实验3_凝胶过滤法使蛋白质脱盐

1、实验三实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐凝胶过滤法使蛋白质脱盐山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院生物化学实验之生物化学实验之【实验原理【实验原理】 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体或凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进的大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行分离和纯化。行分离和纯化。 该方法广泛用于生物大分子的分离、纯该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、浓缩等。化、浓缩等。【实验目的【实验目的】 学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原理与操作技术理与操

2、作技术 凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶性珠状颗粒。多是交联的聚糖性珠状颗粒。多是交联的聚糖( (如葡聚糖或琼脂如葡聚糖或琼脂糖糖) )类物质，用它来进行物质分离，主要是根据类物质，用它来进行物质分离，主要是根据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同的排阻效应实现的。的排阻效应实现的。 葡聚糖凝胶的商品名称为葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。多孔网状结构，呈珠状颗粒。 本实验用本实验用G-25使蛋白质与使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当分离，当蛋

3、白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入扩散进入G-25的网孔中，而大分子的的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在

4、层析柱中移动较慢，这样蛋白质阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的样品脱盐的目的。 。凝胶过滤层析过程示意凝胶过滤层析过程示意图图【器材与试剂【器材与试剂】（一）器材（一）器材 1. 层析柱层析柱 (15mm300mm） 2. 铁架台铁架台 3. 滴定管夹滴定管夹 4. SephadexG25 5. 刻度吸管刻度吸管 （二）试剂（二）试剂 1. 样品溶液样品溶液 蛋白质硫酸铵溶液蛋白质硫酸铵溶液 2.10黄柳酸黄柳酸 3.钠氏试剂钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水）洗脱液（去离子水）【实验操作【

5、实验操作】（一）凝胶的溶胀（一）凝胶的溶胀 取取Sephadex G25， 加入去离子水置室加入去离子水置室温溶胀温溶胀 24小时小时以上，反复倾以上，反复倾泻去掉细颗粒，泻去掉细颗粒，或沸水浴中煮沸或沸水浴中煮沸23小时，可去小时，可去除颗粒内部的空除颗粒内部的空气及灭菌。气及灭菌。（二）连接层析装置二）连接层析装置 1. 1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 2. 按下图将各部位连接起来。按下图将各部位连接起来。洗洗脱脱液液连连接接软软管管层层析析柱柱收收集集容容器器连连接接软软管管（三）装柱与层析（三）装柱与层析 1.1.装柱装柱 向层析柱中注入少量洗

6、向层析柱中注入少量洗脱液（去离子水），将凝胶脱液（去离子水），将凝胶浆液沿玻棒缓慢倾入柱中浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（注满）。凝胶自然沉积约（注满）。凝胶自然沉积约1 12cm 2cm 高度后打开下端出高度后打开下端出水口水口, ,待凝胶床面上升到约待凝胶床面上升到约3/43/4柱高停止。关闭出水口柱高停止。关闭出水口, ,静置。静置。 2.2.洗柱洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称作

7、平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的为柱床体积的23倍），再拧紧螺旋夹。倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。3.3.加样与洗脱加样与洗脱 用刻度吸管吸取用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质硫酸样品（蛋白质硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中凝胶柱中, 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。液。 用刻度离心管收集洗出液，每管收集用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠滴加入白瓷板穴中，加入钠氏试剂氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。淀。