海洋发光细菌的发光及其应用

1、第28卷第2期2007年4月发光学报CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章编号: 1000-7032(2007)02-0167-06海洋发光细菌的发光及其应用张进兴,逄爱梅,孙修勤,孙培光(国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061)摘要:海洋发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见光的异养细菌,其发光特性与细菌体内的物质结构、海洋环境要素、水中污染物等多种因素有关。通过对海洋发光细菌发光特性及其应用可能性的论述,如利用发光细菌的发光强度与水中毒物的浓度、毒性的关系检测污染物;利用潜艇航行时激发的生

2、物发光勾画出潜艇涡动的光尾流可跟踪探测潜艇;海洋发光细菌的发光特性还可用以改进水下光通讯与探测、海洋水色遥感、海洋发光细菌分类、发光免疫和抗菌素浓度测定等方面。阐明海洋发光细菌发光特性的重要研究意义并为进一步开展应用研究提供借鉴。关键词:海洋发光细菌;发光特性;应用研究中图分类号:O482. 31PACC:3250F; 7860P文献标识码:A收稿日期:2006-08-25;修订日期:2006-11-24基金项目:国家科技基础条件平台项目(海洋微生物菌种种质资源标准化整理整合与共享)(2004DKA30640);国家908项目(我国近海海洋综合调查与评价)基金资助项目作者简介:张进兴(1954

3、-),男,山东潍坊人,研究员,主要从事应用微生物学的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋发光细菌的发光现象一直是人们十分关注的问题,各国科学家对此进行了多方面的调查研究。国内对海洋发光细菌发光的观测研究已有多年历史。在国标海洋调查规范中,早已把“海发光”列为海洋调查内容,其中“弥漫型”海发光便是由海洋发光细菌产生的,作为常规海洋观测项目之一,已积累了许多现场观测资料。近年来,由于实际应用的需要,对海洋发光细菌的观测研究有所加强,如现正进行的西北太平洋环境调查研究项目中,就包含了海洋发光细菌的分布调查。有关海洋发光细菌

4、的研究内容相当广泛,从近期国内外发表的文献资料看,主要有海洋发光细菌的发光机理,发光基因、荧光素酶、发光特性以及某些应用方法等研究。在发光特性研究方面,以往更多地侧重于细菌发光与其体内物质、结构关系的研究,即侧重于微生物学和生物化学方面的研究,而在环境要素和细菌种类、密度等对细菌光谱的影响方面的研究相对较少。在海洋发光细菌的研究中,发光特性及其应用研究是一项重要内容。利用细菌的发光特性,开展应用研究,尤其结合光学原理,制作某些传感器,用于海洋环境污染监测,已引起国内外广泛重视。为了研究海洋发光细菌发光特性的应用前景,首先必须深入了解海洋发光细菌的性质,积累发光细菌发光特性的基础资料和研究经验。

5、然后,依据细菌发光的不同特性和应用可能性,开展相应的应用研究。此类研究不仅可为细菌发光特性的应用提供有效方法,并将促进海洋生物学、海洋光学、生物化学之间交叉学科综合研究的发展,为从物理学角度研究海洋发光细菌提供依据。为此,本文拟在简要综述海洋发光细菌的分布特点与发光机理研究基础上,论述发光特性及其在海洋环境污染物监测、发光细菌分类、水下通讯探测和水色遥感上的应用研究现状,为进一步开展海洋发光细菌发光特性的应用研究提供借鉴。2分布特点与发光机理海洋发光细菌是一类从海水中或者从海洋动物体表、消化道和发光器官上以及海底沉积物中可以分离到的,在适宜条件下能够发射可见光的异养细菌。海洋中的发光细菌,除了

6、在海水中自由浮游生存的外,还有寄生于其他海洋生物体的。许多海洋生物的发光与发光细菌有关,如某些鱼类、软体动物等的发光是由海洋发光细菌寄生、共168发光学报第28卷栖生存所致。海洋发光细菌的种类不是很多,但其分布却非常广,从海表层至深海;从热带海洋至非常寒冷的极地海域都有其踪迹。为了更好地掌握海洋发光细菌的发光特性及应用可能性,除需要了解发光细菌的分布特点外,也有必要对发光细菌的发光机理作简要介绍。发光机理的研究结果表明,不同种类的发光细菌其发光机理是基本一致的,都必须有细菌荧光素酶(LE)、还原性的黄素单核苷酸(FMN·H2)、氧气(O2)、长链脂肪醛(RCHO)的参与,大致历程如下

