第二章 病原致病基因

1、第二章第二章 病原物致病基因的类型病原物致病基因的类型 胞壁水解酶酶基因、毒素胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因、植物生长调节物质合成有关酶的基因、编码未知产物的基因。基因。 病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移病原菌中还有正向调控寄主范围的基因，将这些基因转移到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互到相关细菌中，可使受体菌扩大寄主范围，使原来的不亲和互作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有作变为亲和互作，这在植物病原细菌的小种和致病变种中都有发现。发现。 目前已报道的有植物目前已报道的有植物病原真菌对植

2、保素解毒酶基因（病原真菌对植保素解毒酶基因（pda）。）。 无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无无毒基因编码特异性激发子与抗病基因产物受体互作。病原无毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作毒基因编码的产物是蛋白质，这些蛋白质有些是直接起激发子的作用，如番茄叶霉病菌的无毒基因用，如番茄叶霉病菌的无毒基因avr9编码编码63个个AA的多肽。而有些的多肽。而有些是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因是编码激发子合成的酶，如番茄丁香假单胞菌的无毒基因avrD的产的产物是物是3.4104u的蛋白，在合成激发子中具有酶的功能。的蛋白，在合成激发子中具有酶的

3、功能。 TMV的外壳蛋白在含有的外壳蛋白在含有N抗病基因的烟草中是过敏反应的激抗病基因的烟草中是过敏反应的激发子；其发子；其avr表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运表型决定因子可能是复制酶蛋白，有些植物病毒的运动蛋白基因也具有无毒基因的功能动蛋白基因也具有无毒基因的功能 （Padgett et al，1993） 。 目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激目前，在植物病原细菌和真菌中都已分离到非寄主专化性的激发子。韦忠民（发子。韦忠民（1993）证明梨火疫病菌）证明梨火疫病菌hrpN的编码蛋白（的编码蛋白（harpin）具有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。具

4、有激发子功能，能诱导非寄主植物产生过敏反应。第一节第一节 植物病毒的侵染过程植物病毒的侵染过程 及其与致病相关基因及其与致病相关基因1.1.植物病毒基因组特征植物病毒基因组特征 以核酸为核心，外被外壳蛋白亚基形成的外壳以核酸为核心，外被外壳蛋白亚基形成的外壳, ,多不具包膜。多不具包膜。 外壳蛋白多为一种，偶尔两种。外壳蛋白多为一种，偶尔两种。 如果外面具有包膜，则结构蛋白往往比较复杂，如植物弹状如果外面具有包膜，则结构蛋白往往比较复杂，如植物弹状病毒有五种结构蛋白；植物呼肠病毒含病毒有五种结构蛋白；植物呼肠病毒含7 7种结构蛋白。种结构蛋白。 植物病毒核酸绝大多数为（植物病毒核酸绝大多数为（

5、+ +）ssRNAssRNA，少数为（，少数为（- -） ssRNAssRNA 、dsDNAdsDNA（double-stranded ）、）、 ssDNAssDNA、 dsRNAdsRNA。 （1）（）（+）ssRNA的植物病毒基因组主要包括的植物病毒基因组主要包括4种类型：种类型：单分体基因组单分体基因组 整套基因的遗传信息储藏在一条核酸分子中。整套基因的遗传信息储藏在一条核酸分子中。 例如例如TMV、PXV、PYV、TYMV、SBMV(南方菜豆花叶）等。南方菜豆花叶）等。两分体基因组两分体基因组 基因组分布在两条核酸上，并被分别包装在两个颗粒中。如烟草环斑病基因组分布在两条核酸上，并被分

6、别包装在两个颗粒中。如烟草环斑病毒毒(TRSV)、石竹环斑病毒、石竹环斑病毒(CRSV)和豇豆花叶病毒和豇豆花叶病毒(CPMV)。三分体基因组三分体基因组 整套基因组分布在整套基因组分布在3-4条核酸中，并分装于三个病毒颗粒中。如条核酸中，并分装于三个病毒颗粒中。如CMV、AMV(苜蓿）、苜蓿）、BMV（雀麦）和（雀麦）和BSMV（大麦条纹），均有（大麦条纹），均有4条，其中条，其中RNA1包装在一个颗粒中，包装在一个颗粒中，RNA2包装在另一颗粒中，包装在另一颗粒中，RNA3+RNA4包装于第三颗包装于第三颗粒中。粒中。多组分病毒多组分病毒 如绒烟斑驳病毒，离体内含线状和环状两种如绒烟斑驳病

7、毒，离体内含线状和环状两种ssRNA，侵染性要求两种同时，侵染性要求两种同时存在。存在。 (2) ssDNA植物病毒植物病毒 最主要的为最主要的为双生病毒双生病毒(Geminiviridae)，也称也称联体病毒，是一类广泛发生在热带、亚热联体病毒，是一类广泛发生在热带、亚热带地区植物上的带地区植物上的,具有两个单链具有两个单链DNA，分别，分别产生蛋白质衣壳，具有孪生颗粒蛋白的单产生蛋白质衣壳，具有孪生颗粒蛋白的单链链ssDNA植物病毒。植物病毒。 该科是植物病毒中惟一具有单链DNA的单分体或二分体基因组病毒。病毒包裹单分子或两分子闭环状ssDNA，每分子DNA长2.53.0kb，总基因长约2

