光谱分析法-研究生

1、常见现代仪器分析技术常见现代仪器分析技术：1.1. 光谱分析技术：光谱分析技术：紫外紫外- -可见分光光度计、荧光分析仪器、可见分光光度计、荧光分析仪器、原子光谱分析仪原子光谱分析仪2.2. 显微镜显微镜: :光学显微镜和电子显微镜光学显微镜和电子显微镜3.3. 分离分析技术：分离分析技术：离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电泳仪泳仪4.4. 细胞及分子生物学技术：细胞及分子生物学技术：培养箱、培养箱、PCRPCR基因扩增仪基因扩增仪5.5. 波谱分析技术：波谱分析技术：质谱仪质谱仪6.6. 常规仪器分析技术：常规仪器分析技术：生物安全柜、免疫分析仪生物安全柜、免疫

2、分析仪2第一章第一章 光谱分析法光谱分析法（ Spectrum Analysis ）2本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱可见光吸收光谱法法! 光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点! 电磁辐射的基本性质电磁辐射的基本性质! 电磁辐射的特性电磁辐射的特性! 光谱分析法的分类光谱分析法的分类! 分子光谱法分子光谱法! 基本原理基本原理! 紫外紫外/可见分光光度计构造可见分光光度计构造! 紫外紫外/可见分光光度计类型可见分光光度计类型3第三节第三节 分子发光光谱法分子发光光谱法! 光致发光光致发光! 分子荧光和磷光光谱基本原理分子荧光和

3、磷光光谱基本原理! 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素! 分子荧光光谱仪分子荧光光谱仪! 分子荧光光谱法的应用分子荧光光谱法的应用! 磷光光谱法磷光光谱法! 化学发光法化学发光法4本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论5是电磁辐是电磁辐射按照波射按照波长的有序长的有序排列。排列。第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论6一、一、光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点 光谱分析光谱分析 (spectral analysis)： 对物质发射辐射能的能对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。 电

4、磁辐射范围：电磁辐射范围：射线（射线（10-10m）无线电波（）无线电波（103m）所有范围；所有范围； 相互作用方式：相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；、衍射等； 应用：应用：光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；面具有其他方法不可区代的地位；7（1 1）能源提供能量；）能源提供能量；（2 2）能量与被测物之间的相互作用；）能量与被测物之间的相互作用；（3 3）产生信号）产生信号。 基本特点：基本特点：（1 1）所有光分析法均包含三个基本过程；）所

5、有光分析法均包含三个基本过程；（2 2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3 3）涉及大量光学元器件）涉及大量光学元器件。三个基本过程：三个基本过程：一、一、光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点8二、电磁辐射的基本性质二、电磁辐射的基本性质 电磁辐射（电磁波）：电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）以接近光速（真空中为光速）传播的能量；传播的能量； c = =/ E = h = h c / c：光速；光速；：波长；波长；：频率；频率；：波数：波数 ； E ：能量；：能量； h：普朗克常数：普朗克常数 电磁辐射具有波动性和

6、微粒性电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；（波粒二象性）；9三、辐射能的特性：三、辐射能的特性： (1) 吸收吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；到高能级； (2) 发射发射 将吸收的能量以光的形式释放出；将吸收的能量以光的形式释放出； (3) 散射散射 由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去； (4) 折射折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同；折射是光在两种介质中的传播速度不同； (5) 反射反射 光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质光射到不同的介质介面时，部

7、分光自介面射回原介质中；中； (6) 干涉干涉 干涉现象；干涉现象； (7) 衍射衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象； (8) 偏振偏振 只在一个固定方向有振动的光只在一个固定方向有振动的光。10常用三种光常用三种光分析法测量分析法测量过程示意图过程示意图 11四、光谱分析分类四、光谱分析分类光谱分析法光谱分析法原原子子发发射射原原子子吸吸收收原原子子荧荧光光X X射射线线荧荧光光原原子子吸吸收收紫紫外外可可见见红红外外可可见见核核磁磁共共振振紫紫外外可可见见红红外外可可见见分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光核核磁磁共共振振化化学学发发光光原原子子发

8、发射射原原子子荧荧光光分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光X射射线线荧荧光光化化学学发发光光吸收光谱法吸收光谱法发射光谱法发射光谱法原子光谱法原子光谱法分子光谱法分子光谱法12五、分子光谱法五、分子光谱法1. 电子相对于原子核的运动电子相对于原子核的运动-电子能级电子能级; 单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反. . 三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同. . 2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动原子核在其平衡位置附近的相对振动 -振动能级振动能级; 3. 分子本身绕其重心的转动分子本身绕其重心的转动-转动能