7、:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地说,细菌生物发光反应是由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸(FMN)及长链脂肪酸,同时释放出蓝绿光。发光细菌发出的光是连续的,属“冷光”。这是一种化学发光类型,在化学能转换为辐射能的过程中发光。荧光素酶是菌体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称,细菌荧光素酶是含、两个多肽亚基的单加氧酶,只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋发光

8、细菌中提取的细菌荧光素酶其分子量差别较小。由于海洋发光细菌发光细胞内含有荧光素和荧光素酶,有了氧气,细胞内的荧光素就受到荧光素酶的催化作用而吸收能量,变成氧化荧光素并释放光子而发光。不同种类的海洋发光细菌可产生不同的荧光素酶,发光特性也不同。3发光特性研究海洋发光细菌的发光特性研究,包括不同菌种所具有的特异光谱特性研究,发光强度、发光特征参数和发光条件对细菌发光的影响等项研究,以及不同种类的发光组分和酶结构的差异研究。各种生物发光的本质大体一样,都是由一组化合物荧光酶和高能化合物腺苷三磷酸等构成发光光源。它们发出的蓝、青、绿、黄、橙等不同颜色的光,是因为各自的荧光素、荧光酶在结构上的微小差异引

9、起的。发光细菌的光谱范围约420670 nm,max在475485 nm左右,为单一发射峰,max和半峰全宽有种属差异。从发光特征参数发光量子产率来看,其生物发光反应特点是高光子产生效率: 0. 50. 8。通过发射光的比率可以推出未知成分的浓度,因此测定化学反应过程中的发射光是非常有用的。反应过程中产生的光与发射光的量子产率是直接相关的,与相应的发光物质的浓度成比例。因此,反应过程中的光可以相对反映出目标样品中发光物质的量。有关生物发光共振能量转移是指在一个发光或荧光供体和一个荧光受体(如绿色荧光蛋白的突变体GFP)之间会发生能量转移。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质-蛋白质之间的相

10、互作用。如Kudryasheva等1研究了细菌生物发光电子激发态上限能量估算,用染色分子作为能量接收者,证实了细菌生物发光电子激发态上限活动的假设。并给出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶联酶系统NADHFMN-氧化还原酶-荧光素酶的细菌发光光谱。从已有的实验研究结果看,大多数发光细菌的发光,仅发生于高细胞密度,细菌发光依赖于培养体系中诱导蛋白的浓度和积累。细菌种类和生长条件,包括温度、盐度和营养成分以及其他实验条件对其发光也有影响2。在正常的生理条件下,发光细菌能发出波长为450490 nm的蓝绿光;在一定的试验条件下,发光强度是恒定的3。但也有学者研究发现,发光杆菌

11、属经某种处理后其发光光谱产生位移,如HajimeKaratani等4在由发光杆菌发光现象产生的两种荧光蛋白质的特性研究中,发现从深海发光细菌中分离的荧光蛋白质中,发光杆菌属经提纯、克隆和排序出两种荧光蛋白质,最大发射的荧光波长在488, 517 nm。在尿素中刺激荧光蛋白质引起488 nm谱段光强度的减弱,显示出新的荧光峰值为423 nm;尿素消除,部分可逆转。对海洋发光细菌的体内生物发光光谱的研究,如朱文杰等5发现,发光光谱有种属特异性。以最大发射波长来说,弧菌属为482485 nm,发光杆菌属则在474480 nm。其中东方弧菌为(484±1) nm,半峰全宽为(92±