8、.55.2kb。病毒复制是经一个双链复制中间体，通过滚环复制，ssDNA合成起始于基因间隔区的一段保守序列TAATATT/AC，病毒基因双向转录，在基因间隔区具有转录起始点。大多数双生病毒的增殖部位局限于植物韧皮部组织，在细胞核中形成病毒粒子聚集体。 典型的双生病毒为典型的双生病毒为1830 nm，每个单链大小为，每个单链大小为2.53.0 knt。根据基因组结构、寄主范围等根据基因组结构、寄主范围等,可分为玉米线条病毒属可分为玉米线条病毒属(Mastrevirus)主要侵染禾本科、甜菜曲顶病毒属主要侵染禾本科、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、莱豆金黄花叶病毒属，主要侵染双子叶莱豆金黄

9、花叶病毒属，主要侵染双子叶。 玉米线条病毒属和甜菜曲顶病毒属的病毒成员由叶蝉玉米线条病毒属和甜菜曲顶病毒属的病毒成员由叶蝉传播，持久性，但不经卵传染，有单组分基因组；莱豆金传播，持久性，但不经卵传染，有单组分基因组；莱豆金黄花叶病毒属的病毒成员由粉虱传播，含有双组分基因组。黄花叶病毒属的病毒成员由粉虱传播，含有双组分基因组。 (3) dsDNA病毒病毒双链环状双链环状DNA，分子量，分子量5106 u，如花椰菜花叶病毒（如花椰菜花叶病毒（CaMV)，。，。 常可在寄主细胞内堆积，形成内含体。常可在寄主细胞内堆积，形成内含体。(4) dsRNA病毒病毒 基因组有基因组有1012个片段，每段分子量

10、个片段，每段分子量0.81062.6106例如植物呼肠病毒、三叶草伤瘤病毒和水稻普通矮缩病。例如植物呼肠病毒、三叶草伤瘤病毒和水稻普通矮缩病。（5）（）（-）ssRNA病毒病毒 包括弹状病毒科，如莴苣坏死黄花病毒、马铃薯黄矮病毒。包括弹状病毒科，如莴苣坏死黄花病毒、马铃薯黄矮病毒。该该RNA链为非感染性的，没有与核糖体的连接点，或者翻译产物无意义。链为非感染性的，没有与核糖体的连接点，或者翻译产物无意义。以其为模板产生互补的以其为模板产生互补的RNA，起信使，起信使RNA作用。作用。2 2 侵染过程及相关问题侵染过程及相关问题（1）伤口侵入，表皮毛通常为侵染位点，外突原生质连丝）伤口侵入，表皮

11、毛通常为侵染位点，外突原生质连丝可能参与病毒侵入过程。可能参与病毒侵入过程。 （2）通过媒介或人工擦伤的细胞壁来感染）通过媒介或人工擦伤的细胞壁来感染 （3）病毒侵入寄主细胞后，存在脱外壳过程，且脱外壳在）病毒侵入寄主细胞后，存在脱外壳过程，且脱外壳在细胞的不同地方完成。细胞的不同地方完成。 3 病毒的复制病毒的复制病毒的复制是很复杂的问题，不同于真核生物病毒的复制是很复杂的问题，不同于真核生物DNA复制程序。复制程序。一般一种类型的病毒复制以同样的方式进行。一般一种类型的病毒复制以同样的方式进行。（1）ssRNA病毒病毒RNA具有感染性，可起信使具有感染性，可起信使RNA的作用，能翻译产生蛋

12、白，包括复制酶。的作用，能翻译产生蛋白，包括复制酶。复制酶首先合成反平行的互补链，然后再优先复制合成与原始链相同的复制酶首先合成反平行的互补链，然后再优先复制合成与原始链相同的RNA序列。序列。（2）dsRNA病毒病毒类似于类似于DNA基因组病毒，不同于单链基因组病毒，不同于单链RNA病毒，复制酶是病毒粒体的核心病毒，复制酶是病毒粒体的核心组成部分，把核酸上的基因复制成相应的信使组成部分，把核酸上的基因复制成相应的信使RNA，再翻译成蛋白。同时模，再翻译成蛋白。同时模板板RNA 仍配对保持完整。仍配对保持完整。（3）含）含DNA的病毒的病毒进入核内形成微染色体进入核内形成微染色体-转录成信使转

13、录成信使RNA-进入胞浆进入胞浆-翻译成蛋白并反转翻译成蛋白并反转录合成负链录合成负链DNA,-合成正链合成正链DNA-包装形成病毒颗粒包装形成病毒颗粒-转运并传播转运并传播RNA病毒复制模型病毒复制模型1.吸附；吸附；2.侵入；侵入；3.脱壳；脱壳；4.初期翻译初期翻译RNA多聚酶，合成细胞代谢的抑制物；多聚酶，合成细胞代谢的抑制物；5.形成复制型；形成复制型；6.形形成复制中间型；成复制中间型；7.形成子代形成子代RNA；8.翻译晚期蛋白质翻译晚期蛋白质(合成病毒蛋白质合成病毒蛋白质)；9.子代子代RNA与病毒蛋白质与病毒蛋白质装配，形成成熟病毒；装配，形成成熟病毒；10.释放释放(aa表

