实验十植物组织的继代培养与观察

1、实验十 植物组织的继代培养与观察一、实验目的一、实验目的1.1.学习植物愈伤组织的继代培养方法学习植物愈伤组织的继代培养方法。2.2.分析之前培养实验材料出现污染的分析之前培养实验材料出现污染的原因。原因。植物组织培养类型植物组织培养类型 （按外植体）：（按外植体）：1. 1. 器官培养器官培养2. 2. 茎尖分生组织培养茎尖分生组织培养 3. 3. 愈伤组织培养愈伤组织培养4. 4. 细胞培养细胞培养5. 5. 原生质体培养原生质体培养胚状体：胚状体：指由体细胞诱导分化出的胚芽、胚根、指由体细胞诱导分化出的胚芽、胚根、 胚轴的胚状结构。胚轴的胚状结构。外植体培养发育方向：外植体培养发育方向：

2、v腋芽萌发（定芽）腋芽萌发（定芽）v脱分化后产生胚状体（原球茎）脱分化后产生胚状体（原球茎）v脱分化后直接产生不定器官脱分化后直接产生不定器官建立悬浮系或建立悬浮系或分化胚状体及分化胚状体及不定芽不定芽 脱分化后形成愈伤组织脱分化后形成愈伤组织间接离体繁殖间接离体繁殖直接直接离体离体繁殖繁殖n愈伤组织培养：愈伤组织培养： 将外植体（将外植体（explautexplaut）在无菌条件下接种到培养在无菌条件下接种到培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 原理：原理：n 细胞全能性（细胞全能性（cell totipetencycell tot

3、ipetency）：）：植物细胞具有全套植物细胞具有全套遗传信息，在特定环境条件下能进行表达，而产生一个遗传信息，在特定环境条件下能进行表达，而产生一个独立完整的植株个体。独立完整的植株个体。 脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细胞的分裂活性。胞的分裂活性。 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转变为各种不同细胞类型的过程。变为各种不同细胞类型的过程。一一 愈伤组织形成的条件愈伤组织形成的条件n 1 1、脱离母体植株：摆脱了原来所受到的遗传上的、脱离母体植株：摆脱了原来所受到的

4、遗传上的控制和生理上的制约；控制和生理上的制约；n 2 2、一定的培养条件：主要为激素的种类和浓度最、一定的培养条件：主要为激素的种类和浓度最为重要；为重要； n 3 3、内源激素水平：外植体的类型和外植物体原来、内源激素水平：外植体的类型和外植物体原来在植株上所处的位置。在植株上所处的位置。n 大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。能产生愈伤组织。二愈伤组织形成的过程二愈伤

5、组织形成的过程n 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期分为三个时期: :诱导期分裂期形成期n 分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期n 分裂期主要特征如下：分裂期主要特征如下： 1. 1.细胞的数目迅速增加，但平均鲜重下降细胞的数目迅速增加，但平均鲜重下降。 2. 2.细胞体积小，无液泡细胞体积小，无液泡。如同根尖和茎尖的分生组。如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。织细胞特性。 3. 3. 细胞的核和核仁增大到最大细

6、胞的核和核仁增大到最大。 4 4细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不变含量保持不变。 n 诱导期：细胞分裂的准备期诱导期：细胞分裂的准备期n 特点：特点：n 1 1、细胞大小没有多大变化，外观无明显特征、细胞大小没有多大变化，外观无明显特征；n 2 2、细胞内物质代谢旺盛，、细胞内物质代谢旺盛，RNARNA含量迅速增加，含量迅速增加，细胞核体积明显增大。细胞核体积明显增大。n 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要天

7、，新鲜的菊芋块茎则只要2222h h，但菊芋块茎但菊芋块茎经过经过5 5个月的贮藏后，诱导期则须延长到个月的贮藏后，诱导期则须延长到4040h h以以上。上。n 形成期形成期( (分化期分化期) )：是指外植体经过诱导期和分裂：是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器期后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器官的时期。官的时期。 主要特征如下：主要特征如下：n 1 1、细胞的平均大小相对稳定。、细胞的平均大小相对稳定。n 2 2、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织内、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂。部较深层局部细胞的分裂。

8、n 3 3、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心。n 4 4、形成维管组织结节。由分生组织结节外围的细胞、形成维管组织结节。由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。n 5 5、形成不同形态和功能的细胞。因此有人又将此期、形成不同形态和功能的细胞。因此有人又将此期称为分化期。称为分化期。 愈伤组织的继代培养愈伤组织的继