12、1) nm。又如朱文杰等6对东方弧菌的无细胞系统的发光研究,从东方弧菌的细胞裂解液中分离到一种组分,仅需长链脂肪醛就可以启动发光,其最大发射峰在480490 nm。他们还测量提取物的吸收光谱和荧光光谱,其中吸收光谱显示在414 nm处有一最大吸收峰,在380, 485 nm处各有一个弱吸收峰;反应后的吸收光谱,除380 nm峰消失外,其余不第2期张进兴,等:海洋发光细菌的发光及其应用169变。汪杰等7则将发光细菌的生物发光光谱作微分处理,使各种发光细菌在光谱上的差异充分显示出来。近年来,在有关刊物上发表了多篇关于海洋环境要素、细菌营养成分、细菌体内物质结构等对发光细菌发光特性影响的研究论文,主

13、要的有,杜宗军等8对一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究表明,该菌种在pH7. 5、温度30、NaCl浓度3. 0%时,发光强度最高;正常发光的温度在2040、pH=6. 08. 0;液体培养4 h开始发光, 6 h后发光达到峰值,持续发光时间可达19 h。水体的pH值、温度、盐度和营养成分等环境条件的变化将引起荧光素酶的改变,从而改变细菌的发光特性。Hkaratani等9关于海洋中费氏弧菌生物发光的光谱分布和它的荧光蛋白及细胞密度之间的关系研究,该研究表明,费氏弧菌产生黄色荧光蛋白(YFP)与产生蓝色荧光蛋白(BFP)之比,和细胞密度、菌体生长时间有关;费氏弧菌在细胞生长期间生物

14、发光的改变,依赖于细胞内YFP水平。Miyamoto等10研究了S腺苷-L-蛋氨酸有关结构和调节蛋白对哈维氏弧菌发光的影响。王江安等11潜艇光尾流产生机理及其探测技术研究表明,不同的声波、电磁波的波长对不同种类的海洋发光细菌的生物效应是不同的,在受到外界电磁场刺激下,将影响发光反应生理过程,发光强度有所改变,强度的变化与受试物的类型和强度在一定范围内呈相关关系。发光特性与荧光素酶的结构有关,配体蛋白的相互作用,对化学修饰和致突变实验中测定特殊氨基酸残基的功能方面是非常有用的,而氨基酸残基的突变可引起发光光谱的位移。对这些改变加以分析研究,将有助于加深对细菌发光规律性的认识。通过基因重组及细胞融

15、合技术可获得能满足各种用途的荧光素酶,改变发射光波长。有关这方面的综合研究报道如茆灿泉等12发光细菌lux报告基因系统的评价及应用和张菊梅等13荧光素酶研究进展。4细菌发光的应用研究4.1在海洋环境监测中的应用海洋环境中的污染物种类和数量日益增多,传统的分析鉴定手段难以达到实时、迅速、在线的要求。发展新的快速、准确、有效的分析方法与检测技术显得非常迫切、必要。由于发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系,能够稳定、快速地反映环境中的污染物浓度变化;而且检测时间短(在515 min)、灵敏度高(细胞基本物质代谢受到影响前发光反应先被抑制)海洋发光细菌的发光特性与环境中有毒污染物的毒性

16、有关,可用于毒物的检测。杜宗军等2发光细菌的研究和应用提出利用发光细菌来检测有毒物质。由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统,费时较少且灵敏度高,操作简便、结果准确,所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质,在国内外越来越受到重视。我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法(GB/T15441-1995)。这方面的研究有:黄正等14发光细菌的生理特性及其在环境监测中的应用,就发光细菌的生理特性、发光细菌毒性试验在环境监测中的应用及该技术的新进展3个方面进行了较为全面的概述,评价了发光细菌毒性试验的特点,提出了该技术今后的发展方向,预视它将成为环境监测的重要手段。薛建华等15发光

17、细菌应用于监测水环境污染的研究中指出,水环境中的汞、苯酚都抑制细菌发光,且抑制程度与汞、苯酚的浓度之间存在着明显的相关关系。吴伟等16发光细菌在渔业水域污染物毒性快速检测中的应用一文中,以明亮发光杆菌为指示生物,对渔业区域中污染物的急性毒性进行了检测;同时研究了pH值、温度对检测结果的影响。研究表明,发光细菌毒性试验是一种快速、简便的毒性测试方法,在温度2030, pH6. 09. 0条件下进行的测试,其结果与鱼类毒性试验可以互相替代。林志芬等17在发光菌生物毒性测试方法的改进中,针对发光菌发光强度本底差异较大,检测期间发光变化幅度宽的问题,在传统发光细菌毒性测试实验中引入校正因子(P2丙酮)