14、示病毒感染后可见到细胞核的变形表示病毒感染后可见到细胞核的变形)DNA病毒复制模型病毒复制模型1.吸附；吸附； 2.穿入；穿入； 3.脱壳，脱出的脱壳，脱出的DNA向核内移动；向核内移动；4.转录转录mRNA；5.转录转录“早期蛋早期蛋白质白质”；6.复制子代复制子代DNA，合成与转录晚期，合成与转录晚期mRNA；7.带有遗传信息的晚期带有遗传信息的晚期mRNA在在细胞质中移动并翻译病毒蛋白质；细胞质中移动并翻译病毒蛋白质； 8.合成的病毒蛋白质向核内移动；合成的病毒蛋白质向核内移动； 9.病毒病毒DNA和和蛋白质装配形成成熟病毒粒子；蛋白质装配形成成熟病毒粒子；10.细胞崩解，病毒释放细胞崩

15、解，病毒释放 4 病毒蛋白的合成病毒蛋白的合成 通常是利用寄主核糖体系统，翻译病毒专一的通常是利用寄主核糖体系统，翻译病毒专一的RNA（基因组或转录（基因组或转录得到的信使得到的信使RNA),并且基本上都是利用寄主细胞质核糖体，受放线菌酮并且基本上都是利用寄主细胞质核糖体，受放线菌酮抑制。抑制。 5 病毒在植物中的移动和积累病毒在植物中的移动和积累(1)病毒的移动病毒的移动 通过胞间连丝在细胞间移动，通过维管系统从不同组之间转移，但与通过胞间连丝在细胞间移动，通过维管系统从不同组之间转移，但与CP蛋白和运动蛋白有关。蛋白和运动蛋白有关。 (2)病毒的积累病毒的积累 不同病毒在植物中可达的浓度极

16、不相同，并且和寄主植物种类、生长阶不同病毒在植物中可达的浓度极不相同，并且和寄主植物种类、生长阶段、组织部位有关，同时受温度等环境条件影响。段、组织部位有关，同时受温度等环境条件影响。 病毒可以分散在细胞质或者以多种形式聚集。例如各种内含体主要是由病毒可以分散在细胞质或者以多种形式聚集。例如各种内含体主要是由病毒粒体组成。病毒粒体组成。6 6 植物病毒致病相关基因植物病毒致病相关基因6.1 6.1 外壳蛋白基因外壳蛋白基因（coat protein gene） 外壳蛋白对病毒外壳蛋白对病毒RNA具有保护作用，防止病毒具有保护作用，防止病毒核酸被细胞内酶降解。核酸被细胞内酶降解。 外壳蛋白不仅是

17、病毒粒子的结构亚基，同时协外壳蛋白不仅是病毒粒子的结构亚基，同时协同介导病毒的长距离运动。同介导病毒的长距离运动。 会大大提高感染效率和发病程度。会大大提高感染效率和发病程度。有时在非寄主植物和抗性寄主上起无毒基因作用。有时在非寄主植物和抗性寄主上起无毒基因作用。并且并且CP基因可介导植物抗病性。基因可介导植物抗病性。 R.Beachy(1986)首次将首次将TMV 的的CP基因转入烟草，培育出稳定遗基因转入烟草，培育出稳定遗传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少传的抗病毒工程植物以来，已经克隆了至少15个病毒组中个病毒组中30种病毒种病毒的的CP基因，并成功转化了基因，并成功转化了20多种植

18、物，其中一些植株已经进入田间多种植物，其中一些植株已经进入田间试验。试验。 CP基因的抗性机理基因的抗性机理：（：（1）抑制病毒脱壳。（）抑制病毒脱壳。（2）干扰病毒的复）干扰病毒的复制。（制。（3）限制病毒粒子的扩展与运转。（）限制病毒粒子的扩展与运转。（4）CP基因所表达的基因所表达的mRNA与侵入病毒与侵入病毒RNA之间相互作用之间相互作用（RNA介导的病毒抗性介导的病毒抗性）。）。 存在的问题存在的问题（1）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类）多表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少。（型和高抗类型较少。（2）具有潜在危险性。）具有潜在危险性。6.2 6.2 复制

19、酶基因复制酶基因（replicase gene） 病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中病毒编码的复制酶蛋白存在多个保守序列，其中一个是存在于所有一个是存在于所有RNA聚合酶中的聚合酶中的Gly-Asp-Asp（天（天门冬）门冬）三肽基元序列（三肽基元序列（GDD motif）, ,对维持聚合酶对维持聚合酶活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合活性必不可少。另一个保守序列是三磷酸核苷酸结合结构域（结构域（NTP binding domain），在病毒复制时的解），在病毒复制时的解螺旋过程中起重要作用。螺旋过程中起重要作用。 Zaitlin et al(1990)将将TMV的的54K

