重医大级硕士研究生蛋白质组学试题附答案

1、重庆医科大学2011级硕士研究生蛋白质组学试题姓名 魏俊 学号：2011120028 所在大班：蛋白质组学5班专业： 在职医学影像 一、解释（共15分）1、MALDI TOF MS（10分）答：即基质辅助激光解析离子化/飞行时间质谱，为近年来快速发展的一种新型软电离生物质谱，该仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。基质辅助激光解吸离子化是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。该方法特别适用于对热敏感化合物或不挥发化合物的离子化。飞行时间质量分析器的离子分离是用非磁

2、方式达到，离子在离子源中形成后被电场加速，进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离。先后到达检测器产生信号。按照仪器构造不同，又可分为线性飞行时间质量分析器和反射飞行时间分析器。基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱谱图中的主要信号是完整的分子离子峰，因此单电荷分子离子峰占主要地位，随着分析量增加，双电荷离子相对丰度增加，并出现多电荷离子。MALDI-TOF-MS的中心技术：依据样品的质荷比（m/z）的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。近年来已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技

3、术之一，用于检测和坚定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、高聚物以及多种合成聚合物的强有力的工具。2、免疫共沉淀（5分）Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。二、 问答题（共85

4、分）1、Western Blotting 的流程（10分）。Western Blotting实验流程第一步：蛋白样品制备        蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。        RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lys

5、is Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。 第二步：蛋白定量        为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。 

6、第三步：电泳(1) SDS-PAGE凝胶配制        沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）； PMSF(100mM)（WB0016） ；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。 (2) 样

7、品处理        每80L样品加入20L的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。置于100的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。(3) 上样与电泳 第四步：转膜        转膜缓冲液可以参考分子克隆自行配制。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。    &

8、#160;   转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用沃尔森的丽春红染色液（WB0008，WB0009）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，并用铅笔在膜上做出适当标记。还可以用沃尔森的蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒（WB0010）对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 第五步：封闭        丽春红染色后可用铅笔在膜上做出适当标记，然后用预先准备好的WB洗涤液（WB0011）漂洗35min，将膜上的红色洗去。（注意

9、：以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）弃去洗液后，加入10%的脱脂奶粉（建议使用：完达山脱脂奶粉；奶粉可用WB洗涤液溶解），在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。如背景较高，可以在4 封闭过夜。 第六步：孵育1一抗孵育        参考一抗的说明书，按比例稀释一抗。在室温下孵育2小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。2二抗孵育        参考二抗的说明书，按比例稀释二抗。在

10、室温下孵育1小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。 第七步：显色        建议选用Pierce公司生产的ECL发光液。 第八步：显影        ECL发光液处理过的膜，用保鲜袋包裹后，与X光片一起置于暗合中。根据荧光的强弱进行适当时间的曝光，取出X光片置于显影液，定影液中显影（WB0012）。 2、血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题（10分）。1、血浆/血清样品选择去血小板的血

11、浆由于避免血小板的激活作用，减少了蛋白质的体外降解，因而较血清更适合一定的肽组学研究；去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品，更适合分析低分子质量的蛋白质；如果要使用一定的蛋白酶抑制剂，一定要在早期加入，而且要谨慎使用，因为抑制剂的加入可能对MS分析造成一定的干扰，而且一些小分子的抑制剂与蛋白质结合转化成蛋白质的亚型，这些都将使得分析结果变得复杂。2、样品的收集与贮存为减少血小板的污染，血液样品在分析前最好用0.2m的低蛋白质结合膜过滤，样品分装冰冻储存，减少融化-再冰冻的循环；样品应分装并贮存在液氮中，减少或不加蛋白酶抑制剂，以减少对测定结果的干扰。3、去除高丰度蛋白和分级技术血浆/血清样品

12、中蛋白质种类很多，而且所含蛋白质具有较大的动力学范围，其中有许多丰度较高但不含有特殊生物学信息的蛋白质，这将会对目标蛋白质的分析造成极大的困难，甚至根本不能检测低丰度蛋白质，因此，通过对原始蛋白质进行洗脱和分步分离减少样品中蛋白质的复杂性，可以极大简化蛋白质的预测和分析，提高对低丰度蛋白质的检测和识别的灵敏度和准确度。4、多维策略的运用鸟枪测序法(Shotgun sequencing)，即高丰度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱 + 反相色谱)分离 + 质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)3、药物蛋白质组学定义及主要研究领域。试举例说明其在药物靶点的发现和确认