18、;同时也研究了磁力搅拌时间、培养时间、培养代数和培养温度等条件对EC50测定值的影响。海洋发光细菌种类不同时,发光特性有变化,其最佳的发光条件也不同。因此,利用不同种类的海洋发光细菌的发光特性,可以监测海洋环境中的某些污染物。在应用细菌发光特性探测污染物的有关研究中,利用发光细菌制备识别元件,成为海洋环境中污染物探测传感器研究和发展的热点。20世纪80年代初,美国Beck-man公司推出功能完备的170发光学报第28卷生物毒性测试仪,它具有应用范围广、灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点,受到广泛重视。发光细菌毒性测试技术在世界范围内迅速推广。黄正等细菌发光传感器在快速检测污染物急性毒性中的应

19、用18一文中以明亮发光杆菌作为指示生物,将细胞固定化技术、生物传感器与发光细菌毒性测试技术有机结合起来,建立了细菌发光传感器。在细菌发光传感器研制中,筛选优良的菌种是关键技术之一。4.2在发光细菌分类、发光免疫和抗菌素浓度测定上的应用以往的发光细菌分类研究结果表明,海洋发光细菌主要分为3个属,分别是:发光杆菌属(Photobacterium)、弧菌属(Vibrio)和异短杆菌属(Xenorhabdus)。发光细菌的分类鉴定按常规方法进行比较繁琐,往往需要做大量的生理、生化特征实验,而这些实验既费时又费力。在发光细菌分类中,还可利用发光细菌的发光光谱作为分类的重要特征,用荧光分光光度计测定发光细

20、菌的发光光谱就简便多了。如前面提到的,朱文杰等对海洋发光细菌的生物光谱研究表明,由于发光细菌有种属特异性,因而发光光谱可作为发光细菌分类的重要特征。又如汪杰等对发光细菌发光的一、二阶微分光谱的检测结果表明,不同种的发光细菌的微分光谱有显著差异,同一种菌的不同菌株则无显著差异,表明生物发光光谱,微分光谱可作为发光细菌菌种分类的特征。也就是说,依赖生物发光光谱及其微分光谱,不仅在发光细菌属的认定上有帮助,还可以区分不同的菌种。不同菌种有其自身的光谱特征参数,因而研究其光谱特征,可以在发光细菌分类中找到简便有效的方法。在生物发光分析技术应用研究方面,由于发光测量具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、反应

21、速度快、使用方便等优点,在免疫学、微生物学、生物化学、临床检验、病毒学等得到了广泛应用。如Edward Jablonski19细菌荧光素酶类制品结合免疫测定法应用于风疹抗体检测。利用生物发光反应的辅助因子标记抗原或抗体,免疫后,运用生物发光反应进行检测。免疫检测中进行标记物的超灵敏检测已经得到广泛应用。生物发光反应也已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法,作为一种新的生物技术工具,生物免疫检测具有一个光明的前景,已有多种双功能生物发光分子被准备应用到免疫检测中。同时,还可以发光细菌的发光强度为指标去定量抗菌素的效价。如朱文杰等20“海洋发光细菌快速测定四环素效价的方法研究”中表明,目前用微生物

22、测定抗菌素效价很费时,操作也较繁琐,四环素效价的测定亦然。试验证明了,四环素对明亮发光杆菌A2发光的影响是在低浓度时刺激发光,较高浓度时则抑制发光,在短时间内,所用的四环素浓度跟抑制发光的效应呈现依存关系。据此,利用发光细菌可以快速测定四环素的效价。还有生物发光技术在ATP水平测定中的应用,所有活细胞都含有ATP,ATP可以从细胞中提取出来,用荧光素酶检测,并进行生物数量评估,如微生物学家通过检测ATP的量测定土壤或沉积物中的全部活微生物含量。4.3在水下通讯探测和水色遥感上的应用舰船在发光水域航行,会留下曳光,使海面战舰夜间暴露航踪。在海洋中潜艇的行驶使其身后的海水形成涡流,激使发光细菌的生