20、D蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草蛋白基因转入烟草并获得抗性烟草后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒后，国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。的抗性。 复制酶介导抗性的特点：复制酶介导抗性的特点： （1）对完整病毒粒子和裸露病毒对完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。均具有高度抗性。 （2）抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。 （3）抗性持续时间长，并对高温（抗性持续时间长，并对高温（31）不敏感。）不敏感。 （4）具有明显的株专化性。具有明显的株专化性。 抗性机理：抗性机理： （1 1）在蛋

21、白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过在蛋白质水平上，复制酶蛋白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制链和负链复制的平衡或干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径。途径。 （2 2）在在RNARNA水平上，转录出的水平上，转录出的mRNA与病毒的复制酶与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是mRNA诱导了诱导了植物的自然抗性。植物的自然抗性。 缺损型复制酶基因也可以介导抗性缺损型复制酶基因也可以介导抗性。T.M.Anderson

22、 et al (1992)将将TMV Fny株系的株系的RNARNA内部缺失内部缺失94个核苷酸后个核苷酸后导入烟草，结果，缺失造成导入烟草，结果，缺失造成ORF的移码，其翻译产物只的移码，其翻译产物只有完整的有完整的97KD蛋白的蛋白的75左右，但仍然表达对左右，但仍然表达对CMV的高的高度抗性。度抗性。6.3 6.3 运动蛋白基因运动蛋白基因（movement protein gene） 病毒基因编码的基因产物病毒基因编码的基因产物MP能与胞间连丝能与胞间连丝结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以结合，使胞间连丝可以通过物质的孔径增大，以允许病毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从允许病

23、毒粒子或基因组核酸进入邻近细胞中，从而实现病毒在细胞间的运动。而实现病毒在细胞间的运动。 研究证明，完整的研究证明，完整的TMV的的MP基因表达并不能介导抗性基因表达并不能介导抗性的产生。的产生。M. Lapidot et al(1993) & SI Malyshenko et al（1993）将）将TMV的缺陷型的缺陷型MP（dMP）基因转入烟草）基因转入烟草后能获得抗后能获得抗TMV植株，进一步研究表明，转植株，进一步研究表明，转dMP基因的基因的烟草不仅对烟草不仅对TMV，还对其他病毒如，还对其他病毒如CMV、BMV等具有等具有不同程度的抗性。由此可见，各种病毒不同程度的抗性。由

24、此可见，各种病毒MP之间虽然缺之间虽然缺乏同源性，但具有相同的功能。乏同源性，但具有相同的功能。 抗性机制：由于缺陷型抗性机制：由于缺陷型MP与野生型与野生型MP竞争胞间连竞争胞间连丝上的结合位点而实现的。丝上的结合位点而实现的。6.4 6.4 卫星病毒卫星病毒（satellite RNA ） 某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段某些病毒除基因组外，还伴有一些小片段RNA，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，它们本身并没有编码外壳蛋白的遗传信息，称为卫星称为卫星RNA。携带卫星。携带卫星RNA的病毒称为辅助病的病毒称为辅助病毒。迄今已报道有毒。迄今已报道有6组共组共26种植物病毒带有卫星种植

25、物病毒带有卫星RNA。 卫星卫星RNA对植物病毒的影响有对植物病毒的影响有3种表现：种表现：1986年，年，Baulcombe等首次将等首次将CMV的的sat RNA 克隆转入烟草，克隆转入烟草，获得了抗获得了抗CMV的基因工程植株。的基因工程植株。 卫星卫星RNA与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星与病毒基因组争夺病毒复制酶。由于卫星 RNA能更有效地占据能更有效地占据RNA复制酶，而且其分子小、复制酶，而且其分子小、复制周期短，因此，随着复制循环的增加，复制周期短，因此，随着复制循环的增加， sat RNA的复制量远远大于基因组的复制量远远大于基因组RNA复制量，最终是病毒基复制量，最终是

26、病毒基因组的复制受阻。因组的复制受阻。 虽然卫星虽然卫星RNA只需低水平表达，不产生异源蛋只需低水平表达，不产生异源蛋白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，白，但这种抗性仅在侵染晚期发挥作用，而且转基因而且转基因植物体内减轻症状的卫星植物体内减轻症状的卫星RNA有可能突变成加重症状有可能突变成加重症状的卫星的卫星RNA，因此具有一定的潜在危险性。，因此具有一定的潜在危险性。6.5 6.5 核酶基因核酶基因（ribozyme gene） 核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切核酶是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身及其它割自身及其它RNA分子的小分子分子的小分子RNA。广泛存在于。广泛

27、存在于一些类病毒和病毒卫星一些类病毒和病毒卫星RNA序列中。序列中。 根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤根据核酶的结构可分为锤头型和发夹型，其中锤头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生头型核酶较为普遍。人们可根据核酶可切割任何生物的物的RNA，而且对底物作用位点的碱基序列要求不，而且对底物作用位点的碱基序列要求不严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性严格这一特性，设计出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。人工核酶。 目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒（PST

