从鱼肉中提取DNA并提取其含量(精)

1、从鱼肉中提取 DNA 并测定其含量一、实验目的1、 了解用盐溶法从生物组织中提取 DNA 的原理。2、 学会从动物组织中提取 DNA 的操作技术。3、学习和掌握测定 DNA 的定糖法(二苯胺法)的原理和操作技术。二、实验原理在浓氯化钠(12mol/L )溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋 白的溶解度很小，在稀氯化钠(0.14 mol/L )溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很 小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖 核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得的核蛋白用 SDS (十二烷基硫酸钠)处理，DNA 或(RNA)即与蛋白质 分开，可用氯仿一

2、异戊醇将蛋白质沉淀除去，而 DNA 则溶解于溶液中。向溶液中 加入适量乙醇，DNA 即析出。为了防止 DNA 或(RNA)酶解，提取时加入 EDTA (乙二胺四乙酸)脱氧核糖核酸中的a兑氧核糖在酸性环境中变成 羟基一丫酮基戊醛与二 苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在 595nm 处有最大的吸收，在每毫升含 DNA20400微克范围内，光密度与 DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙 醛，可以提高反应的灵敏度。除 DNA 夕卜，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。三、实验试剂(1) 0.14mol/L 氯化钠-0.05mol/LpH7.0 柠檬酸钠缓冲液 先配制 0.05mol/LpH7.0

3、柠檬酸钠缓冲液， 再称取一定量固体氯化钠溶于此缓冲液中。 使最终氯化钠浓度为 0.14mol/L。(2) 1 mol/L 氯化钠溶液。(3) 氯仿-异戊醇混合液。(4) 80 %、90 %乙醇及无水乙醇。(5) 二苯胺试剂：称取 1 克结果的二苯胺试剂溶于 100 毫升分析纯的冰醋酸中， 再加入 10 毫升过氯酸(A.R60%以上)或浓硫酸 2.75 毫升， 混匀备用。 临用前加 入 1 毫升 1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液 应为无色。四、实验器具解剖器具、玻璃匀浆器、普通离心机、培养皿、量筒（ 50ml、100ml）;烧杯（100ml、250ml）、磨口试

4、剂瓶（150ml）、滴管、玻璃棒、台秤、真空干燥器、 鱼肝脏、试管及试管架、移液管（1, 2, 5 毫升）、恒温水浴、可见光分光光度计五、实验过程DNA 提取操作步骤（1）将活鱼杀死后，迅速取出肝脏，置于冰浴中的培养皿中，剔除结缔组织，用 少量冰冷的 0.14mo l/L 氯化钠-0.05mol/LpH7.0 柠檬酸钠缓冲液洗去血污，用滤纸吸干后称重，约取 20g 剪碎后置玻璃匀浆器中，加入相当于 2 倍干重的冰冷的 0.14mol/L 氯化钠-0.05mol/LpH7.0 柠檬酸钠缓冲液，在冰浴中反复研磨，制成细胞 匀浆。（2）将肝脏细胞转移至离心管中，以三千转每分钟离心十五分钟，弃去上清液

5、， 所得沉淀再用两倍质量的 0.14mo l/L 氯化钠-0.05mol/LpH7.0 柠檬酸钠缓冲液研磨并如前离心两次。（3） 讲细胞核沉淀转移到 100ml 烧杯中，加入 6 倍质量的 1 mol/L 氯化钠溶液， 充分搅匀，置于冰箱中过夜，可得到半透明的粘稠状液体，将下层沉渣弃去。用滴 管慢慢滴入 11 倍体积的冰冷蒸馏水中，此时有白色丝状物（DNA 核蛋白）析出， 用玻璃棒搅起，沥干水分，再溶于八倍质量的1 mol/L 氯化钠溶液中，迅速搅拌加速溶解。（4） 将上述溶液导入巨磨口塞的 250ml 试剂瓶内，再加入等体积的氯仿-异戊醇 混合液，剧烈震荡 5 分钟，转移至离心管内，在三千转

6、下离心十五分钟，这时可见 三层。上层是含有 DNA 和 RNA 核蛋白的水层，下层是氯仿-异戊醇有机溶剂层，中间夹着的是变性蛋白质凝胶层。吸出上面的水层，再用氯仿-异戊醇如前进行脱蛋白，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。量取水层体积后再倒入2 倍体积的冰冷的 95%乙醇中，再用玻璃棒搅起白色丝状物（DNA 沉淀），沥干，先用 80%乙 醇洗涤两次，再用无水乙醇洗涤一次，所得 DNA 沉淀置于真空干燥器内干燥，称 重。含量测定操作步骤（一） DNA 标准曲线的制作取 8 支试管，编号，按下表加入试剂管号01234567试剂DNA 标准液00.20.40.81.01.21.62.0蒸馏水21.81

7、.61.21.00.80.40二苯胺试剂44444444加毕，摇匀，于 60C恒温水浴中保温 1 小时，（或于沸水中煮沸 15 分钟，冷 却测0.D595nm 值。）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml）为横坐标，绘制标 准曲线。（二）样品的测定取 2 支试管，各加 0.20.5 毫升的待测液（内含 DNA 应在标准曲线可测范围之 内）加蒸馏水稀释至 2 毫升，再加 4 毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲 线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中 DNA 的百分含量。DNA 含量/毫升待测液二标准曲线查得值 怖释倍数-x 100祈鲜时肝（对”血六、注意事项1、二茉胺法测定 DNA 含量灵敏度不高，待测样品中 DNA 含量低于 50mg/L 即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定 DNA 的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉 伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。2、样品中含有少量 RNA 并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、 芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干