23、物发光勾画出潜艇涡动的光尾流,潜艇光尾流是发光细菌对涡流应力搅动的一种应激反应。利用潜艇光尾流现象可对潜艇进行跟踪探测。王江安等9在“潜艇光尾流产生机理及其探测技术研究”一文中就论述了这一应用前景。水下潜艇之间用光波进行通讯或者水下潜艇与水面舰艇间的光通讯、水下光探测、照相等都可能对海洋发光细菌对光的吸收及细菌发光产生影响。尤其,水下通讯与探测多用蓝绿光,这种波段最易透过水层,但它也正好与发光细菌发出的光谱吻合,最可能成为水下光通讯与探测的干扰源。蓝绿光也是海洋水色遥感的重要工作波段,当海面存在大量发光细菌时,其产生的“弥漫型”发光也可能对海洋水色遥感信息产生影响,如何消除或减小这类干扰是相关

24、应用技术研究中需解决的问题。5结论海洋发光细菌发光特性研究的应用前景,近期主要集中在水下探测、环境污染监测、发光细菌分类及抗菌素浓度测定等方面;应用研究的深度也有进展,已由一般的应用可能性研究,进入生物传感器研制阶段。而发光特性的应用研究离不开对细菌发光特性的深入了解,海洋发光细菌发光特性的研究涉及微生物学、生物化学、海洋光学等第2期张进兴,等:海洋发光细菌的发光及其应用171学科,研究内容较为广泛且相互交叉、相互渗透。因此,不仅需要在微生物学和生物化学方面进行研究,从海洋水体光学性质上,进行系统、深入的研究也是十分必要的。对发光特性的深入研究,有可能发现新的应用前景,扩展应用领域,为应用技术

25、研究打下更坚实的基础。参考文献: 1 KudryashevaN S, Nemtseva E V, Sizykh A G,et al.Estimation of energy of the upper electron-excited states of thebacterial bioluminescent emitter J.J. Photochemistry andPhotobiologyB:Biology, 2002,68(2-3): 88-92. 2 EdwardAMeighen. Autoinduction of lightemission in differentspecies o

26、fbioluminescentbacteria J.Lumin., 1999,14(1): 3-9. 3 ZhuWenjie, He Xuemin, Yang Yikang. Bioluminescent emission spectra ofmarine luminous bacteria J.Chin. J.Lumin.(发光学报), 1986,7(1): 127-132 ( in Chinese). 4 Du Zongjun, WangXianghong, LiHaifeng,et al.The study and application luminescentbacteria J.Hi

27、gh TechnologyLett.(高技术通讯), 2003,12: 103-106 ( in Chinese). 5 KarataniH, Konaka T, Katsukawa C. Properties of the bimodal fluorescent protein produced by photobacterium phos-phoreum J.Photochemistry andPhotobiology,2000,71(2): 230-236. 6 Zhu Wenjie, He Xuemin, Huang Shaohua,et al.Bioluminescence of v

28、ibrio: Orientalis in vitro: Decanal initiatedbioluminescence J.ActaMicrobiologica Sinica(微生物学报), 1991,31(2): 122-127 ( in Chinese). 7 Wang Jie, ZhuWenj.i The derivative spectra of bioluminescence of fore species luminous bacteria J.J. East ChinaNormalUniversity (NaturalScience)(华东师范大学学报,自然科学版), 1998

29、,1: 89-91 ( in Chinese). 8 Du Zongjun, Wang Xianghong, LiHaifeng,et al.Isolation and identification of aluminous bacterium D40 and prmarystudies on its luminescent conditions J.Transaction ofOceanology and Limnology(海洋湖沼通报), 2003,2: 58-63( in Chinese). 9 KarataniH, Chiba T, Hiayama S·Relationsh

30、ip between spectral distribution of vibrio fischer strain Y1 bioluminescenceand intracellular level of its fluorescent proteins A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld Scientific Publishing, 81-84.10 Miyamoto C, Lin Ly, Huang S-Y,et al.Effect SAM-relat

31、ed structural and regulatory proteins on luminescence in vibrioharveyi A.Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and CurrentApplicationsC. 2002 byWorld ScientificPublishing, 93-96.11 Wang Jiangan, Zong Siguang·The study engendermechanism of submarine ray track and detect ability J·L