9、级转动能级.13分子的能级图与跃迁分子的能级图与跃迁S Sn n: : 电子能级电子能级V Vn n: : 振动能级振动能级J Jn n: : 转动能级转动能级分子的总能量分子的总能量 = E电子电子+ E振动振动+ E转动转动14 分子光谱分析法的分类分子光谱分析法的分类分分子子光光谱谱分子吸收分子吸收分子发光分子发光光致发光光致发光其它发光形式其它发光形式UV-Vis （紫外（紫外-可见）可见）IR（红外）（红外）如：荧光和磷光如：荧光和磷光如：化学发光等如：化学发光等15第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法16紫外紫外/ /可见光吸收光谱分析法可见光吸收光谱分析法

10、： 利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析波属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为长范围一般为200800nm。历史悠久、应用广泛：历史悠久、应用广泛：分析化学分析化学药物分析药物分析临床检验等临床检验等第二节第二节 紫外紫外/ /可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法17朗伯定律朗伯定律:(1760):(1760) 比尔定律比尔定律( (1852)1852) 一、一、基本原理

11、基本原理I0It入射光入射光透过光透过光18朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、一、基本原理基本原理19t0=ITI A = lg(I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc-=10=10KbcAT一、一、基本原理基本原理20AT (%)cA=kbc1.00.80.60.40.2-kbcT =10100 80 60 40 20一、一、基本原理基本原理21 （1）当

12、）当c的单位用的单位用gL-1表示时，用表示时，用a 表示，表示， Aa b ca 的单位的单位: Lg-1cm-1 的单位的单位: Lmol-1cm-1（2）当）当c的单位用的单位用molL-1表示时，用表示时，用表示，表示， A b c （3） 当当c的单位用的单位用g100mL-1表示时，用表示时，用 表示表示, A bc， 叫做比吸光系数。叫做比吸光系数。1%1cmE1%1cmE1%1cmE一、一、基本原理基本原理22溶液浓度的测定溶液浓度的测定A b c工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A。 。 。 。*0.800.600.

13、400.200.00Axcx一、一、基本原理基本原理261. 单色光单色光 应选用应选用 max处或处或肩峰处肩峰处测定。测定。3. 稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强。浓度增大，分子之间作用增强。2. 吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)。一、一、基本原理基本原理27 A = A1 + A2 + +An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。即消除了吸收

14、池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。001221=lg =lg =-=lgIIIAAAAAIII参参参参比比液液比比试试试试液液一、一、基本原理基本原理28二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统分光光度计的基本组成分光光度计的基本组成 习惯上将工作波段在习惯上将工作波段在200nm800nm的分光光度的分光光度计称为紫外计称为紫外-可见分光光度计。可见分光光度计。 通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。 波长可调波长可调, 故选择性好故选择性好, 准确度高。

15、准确度高。29 /nm钨灯（热辐射光源）钨灯（热辐射光源）40040060060080080010001000氙灯氙灯氢灯氢灯强强度度可见光区：可见光区：钨灯，卤钨钨灯，卤钨灯灯(3202500nm) 紫外区：紫外区： 氢灯氢灯 (180375nm) 氙灯、汞灯氙灯、汞灯：紫外、可紫外、可见光区均可用作光源见光区均可用作光源要求要求：有足够的光强度，稳定。有足够的光强度，稳定。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件30氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯31棱镜棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃玻璃3503200nm, 石英石英185

16、4000 nm入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件32光栅光栅：（利用光通过光栅时发生利用光通过光栅时发生衍射衍射和和干涉干涉现象而分光的装置现象而分光的装置）光栅衍射示意图光栅衍射示意图光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅M1M2出出射射狭狭缝缝在镀铝的玻璃表面刻有数在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的量很大的等宽度等间距等宽度等间距条条痕痕(600、1200、2400条条/mm )。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要

17、部件33低档仪器：刻度显示低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录中高档仪器：数字显示，自动扫描记录光电池，光电管，光电倍增管光电池，光电管，光电倍增管二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件341. 单光束分光光度计单光束分光光度计可变波长单光束紫外可变波长单光束紫外- -可见分光光度计示意图可见分光光度计示意图三、紫外三、紫外/可见分光光度计的基本类型可见分光光度计的基本类型352. 双光束分光光度计双光束分光光度计参比池参比池检测器检测器滤光片或滤光片或单色器单色器放大器放大器样品池样品池光源光源 hv光子检测器光子检测器反光镜反光镜反光镜反光镜透明部分