13、中的应用（10分）。药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。药物蛋白质组学的主要研究领域：临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。药物作用靶点的发现和确认：阐明药物的作用机制；药物毒理作用机制。耐药性及个体化治疗的研究；中药现代化中的研究应用药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用举例：（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp

14、27。（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质falcipain 1；从数据库筛选到falcipain 1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。4、结构蛋白质组学与功能蛋白质组学的研究方法和内容的差异，以及在临床研究和应用上的特点与作用（10分）。结构蛋白质组学又称

15、组成蛋白质组学，这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。* SWISS-PROT（1986）是专门的、含高度处理的七万多个蛋白质序列的数据库*另一相关数据库TrEMBL：含有从EMBL数据库内的核苷酸序列自动翻译过来的蛋白质序列 蛋白质组学对复杂混合物的分析是在数据库及匹配工具帮助下进行部分序列测定，非通过完整序列测定来实现鉴定射线晶体学和核磁共振光谱学加强了蛋白质三维结构的研究，同时也产生structural proteomics*“Protein D

16、ata Bank”是第一个蛋白质结构数据库，包含一万多个结构* 结构蛋白质组学技术的发展：主要集中在增加结构测定的通量和启动整个蛋白质组结构分析系统计划功能蛋白质组学指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的全部蛋白质，即与某一功能相关的蛋白质，是总蛋白质组的一部分。例如： 与某一生理现象或病理过程相关的所有蛋白质（比如炎症、肿瘤等）。它从局部入手，研究蛋白质组的各个功能亚群体，将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命、细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。界于对个别蛋白质的传统研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间。既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生

17、物大分子(蛋白质、基因)水平）到细胞水平研究的重要桥梁环节 。是一个相对较新的领域，涉及蛋白质相互作用、生物化学功能、细胞功能和系统功能等的研究 研究方法蛋白质芯片、噬菌体展示技术、酵母双杂交。5、蛋白质组学在心血管基础和临床研究中的目的和意义（10分）。从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征(ACS)；蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。6、目前的蛋白质组学技术在

18、医学研究中的优势和不足（10分）。答：蛋白质组学在疾病的研究中占有十分重要的地位，旨在运用蛋白质组学的研究手段，通过比较正常和病理情况下细胞、组织或体液中蛋白质在组成成分、表达水平、表达位置和修饰状态上的差异，寻找疾病诊断和预后的特异性蛋白质，包括特异性抗原及相关抗原、受体、酶等，以及药物治疗的靶标等。通过对疾病相关功能蛋白质进行定性、定量和表征研究，深入了解这些蛋白质的结构和功能，揭示疾病过程中细胞内全部蛋白质的活动规律，为疾病发生、发展机制的阐明和早期诊断及治疗提供理论依据和解决途径。蛋白质组学(proteomics)主要内容是以系统生物学的思路构建蛋白质组学技术策略与各种功能基因组学技术

19、、临床试验诊断与治疗技术相结合的全新技术平台、在疾病的预防、早期诊断和治疗等方面推进基础医学与临床医学的结合，以期在人类重要疾病的预防方面取得重大突破。由于临床蛋白质促学具有广阔的应用前景而备受临床医疗机构、科研机构和药品研究与发展部门的高度关注。特别是临床蛋白质组研究计划，NIH医学研究指南以及HUPO三个国际合作项目的启动与实施，极大地推动临床蛋白质组学研究工作的快速发展，其研究对象是直接来自临床医学实践的实验样本材料。（1）临床蛋白质组学是将蛋白质组学技术应用于临床医学研究，它主要围绕疾病的预防、早期诊断和治疗等方面开展研究，其中恶性肿瘤是临床蛋白质组学研究的一个重点研究对象。由于肿瘤生

20、物标志物对早期诊断具有重要价值，所以临床蛋白质组学的主要目标之一是寻找合适的肿瘤生物标志物，多分子生物标志物已成为寻找肿瘤生物标志物的一个研究趋势。（2）临床蛋白质组学是蛋白质组学新近出现的一个分支学科，它侧重蛋白质组学技术在临床医学领域的应用研究，并围绕着疾病的预防、早期诊断和治疗等方面开展研究；主要包括以下几个方面： 疾病动物模型的蛋白质组学研究、 寻找疾病的生物标志物和药物治疗靶点开发。总之，蛋白质组学在疾病的研究中占有极重要的地位，该研究旨在运用蛋白质组学的研究手段，通过比较正常和病理情况下细胞、组织或体液中蛋白质在组成成分、表达水平、表达位置和修饰状态上的差异，寻找疾病诊断和预后的特