32、aser andInfrared(激光与红外), 2003,33(4): 280-282 ( in Chinese).12 Mao Canquan, Yang Shude. Evaluation and application of the luminous bacteria on lux report gene system J.Micro-biology(微生物学通报), 2000,2(4): 297-299 ( in Chinese).13 Zhang Jume,i Wu Qingping, Zhou Xiaoyan,et al.Advances in luciferse researc

33、h J.Microbiology(微生物学通报),2001,28(5): 98-101 ( in Chinese).14 Huang Zeng, Wang Jialing. Physiologicalproperties of luminescentbacteria and its application in environmentalmonitoringJ.EnvironmentalScience(环境科学), 1995,16(3): 87-90 ( in Chinese).15 Xue Jianhua, Wang Junhu,i Huang Chunnong. Study on appl

34、ying photobacteria to pollution monitoring ofwater environ-ment J.Bulletin ofScience andTechnology(科技通报), 1998,14(5): 339-342 ( in Chinese).16 WuWe,i XiXinwe,i Hu Gengqing,et al.Application of luminescent bacteria in rapid determination of acute toxicity ofthe pollutants in the fisherieswater J.J. Z

35、hanJiang Ocean University(湛江海洋大学学报), 1998,18(2): 22-24( in Chinese).17 Lin Zhifen, Yu Hongxia, Xu Shifen,et al.Modification of the photobacterium phosphoreum toxicity testmethod J.EnvironmentalScience(环境科学), 2001,22(2): 114-117 ( in Chinese).18 Huang Zeng, WangYazhou. The application ofbacterial lum

36、inescent biosensor in rapid determination of acute toxicity ofpollutants J.EnvironmentalScience(环境科学), 1997,18(1): 14-16 ( in Chinese).172发光学报第28卷19 Edward Jablonski·The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibodydetection J.AnalyticalBioch

37、emistry, 1985,148(1): 199-206·20 ZhuWenjie, YangYikang·A quick assay for tetracycline J.Marine Sciences(海洋科学), 1985,9(1): 48-51( inChinese).Application ofLum inescence of theM arine Lum inous BacteriaZHANG Jin-xing, PANG Ai-me,i SUN Xiu-qin, SUN Pei-guang(First Institute ofOceanography, St

38、ateOceanicAdministration People sRepublic ofChina, Qingdao266061, China)Abstract:Marine luminous bacteria, heterotrophic bacteria give outvisible light in normalphysiological con-dition. Many study results show that the luminescencemechanisms ofvariety luminous bacteria are the same.The light-emitti

39、ng in bacteria involves the oxidation of reduced riboflavin phosphate (FMNH2) and a long-chain fatty aldehyde with the emission of blue-green ligh.t The enzymes that catalyze the bioluminescencereaction in these organisms are called luciferases, and inmostcases the substrates are designated as lucif

40、erins.However, consistentwith the apparent absence of strong evolutionary relationship between many of the light-emitting systems, significantdifferences existbetween the bioluminescence reactions aswell as the structuresof the luciferases (enzymes) and luciferins (substrates) from different organis

41、ms. The luminescent characte-ristics ofmarine luminous bacteria connectwith material structure in the bacteria, marine environment ele-ments and pollutants in the seawateretc, the connectstudy includes thatspectrum property, light-emitting in-tensity, light-emitting characteristic parameter, light-e

42、mitting conditions and the structure of luciferases fromdifferent luminous bacteria. Thorough understanding these properties ofmarine luminous bacteria and carryingout the study ofapplication can supply effectivemethods for the application of the property ofmarine luminousbacteria, and promote compr

43、ehensive researches on ocean biology, ocean optics and biochemistry, and showthe feasibility ofphysics researches onmarine luminous bacteria. And the predictions show the concentrationand toxicity ofpollutants in thewater is determined by luminescent intensity of luminous bacteria, the subma-rine sa

44、iling exits the whirlpool and the luminescent bacteria bioluminescentmakes the whirlpool to be a raytrackwhich can be used to detect submarine, the luminescent characteristics can also be used to improve inthe underwater lightcommunications and exploring, oceanwater color remote sensing, bacterial c

