。E三出耒洱舍WA的复性( (renaturation)：儼竝 a 性DNA的两条 国癬可再恢复成天然的双

2、螺旋结过程。夢热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 三稚，此过程称为( (annealing)。LJ肪变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。1常用的变性方法：1热变性; 酸碱变性化学试剂变性220240260280DNA紫外_ _识别帜-5 小卿磁m就乘珈歸涸.-vjTBBBL_ -. ：5j2_$m芮子冋手-兀即河于J 3门渋良fT 世k:-拦谯u *. tfTm值的估算Z 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5C+16.61gM+0.41 (G+C) %-500/n-0.61 X(甲酰胺)PCR技术总论聚合酶链反应(Polymerase Chain Rea

3、ction)简称龍駆竈驛间内大量扩增持定的DNA聚合酶链式:反应也可以为作一项极只車啖的IW促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引翔定向酶促扩增法，岸基因扩增技术的次重人革新，它 町将*及微廣的靶DNA特并地扩增上口万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki(1985)和Mullis (1986)两家研究室分别用衣进的Kleppe法获得了人量染色体DNA单拷贝基【人。为时的PCR技术晰每次变件和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合嗨。1988年，由丁在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合略这是从永生栖热歯(Thermusaquat

4、icus)申餵収的耐热DNA聚合醸，简称Taq DNA聚介卿。多次循环后的Taq DNA聚介嗨仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的丿j段的酶促合成，使反应产物按指数增氏，所以命名为聚合酶Poglcn toDe ccpiedPCR原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR基本原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反W)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法它包扌舌三个基本步骤：(1)变性(Denature)：! I的双链DNA片段在94C K解谨；退火(Anne

5、al):两种 寡核昔酸引物在适当温度(50C左右)下与模板I的R的序列通过氢键 配对; 延伸(Extension): DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复 循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)o到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。3 5Heat denaturationnS3Cycle #2Cycle #3

6、l(Cycle NumberPCR product重复周期专躊列复制目标序附着引物; 加熬酶i周期周期周期周期1234周期周期56PCR 反应曲线1.0 n-Cycle 510 15 2025 30 450.8-doudosdjonu0.6-0.4-10 203040标准的PCR反应体系 10 X扩增缓冲液lOul4种d NTP混合物各200umol/L引物10lOOpmol模板DNA0 12ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至lOOulPCR反应五要素引物(primer)酶(Taq DNA polymerase) dNTP (dA TP,dGTP,dCTP

7、,dTTP)模板(template) Mg2+(magnesium)引肠引物是PCR特异性反应的关键 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核昔酸链做 弓I物，用PCR就可将模板DNA在体外大 量扩增引畅设计的点则（一丿1引物长度：15-30bp,常用为20mer左右-引物的有效长度不能大于38 mer,否则最适延伸 温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74C）,不能保证PCR扩增产物的特异性2引物扩增跨度：以500bp为宜-特定条件下可扩增长至10kb的片段3引物碱基：G+C含量以40-60%为宜-G+C太少扩增效

8、果不佳，G+C过多易出现非特异 条带-ATGC最好随机分布， 避免5个以上的嚓吟或唏喘 核昔酸的成串排列引肠没计的虑则二丿4避免引物内部出现二级结构-避免两条引物间互补，特别是3,端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带5引物3,端的碱基要求严格配对-特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败6引物中有或能加上合适的酶切位点-被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处引肠段计的斥则（三丿7引物的特异性：-引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性8引物量：-每条引物的浓度0 1 lumol或10 100 pmol,以最低引

9、物量产生所需要的结果为好-引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会引杨很计的虑则 RT-PCR引物设计特别注意:-跨越两个外显子酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应-天然酶：从栖热水生杆菌中提纯-基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的PCR反应约需酶量2 5U（指总 反应体积为100 U1时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少dNTP的质量与戒盛 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切 关系-dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活-dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以IMNaOH或IM Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.

10、07.5,小量分装，-20 C冰冻保存。多次冻融 会使dNTP降解-在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L,尤其 是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或 偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量-dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低僕板（粒基因，target geneJ模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否 的关键环节之一传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本-SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白 质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞 申的核蚩白，SDS还能与蚩白质结

11、合帚沉浇-蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合 的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质 和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸模板（枪基因，target geneJ提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 一般临床检测标本，可釆用快速简便的方法 溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的 蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增 RNA模板提取一般采用异硫氤酸孤或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAM0+戒度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影 响在一般的PCR反应中， 各种NTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜 M0浓度过高，反应特异性降低

12、，出现非特 异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶 的活性，使反应产物减少PGR反应金诈的遑播 PCR反应条件:-温度-时间-循环次数温度与肘间的设置：设置变性退火延伸三个温度点标准反应中釆用三温度点法，双链DNA在9095C变性， 再迅速冷却至4060C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至7075C,在TaqDNA聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时） 可釆用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一,一般釆用94C变性，65C左右退火 与延伸（D变性汉度与对间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因 一般93C94Clmin足以使

13、模板DNA变性 -若低于939则需延长时间-但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全 变性，就会导致PCR失败退大（复性）温度与对间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40C60C,可使引 物和模板发生结合。由于模板DNA比引物 复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会 远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基 组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核昔酸，G+C含量约50%的引物，55 C为选择最适退火温度的起点较为理想引肠的复性溟度通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4 (G

14、+C) +2 (A+T)复性温度二丁1值( (510C)-在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060sec,足以使引物与 模板之间完全结合延伸温度与肘间： Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 C 150核昔酸/S/酶分子70 C 60核昔酸/S/酶分子55 C 24核昔酸/S/酶分子高于90 C时，DNA合成几乎不能进行延伸汉度与对间：延伸温度：一般选择在7075 C之间-常用温度为72C过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定-1Kb以内的DNA片段，延伸时间lmin（足

15、够）- 34kb的靶序列需34min-扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次救循环次数-决定PCR扩增程度循环次数-主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在3040次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之 增多PCR反应特支特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低特异性强关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱 基配对原则的合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温 性，使反应中模板与引物的结合（复性）可 以在较高的温度下进行，结合的特异性大大 增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高 的正确度。再通

16、过选择特异性和保守性高的 靶基因区，其特异性程度就更高PCR反应的特异性决走因素引物与模板 DNADNA 特异正确的结合；碱基配对原则； TaqTaq DNADNA 聚合酶合成反应的忠实性;靶基因的特异性与保守性 PCR产物的生成量是以指数方式增加 的，能将皮克（pg=1012）量级的起始待 测模板扩增到微克（Ug=10-6）水平从100万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）在细菌学中最小检出率为3个细菌简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一 次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性退火延伸反应，一般 在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用 电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污 染、易推广对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增 模板可直接用临床标本如血液、体腔液、 洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制 的DNA扩增检测热启动PCRTouch-down PCR RT-PCR兼并引賜PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR虑住PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫*PCR (immuno PCR) MSP甲基化特异PCRPCR的类型1)不对称PCR目的：