21、异性蛋白质，包括特异性抗原及相关抗原、受体、酶以及药物治疗的靶标等。通过对疾病相关功能蛋白质进行定性、定量和表征研究，深入了解这些蛋白质的结构和功能，揭示疾病过程中细胞内全部蛋白质的运动活动规律，为疾病发生、发展机制机理的阐明和早期诊断及治疗提供理论依据和解决途径。由于蛋白质组是一个动态、变化的整体，生物体内的蛋白质不能像核酸一样通过PCR扩增来增加样品量，因此其复杂性远远大于基因组。尽管双向凝胶电泳在蛋白质组研究中已被广泛应用，但这种方法还存在局限性。首先，虽然固相化PH梯度等电聚焦电泳技术的出现已使双向凝胶电泳的重复性得到改善，但重复性仍然是双向凝胶电泳方法存在的主要问题。同样的操作人员，

22、同样的样品，同样的仪器，几次操作，所得到的双向凝胶电泳图谱很难一模一样；其次，双向凝胶电泳分析时部分蛋白质的丢失，特别是疏水性蛋白质和相对分子质量大于10×103蛋白质的丢失，使得双向凝胶电泳作为通用的蛋白质分离展示方法有一定局限性。对于一些低丰度蛋白和极端PI值的蛋白不能很好分离; 再次，通过双向凝胶电泳分离的蛋白点不一定只代表一种蛋白.双向电泳的通量、灵敏度和规模化均有待于进一步加强。二维凝胶电泳有分离容量的先天限制，染色转移等环节操作困难费时，低峰度蛋白难以辨别，和质谱技术的连用已成为瓶颈。因此，国际上开始重视研究以色谱电泳质谱为主的技术平台。另一方面，酵母双杂交技术虽已经被用

23、于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统，但仍缺乏快速、高校的手段获取复杂蛋白质相互作用的多维信息。蛋白质的生物信息学研究虽已有应用，但仍困难重重。蛋白质是机体生理、病理活动功能的直接执行者，对于它的性质和数量变化的精确把握是揭示机体生理变化和疾病病因、发病机制的重要切入点。与传统的单一蛋白质研究方法相比，组学技术可大大提高诊断的敏感性和特异性，蛋白质组学的这一技术特点无疑在医学研究中具有不可替代的优势，它可以跟踪机体最细微的生理病理变化，通过对疾病特异性蛋白质的寻找，使疾病的早期诊断成为可能。蛋白质组学技术为正常生理研究、疾病诊断，尤其是早期诊断方面提供了广阔的技术平台，在指导治疗和判断预后等

24、方面具有巨大发挥空间。蛋白质组学技术在医学研究中的优势体现在各个领域、各个方面，例如，神经生理学方面，由于大脑高度复杂的结构和功能，传统研究方法已难以适应亟待发展的科研及临床需求，而蛋白质组学的出现给神经科学研究带来新的动力；肿瘤的早期诊断及预后判断是目前蛋白质组学研究中涉及最多的领域，应用蛋白质组学技术，有可能发现肿瘤相关的特异性蛋白质，这些蛋白质既可作为肿瘤诊断的分子标记，又可作为治疗和药物开发的靶点；另外，心脑血管系统功能变化来自于心肌和血管系统蛋白质的变化，这些变化也许可以通过联合使用一系列蛋白质组学方法来证实。但蛋白质组学在临床应用的研究尚处于起步阶段，还存在许多不足。例如，临床样本

25、都是各种细胞或组织混杂，状态不一，病变组织与正常组织的差异比较，往往是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型；质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术，对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标，但一般的质谱技术却难以将三者合一；双向凝胶电泳是分离蛋白质的有效手段，但做过的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。然而蛋白质组学在技术层面不断有新的进步，激光捕获显微解剖(LCM) 、双向凝胶电泳质谱等新技术的发展使蛋白质组学技术不断得到完善。现阶段，蛋白质组学研究方法具有多技术并存、各有优势和局限的特点，难以像基因