28、V）等的基因组）等的基因组RNA的核酶、能切割苹果的核酶、能切割苹果锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平锈果类病毒的核酶等，但是，在转基因植物水平上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。上的进展缓慢。体内表达不如体外表达有效。 该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细该方法也存在潜在危险性，即核酶可能将细胞胞RNA作为靶作为靶RNA切割而破坏细胞正常功能。切割而破坏细胞正常功能。6.6 蚜传因子蚜传因子 也称辅助因子也称辅助因子(Helper component, 简称简称HC)：在蚜虫传：在蚜虫传播的非持久病毒的寄主细胞中，发现有一种病毒编码的蛋播的非持久病毒的寄主细胞中，发现有一种病毒

29、编码的蛋白（白（HC-Pro)与传毒有关，如除去它，蚜虫也就失去传毒与传毒有关，如除去它，蚜虫也就失去传毒能力，这种辅助因子被称为蚜传因子。能力，这种辅助因子被称为蚜传因子。 最早在马铃薯最早在马铃薯Y病毒侵然的植物中发现，具有协生作用，病毒侵然的植物中发现，具有协生作用，并帮助长距离运输。但辅助因子的作用方式尚未完全明确并帮助长距离运输。但辅助因子的作用方式尚未完全明确。7.TMV基因组及其编码蛋白的功能基因组及其编码蛋白的功能烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）属于烟草花叶病）属于烟草花叶病毒属。该属基因组编码四种蛋白，大小分别为毒属。该属基因组编码四

30、种蛋白，大小分别为126kD、183kD、30kD和和17.5kD. 其中其中126kD和和183kD蛋白参与病毒的复制，称为蛋白参与病毒的复制，称为RNA依赖的依赖的RNA聚合酶（聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亚基；）的亚基；183kD的蛋白是的蛋白是126kD蛋白的阅读框终止子通读的产物。蛋白的阅读框终止子通读的产物。30kD蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白蛋白参与病毒在寄主细胞间的移动，称为运动蛋白（Movementpro2tein，MP）。）。 17.5kD的蛋白为病毒的外壳蛋白（的蛋白为病毒的外壳蛋白（Capsidprotein，

31、CP）。）。31041.261051.831055.41041.75104TMV基因组结构示意图基因组结构示意图5运动蛋白3CP蛋白复制酶涉及RNA复制 7.1126kD/183kD蛋白烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞烟草花叶病毒通过机械伤口或者借助媒介昆虫进入细胞内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因内，在病毒颗粒部分脱壳露出基因RNA的的5端时即侵染后端时即侵染后1-10分钟内，翻译开始首先合成分钟内，翻译开始首先合成126KDa和和183KDa的两种蛋的两种蛋白质。白质。183KDa是由是由126KDa基通读而产生，基通读而产生，Tyr插在这个琥插在这个琥珀型终止子上，有珀型终止

32、子上，有6个保守的核苷酸。个保守的核苷酸。两种蛋白功能两种蛋白功能烟草花叶病毒复制所需依赖烟草花叶病毒复制所需依赖RNA的聚合酶由两部分组成：的聚合酶由两部分组成：一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚一是由寄主提供的亚基，一是由病毒编码的特异的复制酶亚基组合成有专一性的全酶。基组合成有专一性的全酶。2183KDa有有RNA依赖的依赖的RNA聚合酶的结构，聚合酶的结构，126KDa的的C端有类似于螺旋酶和甲基转移端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构。所以，这两种蛋白质在酶的基本结构。所以，这两种蛋白质在TMVRNA的复制过的复制过程中起重要的作用。程中起重要的作用。 7.2运动

33、蛋白（运动蛋白（MP） 运动蛋白（运动蛋白（MP）是）是TMV的运动蛋白质，在整个的运动蛋白质，在整个TMV的的表达蛋白质中比例很小。运动蛋白是在病毒复制过程中形成表达蛋白质中比例很小。运动蛋白是在病毒复制过程中形成的。的。 以以TMV + RNA为模板的为模板的3-端开始复制合成全长的（端开始复制合成全长的（-）RNA，形成双链，称复制型，形成双链，称复制型RNA（replicative，RF型）。在型）。在感病细胞与膜相连的病毒合成中除发现感病细胞与膜相连的病毒合成中除发现RF型外，也发现有以型外，也发现有以（）RNA为模板同时合成多达为模板同时合成多达56条的（条的（+）RNA，称为，称

34、为复制中间型（复制中间型（replicativeintermediate，RI型）。型）。 这些（这些（+）RNA的出路有三：一是被外壳蛋白包装形成子的出路有三：一是被外壳蛋白包装形成子代病毒颗粒；二是进一步作为模板形成代病毒颗粒；二是进一步作为模板形成RFRI；三是做；三是做mRNA，而，而1.5Kb和和0.7kb分别翻译为分别翻译为30KDa和外壳蛋白。和外壳蛋白。运动蛋白的功能烟草花叶病运动蛋白的基因全长为烟草花叶病运动蛋白的基因全长为807bp. TMV的运动蛋白（的运动蛋白（30KDa）与与TMV在植株体内扩散密切相关，主要功能是介导在植株体内扩散密切相关，主要功能是介导TMV在临近