9、代培养 继代：将培养物转移到新鲜培养基上继续培养的继代：将培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程。过程。 目的：愈伤组织始终处于旺盛的分裂期目的：愈伤组织始终处于旺盛的分裂期n 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构

10、。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持构。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。在不分化的增殖状态。优良的愈伤组织的优良的愈伤组织的 特点特点n 1 1、高度的胚性或再分化能力、高度的胚性或再分化能力以便从这些愈伤以便从这些愈伤组织得到再生植物。组织得到再生植物。n 2 2、容易散碎、容易散碎以便用这些愈伤组织建立优良的以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。质体。n 3 3、旺盛的自我增殖能力、旺盛的自我增殖能力以便用这些愈伤组织以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。建立大规模的愈

11、伤组织无性系。n 4 4、经过长期继代保存而不丧失胚性、经过长期继代保存而不丧失胚性以便有可以便有可能对它们进行各种遗传操作。能对它们进行各种遗传操作。三三 愈伤组织的形态发生方式愈伤组织的形态发生方式 n 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。态建成，可再产生完整的植株。n 愈伤组织形态发生方式有两种：愈伤组织形态发生方式有两种： 1 1不定芽方式（不定芽方式（unfixed budunfixed bud） 2 2胚状体方式（胚状体方式（somatic embryosomatic embryo） 1 1不定芽方式（不定芽方

12、式（unfixed budunfixed bud）指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株的器官发生方式。有三种方式：植株的器官发生方式。有三种方式：n （1 1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况长出根而形成小植株，多数植物属这种情况n （2 2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；于单子叶植物；n （3 3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽

13、）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。和根，然后两者结合起来形成一株小植株。2 2胚状体方式（胚状体方式（somatic embryosomatic embryo） 指由愈伤组织培养物诱导分指由愈伤组织培养物诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株的方式。构，进而长成完整植株的方式。 四愈伤组织形态发生的调控四愈伤组织形态发生的调控 愈伤组织的形态发生，主要受三大类因素愈伤组织的形态发生，主要受三大类因素的调控：的调控：n外植体本身外植体本身n培养基培养基n培养环境培养环境（一）材料本身（一）材料本身 n 1

14、1遗传型遗传型 不同植物种类的器官分化能力明显不同不同植物种类的器官分化能力明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。n 2 2器官和部位器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和

15、小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。n 3 3生长年龄生长年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈往上部，苗的分化频率越高。器官形成频率低，愈往上部，苗的分化频率越高。n（二）培养基（二）培养基 生长调节剂：生长调节剂： 细胞分裂素细胞分裂素/ /生长素的比例是控制芽生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一。和根形成的重要条件之一。n

16、激素控制理论：细胞分裂素激素控制理论：细胞分裂素/ /生长素比例高时有利于生长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化。组织的器官分化。n 不同激素的效果是不同的不同激素的效果是不同的: :如如NAANAA对生根的作用比对生根的作用比IAAIAA和和IBAIBA的效果好，但用的效果好，但用IAAIAA和和IBAIBA处理，产生的根比较处理，产生的根比较健壮，而用健壮，而用NAANAA处理，产生的根则较纤细。处理，产生的根则较纤细。

17、2 2，4-4-D D往往往利于愈伤组织的诱导。往利于愈伤组织的诱导。愈伤分化愈伤分化n（二）培养基（二）培养基n 2 2无机营养元素无机营养元素 在植物组织培养，细胞的生长也要求满足在植物组织培养，细胞的生长也要求满足植物生长的必要元素。植物生长的必要元素。 - -其影响不如激素的影响明显。其影响不如激素的影响明显。 - -各种类型的植物所需要的每种元素的量，特别是大各种类型的植物所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以常用所以常用1/21/2MSMS或或WhiteWhite。n 愈伤组织所表现

18、出来的缺素症状如下：愈伤组织所表现出来的缺素症状如下：n 氮氮某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色；不能形成导管。色素苷的颜色；不能形成导管。n 氮、钾和磷氮、钾和磷细胞过度生长，形成层组织减退；细胞过度生长，形成层组织减退；n 硫硫非常明显地褪绿。非常明显地褪绿。n 铁铁细胞分裂停止。细胞分裂停止。n 硼硼细胞分裂停滞，细胞伸长。细胞分裂停滞，细胞伸长。n 锰或钼锰或钼影响细胞伸长。影响细胞伸长。n（二）培养基（二）培养基n3 3有机成分有机成分 糖、糖、B B族维生素、肌醇和甘氯酸等族维生素、肌醇和甘氯酸等满足愈满足愈伤组