18、透明部分扇形镜扇形镜 正面图正面图扇形镜扇形镜反光镜反光镜栅镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响。双光束型可以消除光源强度变化的影响。可变波长双光束紫外可变波长双光束紫外-可见分光光度计示意图可见分光光度计示意图36第三节第三节 分子发光光谱法分子发光光谱法37分子发光分子发光光致发光光致发光化学发光化学发光生物发光生物发光光致发光（光致发光（Photoluminescence）: 物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。Photo

19、luminescenceMolecular Luminescence ChemiluminescenceBioluminescence38u1575年，西班牙医生年，西班牙医生N.Monardes发现。发现。u1852年，年，George Stokes对荧光产生的机理作了对荧光产生的机理作了解释，并提出了解释，并提出了“荧光荧光”。u1867年，分子荧光首次用于分析测定。年，分子荧光首次用于分析测定。u1928年，年，Jette和和West提出第一台光电荧光计。提出第一台光电荧光计。u1952年，商品荧光分光光度计出现。年，商品荧光分光光度计出现。 分子荧光技术的发展分子荧光技术的发展39Th

20、e Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）绿色荧光蛋白）绿色荧光蛋白2008诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖Osamu Shimomura 1960sMartin Chalfie 1990sRoger Y. Tsiens, today40一、分子荧光（磷光）发生的原理一、分子荧光（磷光）发生的原理41 。 物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发态后，电子由发态后，电子由第一激发态的最低振动能级回到基态第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级的各个振动能级，以

21、，以光的形式光的形式放出末态两个能级的能放出末态两个能级的能量差额称为量差额称为荧光荧光。 基于化合物的荧光测量而建立基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为起来的分析方法称为分子荧光光分子荧光光谱法谱法。 421. 1. 分子的多重态：分子的多重态：单线态、激发单线态、激发三线态单线态、激发单线态、激发三线态单线态单线态(S0) 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。多数有机物分子的基态是单线态多数有机物分子的基态是单线态。当基态一对电子的一个被激发到较高能级时当基态一对电子的一个被激发到较高能级时，激发单线态激发单线态(S) 自旋方向不改变，分

22、子仍处于单线态。自旋方向不改变，分子仍处于单线态。激发三线态激发三线态(T) 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。有两个电子的自旋不配对而平行的状态。分子的激发与失活分子的激发与失活43S0ST分子的多重态分子的多重态ET1 kkf f，不出现荧光发射；不出现荧光发射；荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系 （1 1）具有合适的结构；）具有合适的结构； ifffkkk吸收的光量子数发射的光量子数（2 2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率荧光量子产率（ f）：）：57某些化合物的荧光效率某些化合物的荧光效率化合物化合物 荧光效率荧光效率 溶剂溶剂荧光

23、素荧光素 0.92 （0.1MNaOH）曙红曙红 0.19 （0.1MNaOH）罗丹明罗丹明B 0.97 （乙醇）（乙醇）蒽蒽 0.31 （己烷）（己烷）核黄素核黄素 0.26 （水，（水，pH7.0）菲菲 0.10 （乙醇）（乙醇）萘萘 0.12 （乙醇）（乙醇）酚酚 0.22 （水）（水）叶绿素叶绿素 0.32 （苯）（苯）58化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光l 具有共轭双键体系的分子具有共轭双键体系的分子化合物化合物（环己烷中）（环己烷中）结结 构构荧光效率荧光效率 荧光波长荧光波长（nm）苯苯0.07283联苯联苯0.18316对对-联三苯联三苯0.9334259（a）萘：）萘：

24、荧光效率为荧光效率为0.29； 荧光波长为荧光波长为310 nm。（b）蒽：）蒽：荧光效率为荧光效率为0.46；荧光波长为荧光波长为400 nm。 多环芳烃是重要的环境污染物，可用多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。荧光法测定。3，4 - 苯并苯并芘芘强致癌物强致癌物!60l 具有刚性不饱和平面结构的分子具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光61反式：反式：平面构型平面构型 强荧光体强荧光体顺式：顺式：非平面构型非平面构型 非荧光体非荧光体C=CHHC=CHH62NOHNOHMN NOHSO3NaNNOAlSO3NaOOHHO滂铬滂铬BBRBBR本身不发荧光本