35、细胞间在临近细胞间的运动（的运动（Cell-to-cell movement），且），且MP的功能是高度保守的。研的功能是高度保守的。研究表明究表明MP定位于胞间连丝（定位于胞间连丝（Plasmodesma），可能与细胞骨架的某），可能与细胞骨架的某些因子形成一种核孔复合物，有利于转运些因子形成一种核孔复合物，有利于转运TMV基因组通过植株的维管基因组通过植株的维管系统，侵染整个植株。系统，侵染整个植株。 而而30KDa蛋白质与新合成的子代病毒蛋白质与新合成的子代病毒RNA结合产生有两个重要影结合产生有两个重要影响：一是使响：一是使TMA-RNA不折叠而成舒展的线性；二是使胞间连丝改变构不折叠

36、而成舒展的线性；二是使胞间连丝改变构型，通道变宽，型，通道变宽，30KDa蛋白质蛋白质-RNA复制物可鱼贯通过。因此，复制物可鱼贯通过。因此，30KDa蛋白质较早地以亚基因组形成被表达，有助于病毒在体内的扩展和增蛋白质较早地以亚基因组形成被表达，有助于病毒在体内的扩展和增殖。殖。3外壳蛋白（外壳蛋白（CP）TMV的外壳蛋白有的外壳蛋白有156161个氨基酸，共有个氨基酸，共有2130个个亚基，亚基右螺旋排列。外壳蛋白质在侵染细胞中表达量亚基，亚基右螺旋排列。外壳蛋白质在侵染细胞中表达量是最大的，占整个细胞总蛋白质的是最大的，占整个细胞总蛋白质的10%. 复制过程种，形复制过程种，形成的部分（成

37、的部分（+）RNAmRNA，而，而0.7kb翻译为外壳蛋白。外翻译为外壳蛋白。外壳蛋白对壳蛋白对TMVRNA具有保护作用。外壳蛋白不仅是病毒粒具有保护作用。外壳蛋白不仅是病毒粒子的结构亚基，同时协同介导病毒的长距离运动。子的结构亚基，同时协同介导病毒的长距离运动。TMV在在植物体内的移动必须以外壳蛋白聚集体的形成为前提。植物体内的移动必须以外壳蛋白聚集体的形成为前提。 8 花椰菜花叶病毒（花椰菜花叶病毒（CaMV）基因组）基因组病毒粒子为二十面体对称病毒粒子为二十面体对称(T=7)(T=7)，直径为，直径为54nm54nm，其外壳由，其外壳由420420个蛋个蛋白亚基组成，该病毒在自然条件下通

38、过蚜虫以非持久性方式进行传播，白亚基组成，该病毒在自然条件下通过蚜虫以非持久性方式进行传播，侵染十字花科植物，但不在蚜虫体内增殖。侵染十字花科植物，但不在蚜虫体内增殖。 CaMVCaMV基因组基因组 dsDNAdsDNA呈环状，大小约为呈环状，大小约为8kb8kb，含有，含有 8 8个个ORFsORFs，其中，其中为主要为主要ORFsORFs，和和为两个附加为两个附加ORFsORFs，在，在和和之间还有一个大之间还有一个大的基因间隔区的基因间隔区(intergenic(intergenic region) region)，双链，双链DNADNA上有上有3 3个缺刻，个缺刻，1 1个个( (1)

39、1)在负链在负链(链链) )上，另外上，另外2 2个个( (2 2 和和3)3)在正链在正链(1(1和和22链链) )上。除了上。除了第第基因外，其余的基因外，其余的7 7个基因相距很近，甚至有部分重叠个基因相距很近，甚至有部分重叠( (如下图如下图) )。蚜传因子蚜传因子外壳蛋白外壳蛋白反转录酶反转录酶内含体蛋白内含体蛋白与复制有关蛋白与复制有关蛋白运动蛋白运动蛋白(二二)花椰菜花叶病毒的转录与复制花椰菜花叶病毒的转录与复制 当当CaMV病毒粒子侵人细胞后，首先在细胞质中脱去病毒粒子侵人细胞后，首先在细胞质中脱去外壳，然后病毒基因组外壳，然后病毒基因组dsDNA进人细胞核内，并且在核内进人细

40、胞核内，并且在核内其基因组其基因组dsDNA的重叠区核苷酸被去除，缺刻经过共价结的重叠区核苷酸被去除，缺刻经过共价结合形成完整的闭环合形成完整的闭环dsDNA，这一闭环，这一闭环dsDNA再与寄主组再与寄主组蛋白结合生成一个微型染色体蛋白结合生成一个微型染色体(minichromosome)，最后，最后病毒微型染色体在宿主细胞病毒微型染色体在宿主细胞RNA聚合酶的催化下，以一条聚合酶的催化下，以一条负链负链DNA为模板转录生成为模板转录生成2个多聚腺苷酸化的个多聚腺苷酸化的 RNA分子，分子，即即 35S RNA和和 19SRNA (如下图如下图)。9.黄瓜花叶病毒黄瓜花叶病毒 （CMV) 病