45、lassificationbioluminescent immunity and antibiotic concentration determinationetc.In this article, important significanceof the study on luminescent characteristic ofmarine luminous bacteriawas clarified and reference is given forfurther developing.Key words:marine luminous bacteria; luminescent ch

46、aracteristic; application studyReceived date: 2006-08-25第28卷第2期2007年4月发光学报CHINESE JOURNALOF LUMINESCENCEVol·28 No·2Apr., 2007文章编号: 1000-7032(2007)02-0167-06海洋发光细菌的发光及其应用张进兴,逄爱梅,孙修勤,孙培光(国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061)摘要:海洋发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见光的异养细菌,其发光特性与细菌体内的物质结构、海洋环境要素、水中污染物等多种因素有关。通过对海洋发光细菌发光

47、特性及其应用可能性的论述,如利用发光细菌的发光强度与水中毒物的浓度、毒性的关系检测污染物;利用潜艇航行时激发的生物发光勾画出潜艇涡动的光尾流可跟踪探测潜艇;海洋发光细菌的发光特性还可用以改进水下光通讯与探测、海洋水色遥感、海洋发光细菌分类、发光免疫和抗菌素浓度测定等方面。阐明海洋发光细菌发光特性的重要研究意义并为进一步开展应用研究提供借鉴。关键词:海洋发光细菌;发光特性;应用研究中图分类号:O482. 31PACC:3250F; 7860P文献标识码:A收稿日期:2006-08-25;修订日期:2006-11-24基金项目:国家科技基础条件平台项目(海洋微生物菌种种质资源标准化整理整合与共享)

48、(2004DKA30640);国家908项目(我国近海海洋综合调查与评价)基金资助项目作者简介:张进兴(1954-),男,山东潍坊人,研究员,主要从事应用微生物学的研究。E-mai:l zhangjx fio. org. cn, Te:l (0532)889674491引言海洋发光细菌的发光现象一直是人们十分关注的问题,各国科学家对此进行了多方面的调查研究。国内对海洋发光细菌发光的观测研究已有多年历史。在国标海洋调查规范中,早已把“海发光”列为海洋调查内容,其中“弥漫型”海发光便是由海洋发光细菌产生的,作为常规海洋观测项目之一,已积累了许多现场观测资料。近年来,由于实际应用的需要,对海洋发光细

49、菌的观测研究有所加强,如现正进行的西北太平洋环境调查研究项目中,就包含了海洋发光细菌的分布调查。有关海洋发光细菌的研究内容相当广泛,从近期国内外发表的文献资料看,主要有海洋发光细菌的发光机理,发光基因、荧光素酶、发光特性以及某些应用方法等研究。在发光特性研究方面,以往更多地侧重于细菌发光与其体内物质、结构关系的研究,即侧重于微生物学和生物化学方面的研究,而在环境要素和细菌种类、密度等对细菌光谱的影响方面的研究相对较少。在海洋发光细菌的研究中,发光特性及其应用研究是一项重要内容。利用细菌的发光特性,开展应用研究,尤其结合光学原理,制作某些传感器,用于海洋环境污染监测,已引起国内外广泛重视。为了研

50、究海洋发光细菌发光特性的应用前景,首先必须深入了解海洋发光细菌的性质,积累发光细菌发光特性的基础资料和研究经验。然后,依据细菌发光的不同特性和应用可能性,开展相应的应用研究。此类研究不仅可为细菌发光特性的应用提供有效方法,并将促进海洋生物学、海洋光学、生物化学之间交叉学科综合研究的发展,为从物理学角度研究海洋发光细菌提供依据。为此,本文拟在简要综述海洋发光细菌的分布特点与发光机理研究基础上,论述发光特性及其在海洋环境污染物监测、发光细菌分类、水下通讯探测和水色遥感上的应用研究现状,为进一步开展海洋发光细菌发光特性的应用研究提供借鉴。2分布特点与发光机理海洋发光细菌是一类从海水中或者从海洋动物体