25、身不发荧光AlAl3+3+滂铬滂铬BBRBBR发红色荧光发红色荧光63l 苯环上取代基的类型：苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强：给电子基团常使荧光增强：-OH、-OR、-NH2、-CN等。等。吸电子基团会使荧光减弱：吸电子基团会使荧光减弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。等。化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 苯苯 10 10 C6H5COOHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750 卤素取代基卤素取代基: 随着取代基中卤随着取代基中

26、卤原子系数的增加，原子系数的增加，使系间窜跃加强使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。物质的荧光减弱，而磷光增强。64温度：温度：温度温度越高越高，荧光，荧光降低降低环境对荧光的影响环境对荧光的影响溶剂：溶剂：极性极性增加增加，荧光，荧光增强增强，荧光波长发生，荧光波长发生红移红移pH值：值：电离平衡的电离平衡的改变改变导致荧光强度的导致荧光强度的差异差异猝灭剂：猝灭剂：动态猝灭、静态猝灭、自猝灭动态猝灭、静态猝灭、自猝灭表面活性剂：表面活性剂：保护保护处于激发单重态的荧光物质分子，处于激发单重态的荧光物质分子， 提高提高荧光效率。荧光效率。65pHpH对荧光强度的影响对荧光强度的影响

27、共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。光效率和荧光波长。OHO_OHH+_离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光66四、荧光光谱仪四、荧光光谱仪67测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由四个部分组成：四个部分组成：激发光激发光源、样品池、双单色器源、样品池、双单色器系统、检测器。系统、检测器。 特殊点：特殊点：1.1.有两个单色器有两个单色器2.2.光源与检测器通常成光源与检测器通常成直角。直角

28、。仪器结构仪器结构69荧光光度计光路图荧光光度计光路图电源电源光度计光度计记录仪记录仪光电倍增管光电倍增管试样液池试样液池光源光源光栅光栅光栅光栅反射镜反射镜反射镜反射镜激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器9070 荧光分光光度计的的主要部件荧光分光光度计的的主要部件n激发光源：激发光源：稳定、具有一定强度（稳定、具有一定强度（300400nm)n样品池：样品池：低荧光材料，常用石英池，方形低荧光材料，常用石英池，方形n检测器：检测器：较高灵敏度较高灵敏度n单色器单色器（激发单色器和发射单色器）：（激发单色器和发射单色器）：光栅光栅仪器结构仪器结构711个光子可产生个光子可产生106107

29、个电子个电子光电倍增管光电倍增管(Photomultiplier Tube, PMT)72仪器的使用维护仪器的使用维护注意事项注意事项n电源：电源：触发电压、工作电流、稳定性触发电压、工作电流、稳定性n光源：光源：启动预热、冷却重启、保持清洁启动预热、冷却重启、保持清洁n单色器：单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤防潮、防尘、防污和防机械损伤n光电倍增管：光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射避免高压时受到外来光线直射n样品池：样品池：插放方向、避免摩擦、清洗插放方向、避免摩擦、清洗n个人防护个人防护 ： 避免紫外线损伤避免紫外线损伤 73五、荧光分析方法与应用五、荧光分析方法与应用74优点：

30、优点： （1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高23个数量级；个数量级； （2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少）试样量少 、方法简便、提供比较多的物理参数方法简便、提供比较多的物理参数 缺点：缺点： 应用范围小。应用范围小。 60余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。荧光分析法的特点荧光分析法的特点75荧光信号荧光信号u荧光寿命荧光寿命u荧光光谱荧光光谱u荧光强度随光谱变化荧光强度随光谱变化u成像（荧光物质在样本中分

31、布的空间信息）成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）u强度强度u寿命寿命76可获得的信息可获得的信息u分子结构信息：分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等u分子浓度信息分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭荧光强度增强或猝灭u分子在溶剂中的状态：分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等或动态猝灭，荧光寿命的变化等等u分子间的相互作用：分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新

32、的荧光峰的产生移、新的荧光峰的产生u分子的大小：分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等分子的转动速度对偏振光的消偏等77荧光分析法对物质的定性或定量分析荧光分析法对物质的定性或定量分析 定性分析：定性分析：依据不同结构的物质所依据不同结构的物质所吸收波长和发射的荧光波长不同；吸收波长和发射的荧光波长不同； 定量分析：定量分析：同种物质的稀溶液，其同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。产生的荧光强度与浓度呈线性关系。78 任何荧光化合物都具有两种任何荧光化合物都具有两种特征光谱：特征光谱：u 荧光激发光谱（吸收光荧光激发光谱（吸收光谱）谱）固定某一发射波长，测定该固定某一发射波