41、毒粒子为二十面体对称病毒粒子为二十面体对称(T3)，直径，直径 26nm，由，由180个外壳蛋白亚基构成，个外壳蛋白亚基构成，在病毒悬液中，在病毒悬液中，PH、二价阳离子都会使病毒粒子的直径和构型产生可逆性的、二价阳离子都会使病毒粒子的直径和构型产生可逆性的变化。变化。BMV基因组有基因组有3个个RNA组分，即组分，即RNA1(3.2kb)，RNA2(2.5kb)和和RNA3(2.1kb)，每个，每个RNA组分的组分的5端有帽子结构，端有帽子结构，3端有端有 Trna样结构，并带有样结构，并带有假结假结(pseudoknot)，能接受酪氨酸，能接受酪氨酸(Tyr)。 RNA1编码单一的蛋白质，

42、分子量为编码单一的蛋白质，分子量为l09kD，位于，位于N末端和末端和C末端的氨基酸末端的氨基酸基序分别类似于甲基转移酶和解旋酶；基序分别类似于甲基转移酶和解旋酶； RNA2单一单一ORF翻译合成翻译合成94kD蛋白，蛋白产物有聚合酶样的区域，这两种蛋蛋白，蛋白产物有聚合酶样的区域，这两种蛋白质与病毒基因组白质与病毒基因组RNA复制密切相关；复制密切相关； RNA3有有2个个ORF，一个，一个ORF编码编码32kD蛋白，它影响病毒的宿主嗜亲性和介蛋白，它影响病毒的宿主嗜亲性和介导病毒在细胞之间运动，另一个导病毒在细胞之间运动，另一个ORF编码编码20kD外壳蛋白。外壳蛋白。 第二节第二节 植物

43、病原细菌的致病相关基因植物病原细菌的致病相关基因（一）植物细菌基因组的特点（一）植物细菌基因组的特点 同于一般原核生物基因组，包括染色体基因组和质同于一般原核生物基因组，包括染色体基因组和质粒基因组两部分粒基因组两部分。 染色体是一个高度折叠的环状染色体是一个高度折叠的环状DNA大分子，大小约为大分子，大小约为3106 5106bp，可携带，可携带500基因。游离于染色体的基因。游离于染色体的一定区域，没有包膜包被一定区域，没有包膜包被。 质粒是细菌染色体外基因组，也是环状质粒是细菌染色体外基因组，也是环状DNA分子，并能独分子，并能独立复制。立复制。DNA分子量在分子量在106 u 108

44、u，所携带基因比染，所携带基因比染色体少。但一般每个细菌菌体内包含色体少。但一般每个细菌菌体内包含1多个质粒多个质粒。 1 基因克隆的策略和研究方法基因克隆的策略和研究方法 1.1 基因克隆策略基因克隆策略 由里及表的研究途径，创建突变体由里及表的研究途径，创建突变体-通过基因标记和互通过基因标记和互补法获得基因，再推断其产物，并证明其致病。补法获得基因，再推断其产物，并证明其致病。 （1）方法导向）方法导向 （2）概念导向）概念导向 （3）异源基因克隆法）异源基因克隆法 1.2 突变诱变方法突变诱变方法 1.2.1 物理诱变物理诱变 1.2.2 化学诱变化学诱变 1.2.3 转座子诱变转座子

45、诱变突变方法突变方法 1.1.物理诱变物理诱变 紫外线（紫外线（UVUV）、）、X X射线和射线和射线诱变；射线诱变；离子束诱变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线；中子 2.2.化学诱变化学诱变 化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（EMS）等 3.3.转座子插入突变转座子插入突变物理和化学诱变获得的突变体转座子插入突转座子插入突变变转座子诱变致病性测定，获得致病性发生变化的突变体获得相应的突变体以转座子的侧端序列为探针进行Southern杂交，确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转座子的插入引起得突变体的遗传稳定性分析 1

46、.3 1.3 基因文库的构建基因文库的构建 将细菌的基因组切成许多片段，分别连到载体将细菌的基因组切成许多片段，分别连到载体上，构建一个能携带该菌所有基因信息的克隆库。上，构建一个能携带该菌所有基因信息的克隆库。 构建基因文库常用的载体有质粒（构建基因文库常用的载体有质粒（plasmid）、黏粒）、黏粒（cosmid）和）和 噬菌体噬菌体(phase (phase ) )。适用于作基因克隆的。适用于作基因克隆的质粒载体必须具备质粒载体必须具备3 3个共同的组成部分，即复制因子、选个共同的组成部分，即复制因子、选择标记和克隆位点。择标记和克隆位点。 理想基因文库应具备的条件：理想基因文库应具备的

47、条件：（1）以一种稳定的形式含有基因组以一种稳定的形式含有基因组DNA的序列。的序列。（2）克隆总数不宜过大。克隆总数不宜过大。（3）文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。（4）克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。（5）应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。（6）克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于chromosome walking。（7）克隆片段应易于从载体上切下而不带