51、表、消化道和发光器官上以及海底沉积物中可以分离到的,在适宜条件下能够发射可见光的异养细菌。海洋中的发光细菌,除了在海水中自由浮游生存的外,还有寄生于其他海洋生物体的。许多海洋生物的发光与发光细菌有关,如某些鱼类、软体动物等的发光是由海洋发光细菌寄生、共168发光学报第28卷栖生存所致。海洋发光细菌的种类不是很多,但其分布却非常广,从海表层至深海;从热带海洋至非常寒冷的极地海域都有其踪迹。为了更好地掌握海洋发光细菌的发光特性及应用可能性,除需要了解发光细菌的分布特点外,也有必要对发光细菌的发光机理作简要介绍。发光机理的研究结果表明,不同种类的发光细菌其发光机理是基本一致的,都必须有细菌荧光素酶(

52、LE)、还原性的黄素单核苷酸(FMN·H2)、氧气(O2)、长链脂肪醛(RCHO)的参与,大致历程如下:FMNH2+LEFMNH2·LE +O2LE·FMNH2·O2+RCHOLE·FMNH2·O2·RCHOLE·FMN+H2O+RCOOH+光概括地说,细菌生物发光反应是由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸(FMN)及长链脂肪酸,同时释放出蓝绿光。发光细菌发出的光是连续的,属“冷光”。这是一种化学发光类型,在化学能转换为辐射能的过程中发光。荧光素酶是菌体内催化荧光素或脂

53、肪醛氧化发光的一类酶的总称,细菌荧光素酶是含、两个多肽亚基的单加氧酶,只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋发光细菌中提取的细菌荧光素酶其分子量差别较小。由于海洋发光细菌发光细胞内含有荧光素和荧光素酶,有了氧气,细胞内的荧光素就受到荧光素酶的催化作用而吸收能量,变成氧化荧光素并释放光子而发光。不同种类的海洋发光细菌可产生不同的荧光素酶,发光特性也不同。3发光特性研究海洋发光细菌的发光特性研究,包括不同菌种所具有的特异光谱特性研究,发光强度、发光特征参数和发光条件对细菌发光的影响等项研究,以及不同种类的发光组分和酶结构的差异研究。各种生物发光的本质大体一样,都是由一组化合物荧光酶和高能化合物腺苷

54、三磷酸等构成发光光源。它们发出的蓝、青、绿、黄、橙等不同颜色的光,是因为各自的荧光素、荧光酶在结构上的微小差异引起的。发光细菌的光谱范围约420670 nm,max在475485 nm左右,为单一发射峰,max和半峰全宽有种属差异。从发光特征参数发光量子产率来看,其生物发光反应特点是高光子产生效率: 0. 50. 8。通过发射光的比率可以推出未知成分的浓度,因此测定化学反应过程中的发射光是非常有用的。反应过程中产生的光与发射光的量子产率是直接相关的,与相应的发光物质的浓度成比例。因此,反应过程中的光可以相对反映出目标样品中发光物质的量。有关生物发光共振能量转移是指在一个发光或荧光供体和一个荧光

55、受体(如绿色荧光蛋白的突变体GFP)之间会发生能量转移。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质-蛋白质之间的相互作用。如Kudryasheva等1研究了细菌生物发光电子激发态上限能量估算,用染色分子作为能量接收者,证实了细菌生物发光电子激发态上限活动的假设。并给出了MSB(Methylstyryl benzene)中的偶联酶系统NADHFMN-氧化还原酶-荧光素酶的细菌发光光谱。从已有的实验研究结果看,大多数发光细菌的发光,仅发生于高细胞密度,细菌发光依赖于培养体系中诱导蛋白的浓度和积累。细菌种类和生长条件,包括温度、盐度和营养成分以及其他实验条件对其发光也有影响2。在正常的生理条件下,发光细菌能发出波长为450490 nm的蓝绿光;在一定的试验条件下,发光强度是恒定的3。但也有学者研究发现,发光杆菌属经某种处理后其发光光谱产生位移,如HajimeKaratani等4在由发光杆菌发光现象产生的两种荧光蛋白质的特性研究中,发现从深海发光细菌中分离的荧光蛋白质中,发光杆菌属经提纯、克隆和排序出两种荧光蛋白质,最大发射的荧光波长在488, 517 nm。在尿素