33、长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。变化所得的光谱。u 荧光发射光谱（荧光光荧光发射光谱（荧光光谱）谱）固定某一激发波长，测定荧固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光发射强度随发射波长变化得到的光谱。光谱。荧光分析法定性依据荧光分析法定性依据79(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 F正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 f ： F = f Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia =I0-I=I0 (1-10- l c ) F= f I0(1-10- l c ) = f I0(1-e-2.3

34、 l c ) 浓度很低（浓度很低（ l c 0.05）时，）时，将括号项近似处理后：将括号项近似处理后： F= c = K c 荧光分析法定量依据和方法荧光分析法定量依据和方法80荧光的定量分析荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcF=KcI0IFIa条件条件: : 溶液浓度较稀溶液浓度较稀81一般当一般当b c 0.05 时时, F与与c呈线性关系呈线性关系浓度对荧光强度的影响浓度对荧光强度的影响Fc82单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化合物化学反应荧光猝灭88(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 可测

35、量约60多种元素： 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。 单组分的荧光测定单组分的荧光测定89(2) 有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭不饱和体系，多能发生荧光。芳香族化合物具有共

36、轭不饱和体系，多能发生荧光。 脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。 胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均可以用荧光法分析。可以用荧光法分析。被测物质被测物质试剂试剂雌激素雌激素H2SO4质甾族质甾族H2SO4氨基酸氨基酸邻苯二醛（缩合）邻苯二醛（缩合）维生素维生素B1Fe(CN)63- 或或Hg2+ (氧化至硫胺荧氧化至硫胺荧) 90u 蛋白质荧光探针 就是利用荧光探测剂（小分子荧光化合物），使其与就是利用荧光探测剂（小分子荧光化合物），使其与荧光较弱或不发荧光的物质共价或非共价地结

37、合，以形成荧光较弱或不发荧光的物质共价或非共价地结合，以形成发强荧光的络合物，然后测定络合物的荧光。发强荧光的络合物，然后测定络合物的荧光。 荧光探测剂必须满足以下荧光探测剂必须满足以下3个条件：个条件：1. 与蛋白质的某一微与蛋白质的某一微区专一而牢固地结合；区专一而牢固地结合；2. 荧光荧光参数对于结合点的微环境变化参数对于结合点的微环境变化很敏感；很敏感；3. 结合以后不改变蛋结合以后不改变蛋白质的构象。白质的构象。93六、磷光光谱法六、磷光光谱法92磷光光谱法磷光光谱法 磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。机化合物和进行

38、定量分析的一种方法。93磷光光谱法磷光光谱法 磷光光谱分析法的分类磷光光谱分析法的分类u 低温磷光低温磷光u 室温磷光室温磷光1、固体表面室温磷光法（、固体表面室温磷光法（SS-RTP）2、胶束增稳室温磷光法（、胶束增稳室温磷光法（MS-RTP）94样品管样品管镀银镀银未镀银未镀银Io液氮1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 磷光光谱法的应用磷光光谱法的应用95七、化学发光光谱法七、化学发光光谱法96基本原理基本原理 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激在化学反应过程中，某

39、些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称为化学发光。为化学发光。 A +B = C + D* D* D + h 97化学发光的特点化学发光的特点98化学发光的效率化学发光的效率化学效率：化学效率：参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 发光效率：发光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 em emcecl 参参加加反反应应的的分分子子数数发发射射光光子子的的分分子子数数99 时刻时刻t t的的化学发光强度化学发光强度( (单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数) )： tctIdd

40、clcl 化学发光的效率化学发光的效率100 是与分析物有关的化学发光效率是与分析物有关的化学发光效率; dc/dt 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；cl 化学发光分析法定量分析依据：化学发光分析法定量分析依据： 从上式可以看出：发光总强度与分析物浓度成正比。从上式可以看出：发光总强度与分析物浓度成正比。cdtdtdcdtICLCLCL直接发光直接发光A + B C* + D C* C + h 化学发光反应类型化学发光反应类型1. 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光间接发光间接发光A + B C* + DC*+F F* + E F* F + h 2. 气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光101u 灵敏度极高灵敏度极高u 仪器设备简单仪器设备简单u 发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰u 线性范围宽线性范围宽u 分析速度快分析速度快化学发光分析法的特点化学发光分析法的特点102内容小结内容小结第一节第