48、有任何载体序列。克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。（8）文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。细菌文库构建常用载体 1质粒载体 如PBR322PUC系列 （2）噬菌体载体 包括插入型和替代型两种 一般可容纳15-23Kb的外源DNA片段 （3）柯氏质粒载体 又称粘性质粒（cosmid),是由噬菌体的cos片段和质粒复制子组成。 能自主复制，可容纳大约45Kb的DNA片段。1.4 1.4 基因克隆基因克隆1.4.11.4.1转座子转座子表签法表签法1.4.2 1.4.2 鸟枪法鸟枪法 在已获得标记基因突变体和基因

49、文库的基础上进行，在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行，用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到E.coli中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。1.4.3 1.4.3 基因功能互补法基因功能互补法 常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。 1.5 1.5 克隆片段的亚克隆分析克隆片段的亚克隆分析2 2 与病理过程有关的基因与病理过程有关的基因 植物病原菌

50、的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定植和侵入。植和侵入。 已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因chvE与其细与其细菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的picA基因还基因还影响细菌的聚集而与毒性有关。影响细菌的聚集而与毒性有关。 A.Kelman等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研究，该基因为究，该基因为phcA.2.1 与病原菌侵染有关的基因与病原菌侵

51、染有关的基因 2.2 决定显症的基因决定显症的基因 植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用；病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。 ? 黄单胞菌中一个黄单胞菌中一个800bp的的opsX基因参与

52、基因参与LPS的生物合的生物合成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的pthA基因是基因是引起增生性溃疡症状所必需的。引起增生性溃疡症状所必需的。D.W.Gabriel, et al(1995)2.3 2.3 决定寄主范围的基因决定寄主范围的基因2.3.1 2.3.1 正向调控寄主范围的基因正向调控寄主范围的基因根癌土壤杆菌（根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）青枯假单胞菌（青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（黄单胞菌水稻白叶枯枝病致病变种（X. Oxyzae pv

53、. oxyzae）2.3.2 2.3.2 负向调控寄主范围的基因负向调控寄主范围的基因 植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表现小种品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相现小种品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和反应，所应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和反应，所以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范以无毒基因的作用是病原

54、菌小种对不同品种的寄主范围的负向调控基因。围的负向调控基因。 此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不同致病变种的致病能力上。同致病变种的致病能力上。植物病原细菌无毒基因的克隆植物病原细菌无毒基因的克隆 B.J.Staskawica （1984）首先通过基因互补）首先通过基因互补法从大豆丁香假单胞法从大豆丁香假单胞6号小种中筛选到一个具有号小种中筛选到一个具有无毒基因功能的克隆，无毒基因功能的克隆，Napoli（1987）将此基因）将此基因命名为命名为avrA。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑。此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯

55、假单胞中克隆到腐黄单胞杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到40多个无毒基因。多个无毒基因。无毒基因的表达和调控无毒基因的表达和调控 以以P.syringae pv.glycinea中中avrB为代表，其不能在富为代表，其不能在富加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水平依赖于碳源。在侵染期间，平依赖于碳源。在侵染期间，avrB在感病或抗病寄主上在感病或抗病寄主上都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不受特异性植物因子调控。受特异性植物因子调控。 以以X.campestris p

56、v. Vesicatoria avrBs3为代表，能在为代表，能在富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表达不依赖于达不依赖于hrp基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的hrp基因，可能是需要基因，可能是需要hrp基因编码的无毒蛋白通道。基因编码的无毒蛋白通道。无毒基因的生理功能无毒基因的生理功能 研究表明研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的许多植物病原细菌中存在着无毒基因的隐性同源序列隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死反应的功能。说明无毒基

57、因除了有诱导过敏性坏死反应反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应的功能外，还有其自身的生理功能。的功能外，还有其自身的生理功能。 无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物致病性或适应性的功能。致病性或适应性的功能。 无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒基因作用而在另一种病原物中起致病作用。基因作用而在另一种病原物中起致病作用。无毒基因与无毒基因与hrp基因互作基因互作 无毒基因通常在体外、腐

58、生或非致病细菌中并不无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的hrp基因介导的机制分泌。基因介导的机制分泌。 近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产物是通过物是通过hrp基因簇所编码的基因簇所编码的型通道分泌系统运送至型通道分泌系统运送至细菌细胞外与寄主发生相互作用的。细菌细胞外与寄主发生相互作用的。2.4 决定病原菌致病性或毒性的基因决定病原菌致病性或毒性的基因2.4.

59、1 胞壁降解酶基因胞壁降解酶基因 果胶酶基因果胶酶基因 果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（萎蔫性病害（P.solanacearum ）中也起作用，现）中也起作用，现已在至少已在至少5种病原细菌中克隆到果胶酶基因。种病原细菌中克隆到果胶酶基因。 除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出4种胞外种胞外酶基因。酶基因。 纤维素酶基因纤维素酶基因 蛋白酶基因蛋白酶基因 编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。胞中得到克隆，其主要类型

60、都是内聚葡聚糖酶基因。 在荧光假单胞（在荧光假单胞（P.flouorescens）胞外酶对马铃薯块组织的）胞外酶对马铃薯块组织的浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王金生等（金生等（1984）研究表明，）研究表明，3中软腐病菌产生的蛋白酶在离体中软腐病菌产生的蛋白酶在离体条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。些基