HPLC原理和应用

1、 高效液相色谱（高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是）是20世纪世纪60年代末年代末发展起来的一种新型微量分离分析技术。发展起来的一种新型微量分离分析技术。 高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，因而具备速泵、高效固定相和高灵敏检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。第一节第一节 概述概述主要区别：固定相差别，输液设

2、备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1 1经典经典LCLC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 常压输送流动相，分析周期长常压输送流动相，分析周期长 柱内径柱内径13cm13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 100m 且不均匀且不均匀 柱效低（柱效低（HH，nn） 无法在线检测无法在线检测2HPLC：分离和分析：分离和分析 高压（高压（1.47-2.941014 Pa）输送流动相，分析）输送流动相，分析时间大大缩短时间大大缩短 柱内径柱内径28mm，固定相粒径，固定相粒径20 m，多采用干法填充；，多采用干法填充； 填料颗粒填料颗粒 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙

3、醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二二氧六环氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化二硫化碳碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用）尽量使用高纯度试剂高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相）避免流动相与固定相发生作用发生作用而使柱效下降或损坏而使柱效下降或损坏柱子，如使固定液溶解流失；

4、酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子，如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有）试样在流动相中应有适宜的溶解度适宜的溶解度，防止产生沉，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）使用二元体系流动相时，应该注意）使用二元体系流动相时，应该注意两种溶剂能否两种溶剂能否互溶互溶。（5）流动相同时还应满足）流动相同时还应满足检测器的要求检测器的要求。当使用紫外。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。溶剂溶剂紫外截止波长紫外截止波长/nm正己烷正己烷190二硫化碳二硫化碳380四氯化碳四氯化碳265苯苯210氯仿氯仿245二氯甲烷二氯

5、甲烷233四氢呋喃四氢呋喃212丙酮丙酮330乙腈乙腈190甲醇甲醇205水水187流动相在使用前应该过滤、脱气！流动相在使用前应该过滤、脱气！除了在分析前利用真空或超声波脱气之外，除了在分析前利用真空或超声波脱气之外，可以使用在线脱气。可以使用在线脱气。三、进样三、进样定量环规格：定量环规格：2ul、5ul、10ul、20ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul、2000ul、5000ul。蛋白的上样量取决于检测器的灵敏度蛋白的上样量取决于检测器的灵敏度Effect of Sample Load on Protein Peak Shape and Resolution

6、手柄位进样手柄位进样( (LoadLoad) )位置时，样品经微量进样针从进样孔注位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样将手柄转动至进样( (InjectInject) )位置时，阀与液相流路接通，位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。进行分析。Load Inject手柄处于手柄处于LoadLoad和和InjectInject之间时，由于暂时堵住了流路，之间时，由于暂时堵住了流路，流路中流路

7、中压力骤增压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途不能停留在中途。在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽出流动相，将流路中的空气驱赶干净。的排空阀，抽出流动相，将流路中的空气驱赶干净。在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。 避免气泡的产生避免气泡的产生：HPLC有等度洗脱有等度洗脱(isocratic elution)和梯度洗脱和梯度洗脱(gradient elution)两种方

8、式。两种方式。等度洗脱等度洗脱是在同一分析周期内流动相是在同一分析周期内流动相组成保持恒定组成保持恒定，适合，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。于组分数目较少，性质差别不大的样品。四、洗脱四、洗脱等度洗脱缺点等度洗脱缺点梯度洗脱梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常

9、常引起基线漂移和降低重现性。提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱洗脱曲线曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：要注意溶剂的要注意溶剂的互溶性互溶性，不相

10、混溶的溶剂不能用作梯度洗，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。使用磷酸盐时需特别小心。梯度洗脱所用的溶剂梯度洗脱所用的溶剂纯度纯度要求更高，以保证良好的重现要求更高，以保证良好的重现性。性。进行样品分析前必须进行进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后

11、会被强溶剂洗峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气彻底脱气，以防止混合时产生气泡。，以防止混合时产生气泡。混合溶剂的混合溶剂的粘度粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现出现压力的变化压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输

12、液泵或色谱柱能承受的最大压力。能承受的最大压力。流速流速选择合适的流速对于维持一定柱压，保证层析峰的峰形以选择合适的流速对于维持一定柱压，保证层析峰的峰形以及洗脱时间都有一定影响，流速控制可参考下表及洗脱时间都有一定影响，流速控制可参考下表 210004.6d =对于内径不同的层对于内径不同的层析柱，其合适的流析柱，其合适的流速计算公式速计算公式在对未知样进行洗脱时，可以选择如下方式以了解样品的在对未知样进行洗脱时，可以选择如下方式以了解样品的疏水性：疏水性：在在0B的流动相中，疏水性强的的流动相中，疏水性强的C18烷基链容易贴在固定烷基链容易贴在固定相载体颗粒的表面，从而降低与样品的结合。相

13、载体颗粒的表面，从而降低与样品的结合。因此一般开始时选用因此一般开始时选用2-5B的流动相洗脱。的流动相洗脱。洗脱条件的优化洗脱条件的优化洗脱梯度洗脱梯度洗脱时间洗脱时间柱平衡柱平衡洗脱时间依照柱长、流动相性质的不同而变化。洗脱时间依照柱长、流动相性质的不同而变化。每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复恢复到初始状态到初始状态。需让。需让1030倍柱容积的初始流动相流经色谱倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，使用前仔细

14、阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如如pHpH值范围、流动相类型等。值范围、流动相类型等。2、选择使用适宜的、选择使用适宜的流动相流动相（尤其是（尤其是pH），以避免固定相），以避免固定相被破坏。被破坏。3、应、应逐渐改变逐渐改变溶剂的组成溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。4、当采用、当采用盐缓冲溶液盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与

15、之接触。会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。5、避免将、避免将基质复杂基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行需要对样品进行预处理预处理或者在进样器和色谱柱之间连接或者在进样器和色谱柱之间连接一一保护柱保护柱。6、一般说来色谱柱、一般说来色谱柱不能反冲不能反冲，只有生产者指明该柱可以反，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。速降低柱效。7、保存色谱柱保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干

16、燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。过夜或更长时间。8、色谱柱使用过程中，避免柱压过高。如果、色谱柱使用过程中，避免柱压过高。如果压力升高压力升高，一，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染。染。 9、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 使用过程中注意轻拿轻放。使用过程中注意轻拿轻放。典型窗口元素（运行样品）典型窗口元素（运行样品）第六节第六节 高效液相色谱的应用高效液相色谱的应用环境保护环境保护农业农业医药医药生化研究生化研究食品质量食品质量http:/www.forumsci.co.il/HPLC/topics.htmlTopics in Liquid Chromatographyhttp:/ of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications思考题思考题1、高效液相色谱与常规液相色谱相比为什么有很高的分、高效液相色谱与常规液相色谱相比为什么