19、织的生长和分化的要求。伤组织的生长和分化的要求。氯基酸和嘌氯基酸和嘌 呤、嘧啶类物质呤、嘧啶类物质促进器官分促进器官分化。如：水解酪蛋白中含有多种氨基酸，化。如：水解酪蛋白中含有多种氨基酸，在进行器官分化培养时，加入一定量是有在进行器官分化培养时，加入一定量是有益的。益的。n（二）培养基（二）培养基4 4 物理性质：固体或液体状态、渗透压等。物理性质：固体或液体状态、渗透压等。 对形态发生有明显的影响。对形态发生有明显的影响。培养基状态：培养基状态：第一阶段诱导形成愈伤组织第一阶段诱导形成愈伤组织固体培养基固体培养基第二阶段细胞和胚状体的增殖第二阶段细胞和胚状体的增殖液体培养基液体培养基第三阶

20、段胚状体发育成可移植植株第三阶段胚状体发育成可移植植株固体培养固体培养基基培养基渗透压：培养基渗透压： 对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。如油菜花药培养宜先在高糖（影响。如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%9-10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。成。n（三）培养环境条件（三）培养环境条件1.光周期的影响光周期的影响 ：根据植物种类、培养目的来决：根据植物种类、培养目的来决定定在愈伤组织诱导阶段：一般采用三种做法：全在愈伤组织诱导阶段：一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。暗、周期性

21、光照、散射性光照。 对一些植物三种培养方法结果差异较大。如对一些植物三种培养方法结果差异较大。如：石刁柏全暗：石刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多；大豆散射性光照光照下好得多；大豆散射性光照愈伤组织愈伤组织诱导比较好。诱导比较好。器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。 光周期长短因植物种类而异，多数植物光周期长短因植物种类而异，多数植物8-10小小时黑暗为宜。也有例外，有些植物如石刁柏需时黑暗为宜。也有例外，有些植物如石刁柏需要要16小时光照，小时光照，12小时黑暗。小时黑暗。n（三）培养环境条件（三）培养环境条件2

22、2、温度、温度 一般为一般为22-2522-25的恒温进行培养。的恒温进行培养。喜温性植物：喜温性植物： 26-28 26-28 茄科、葫芦科、兰科茄科、葫芦科、兰科、禾本科等。、禾本科等。冷凉性植物：冷凉性植物： 25 25以下以下 百合科、十字花科、百合科、十字花科、菊科等。菊科等。培养周期中的昼夜温差影响：国内有关小麦、水培养周期中的昼夜温差影响：国内有关小麦、水稻花药培养温度试验的报道认为：稻花药培养温度试验的报道认为：n 诱导花形成愈伤组织诱导花形成愈伤组织昼夜恒温较好；昼夜恒温较好；n 器官分化器官分化昼夜具有一定温差比较好，分化出昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株比较健壮。的

23、小植株比较健壮。 （三）实验材料和用具（三）实验材料和用具 实验材料：兰花的不定芽实验材料：兰花的不定芽实验药品：实验药品：n MSMS、 1mg/ml NAA 1mg/ml NAA 、 1mg/ml 6-BA 1mg/ml 6-BA、 1mol/L 1mol/L HClHCl、1mol/L NaOH1mol/L NaOH、蒸馏水、灯用酒精、蒸馏水、灯用酒精、7070酒酒精。精。灭菌培养基：灭菌培养基：nMS4MS4、 MS7MS7和和MS8MS8实验用具：实验用具：n 天平、烧杯、玻璃棒、量筒、移液枪、三角瓶、天平、烧杯、玻璃棒、量筒、移液枪、三角瓶、pHpH试纸、电炉、高压灭菌锅。试纸、电

24、炉、高压灭菌锅。n 无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、镊子、剪刀、无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、滴管、记号笔、废液罐、火酒精灯、酒精棉花、滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。柴、光照培养箱。（四）实验步骤（四）实验步骤 1.1. 配制以下培养基各配制以下培养基各100ml 100ml ：n MS8MS8：MS+2.0mg/L NAAMS+2.0mg/L NAAn MS9MS9：MS+3.0mg/L 2,4-D+3.0mg/L KTMS+3.0mg/L 2,4-D+3.0mg/L KT 取取200ml200ml烧杯烧杯2 2只，标记，各加入只，标记，各加入4g MS4g MS培养基培养基和和100ml100ml蒸馏水，加热直至完全溶解。蒸馏水，加热直至完全溶解。 MS8MS8加入加入 1mg/ml NAA 200l 1mg/ml NAA 200l ，并不断搅拌。