26、组研究一样形成比较一致的方法，除了发展新方法，更强调各种方法的整合和互补。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源。7、鼻咽癌蛋白质组学研究的内容和成果（10分）。1）NPC相关蛋白质及标志物筛选（1）NPC及正常鼻咽上皮（NP）的蛋白质表达谱 肿瘤蛋白质组表达谱及其蛋白质组数据库，是深入开展肿瘤蛋白质组相关研究的基础。 通过NPC蛋白质表达谱的研究工作建立了NPC细胞系、LCM来源的NPC和正常鼻咽上皮细胞的2DE参考图谱，构建了首个鼻咽癌2DE数据库， NPC与NP的差异表达谱（2）NPC与NP的比较蛋白质组学研究肿瘤细胞与其起源的正常细胞的比较

27、蛋白质组学研究是发现肿瘤标志物和治疗靶标的最直接和合理的方式之一 采用组织样本进行蛋白质组学研究的主要障碍是组织的异质性 如：NPC 组织中常含大量的浸润性淋巴细胞和其它间质细胞为提高肿瘤标志物筛选的准确性，有必要从组织中纯化靶细胞用于蛋白质组学研究 * NPC血清蛋白质组学寻找NPC的特异抗原 通过对差异蛋白质stathmin、14-3-3和annexin I的临床病理意义的研究，发现： *它们的表达与NPC转移、分化或预后相关，有望成为鉴别NPC分化程度、预测NPC转移和预后的分子标志物，具有潜在的临床应用价值和开发价值2）NPC发生发展机制的研究（1）NPC不同阶段和分化程度的蛋白质组学

28、研究肿瘤分化过程中蛋白质组动态变化规律的研究对于肿瘤诊断和治疗具有十分重要意义。近年，以福尔马林固定-石蜡包埋（formalin fixed paraffin embedded，FFPE）组织为研究对象的蛋白质组学打破了以新鲜组织标本为研究对象的传统模式，其优势是丰富的标本库存和完善的临床资料（2）肿瘤间质细胞的蛋白质组学研究近年，肿瘤与肿瘤微环境中的间质之间的相互作用对肿瘤的发生发展所起的支持与促进作用受到越来越多的关注。采用定量蛋白质组学技术 对纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽间质进行研究和比较，6-10B不表达Periostin，转移潜能低，即差异蛋白Periostin，* 在NPC间质高表达

29、，* 它通过与Integrin V5结合，来促进肿瘤细胞的侵袭和转移，表明肿瘤微环境的蛋白质组变异在鼻咽癌发病中发挥重要作用。（3）NPC放疗抵抗的蛋白质组学研究 目前鼻咽癌的主要治疗手段是放射治疗 但是，部分 NPC 对放疗抗拒，但其机制仍然不甚清楚 因此寻找鼻咽癌放疗抗拒相关的蛋白质，不仅有助于揭示鼻咽癌放疗抗拒的机制，且能为鼻咽癌放疗敏感性预测及鼻咽癌的个体放疗提供科学依据研究结果提示：14-3-3和Maspin的下调及GRP78和Mn-SOD的上调与放疗抵抗相关，这四个蛋白质有望作为预测鼻咽癌放疗反应的标志物，上调14-3-3表达可降低CNE2-IR细胞的放射抗拒性 （4）在NPC发生

30、发展中的关键蛋白质的组学研究 如：P53、TGF-、RKIP、磷酸化蛋白质组 p53基因在多种人类肿瘤中存在高频率突变，但鼻咽癌中p53基因突变的频率很低，同时鼻咽癌中出现p53蛋白质的高表达或聚集。p53干扰的蛋白质组学研究为揭示NPC细胞中p53蛋白聚集和功能异常的机制，以及p53基因在NPC发病中的作用提供了新线索。鼻咽癌细胞系HNE1和HNE2经抗p53抗体免疫共沉淀、SDS-PAGE分离、质谱鉴定蛋白。n 鼻咽癌组织与正常鼻咽上皮组织的差异磷酸化蛋白质组分析n 鼻咽癌血清比较蛋白质组学研究n 蛋白组学方法识别RKIP转移鼻咽癌转移抑制蛋白n 不同分化程度的鼻咽癌组织定量蛋白质组学研究n 鼻咽癌14-3-3蛋白的靶向蛋白质组学研究n 鼻咽癌放射抵抗蛋白质组学组织芯片 n 血清蛋白质组学（SERPA）方法发现肺鳞癌患者Tim、Mn-SOD和Prx 阳性率明显高于健康