【课件】1.2.2微生物的选择与计数课件高二下学期生物人教版选择性必修3

1、1 1如何调整培养基的配方来进行选如何调整培养基的配方来进行选择培养？择培养？2 2选择培养的原理？选择培养的原理？3 3微生物的计数方法有哪些？微生物的计数方法有哪些？1.2 微生物的基本培养技术及应用1.1.概念：概念： 在微生物学中，将在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长允许特定种类的微生物生长，同时，同时抑抑制或阻止其他种类微生物生长制或阻止其他种类微生物生长的培养基。的培养基。2 2. .原理：原理： 人为提供人为提供_的条件（包括的条件（包括_ _ 、_和和_等），同时等），同时_ _ 。有利于目的菌生长有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长抑制或阻止其他微生物的生长营养营

2、养温度温度pHpH3 3. .举例：举例：（1 1）利用利用改变培养条件改变培养条件进行选择培养。进行选择培养。70708080的高温的高温分离耐高温的水生栖热菌分离耐高温的水生栖热菌使用使用将将pHpH调至酸性调至酸性的培养基的培养基分离耐酸菌分离耐酸菌（2 2）利用利用营养条件营养条件进行选择培养进行选择培养不加碳源（含碳有机物不加碳源（含碳有机物）的培养基的培养基分离出自养型微生物分离出自养型微生物不加氮源的培养基不加氮源的培养基分离出固氮菌分离出固氮菌（3 3）利用利用添加某种化学物质添加某种化学物质进行选择培养进行选择培养加入青霉素加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真

3、菌 尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。讨论：讨论：1.1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基设计一种选择培养基, ,用用尿素作为唯一氮源尿素作为唯一氮源, ,可以将分解尿素可以将分解尿素的细菌的细菌分离出来分离出来选择培养基配方的设计2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基有

4、哪些共同点和不同点？这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。同理：同理：将土壤稀中能将土壤稀中能分解纤维素的细菌分解纤维素的细菌分离出来，培分离出来，培养基的配方该如何设计？养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基设计一种选择培养基, ,用用纤维素作为唯一碳源纤维素作为唯一碳源, ,可以将分解可以将分解纤纤维素维素的细菌的细菌分离出来分离出来设计一种选择培养基设计一种选择培养基, ,用用石油作为唯一碳源石油作为唯一碳源, ,可以将分解可以将分解石油石油的细菌的细菌分离出来

5、分离出来思考：思考：将土壤中能将土壤中能分解石油的细菌分解石油的细菌分离出来，培养基分离出来，培养基的配方该如何设计？的配方该如何设计？KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基讨论：讨论：1.1.从物理性质看两种培从物理性质看两种培养基属于哪类？养基属于哪类？从功能上分，从功能上分，属于什么培养基？属于什么培养基？2.2.在此培养基中哪些作为碳在此培养基中哪些作为碳源、氮源？源、氮源？3.3.这个培养基上什么微生物可以存活？这个培养基上什么微生物可以存活？分解尿素的细菌分解尿素的

6、细菌4.4.在此培养基中添加了蛋白胨或在此培养基中添加了蛋白胨或NaNONaNO3 3还能筛选分解还能筛选分解尿素的细菌吗尿素的细菌吗? ?不能不能或固氮菌或固氮菌要求要求: :以尿素作为以尿素作为唯一唯一的的N N源源固体培养基固体培养基选择培养基选择培养基碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素思考：如果想知道思考：如果想知道1g1g土壤中有多少能土壤中有多少能分解尿素分解尿素的细菌，的细菌，方法是方法是?稀释涂布平板法: 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。01梯度稀释02涂布平板注：稀释涂布平板法除用于注：稀释涂布平板法除用

7、于分离分离微生物外，也常用微生物外，也常用于于统计统计样品中活菌数。样品中活菌数。将将10g10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌水无菌水的锥形瓶中，的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。充分摇匀，制成菌液。1mL11011090mL90mL无菌水无菌水1101107 71101106 61101103 31101102 21101104 41mL1mL1mL1mL9mL9mL无菌水无菌水1mL1101105 5取取1mL1mL上清液加入盛有上清液加入盛有9mL9mL无无菌水菌水的试管中，依次等比稀释。的试管中，依次等比稀释。铲取土样，将样品装入纸袋中铲取土样，将样品装入纸袋中ABB梯度

8、稀释菌液稀释涂布平板法各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照涂布平板梯度稀释菌液稀释涂布平板法涂布平板法操作 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置倒置，放入放入30-3730-37的恒温培养箱中，培养的恒温培养箱中，培养1-2d1-2d。稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照恒恒温温培培养养箱箱菌落培养方法一：方法一：活菌计数法（稀释涂布平板法）活菌计数法（稀释涂布平板法）（1 1）操作方法：）操作方法： 稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数（2 2

9、）原理：）原理： 在稀释度在稀释度足够高足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。即测出样品中大约含有多少活菌。即1 1个菌落个菌落1 1个活菌。个活菌。微生物的数量测定（3 3）统计原则：）统计原则： （4 4）结果）结果: :统计的菌落往往比活菌的实际数统计的菌落往往比活菌的实际数目目低低? ?。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用察

10、到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌菌落数落数而不是活菌数来表示。而不是活菌数来表示。选选 3030 300300个菌落的平板统计；个菌落的平板统计；每个稀释度每个稀释度取取3 3个平板个平板? ?，取其平均值；，取其平均值；每克样品中的菌落数(CV)MC C代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数，V V代表涂代表涂布平板时所用的稀释液的布平板时所用的稀释液的体积体积(ml)(ml)，M M代表代表稀释倍数。稀释倍数。实例分析实例分析1 1：甲同学做此实验在稀释倍数甲同学做此实验在稀释倍数10105 5获得获得3 3个平板，菌落数分个平板，菌落数分别是

11、别是8080、9090、100100，涂布平板时均使用，涂布平板时均使用0.1ml0.1ml菌液，试菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+10080+90+100）/3/30.10.1 10 105 5 =9 =9 10107 7个个（5)如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？ 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释从对应稀释 倍数为倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1. 1.甲同学在该

12、浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230230。 2.2.乙同学在该浓度下涂布了乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，统计的菌落三个平板，统计的菌落数分别为数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？实例分析实例分析2 2： 甲：没有重复实验（至少涂布甲：没有重复实验（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：其中一个平板计数

13、结果与其他两个相差太大，乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。操作过程可能出现了错误。 方法方法2 2：显微镜直接计数法显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌和活菌个体小的细菌在显微镜下难以观察。血细胞计数板血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子子等的计数等的计数细菌计数板细菌计数板可对细菌等较小可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；的细胞进行观察和计数；优点：快速、直观优点：快速、直观这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板，在，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。显微镜下

14、计算一定容积里样品中微生物的数量。 在做在做“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实实验中，小张同学在没有设置对照的情况下，从对应倍验中，小张同学在没有设置对照的情况下，从对应倍稀释的培养基中筛选出大约稀释的培养基中筛选出大约150150个菌落。但是，其他同个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只筛选出大约学在同样的稀释度下只筛选出大约5050个菌落。个菌落。经过大家的讨论，认为小张同学和其他同学的实验结经过大家的讨论，认为小张同学和其他同学的实验结果不同的主要原因可能有：果不同的主要原因可能有：所选用的土壤样品不同所选用的土壤样品不同；培养基被杂菌污染了培养基被

15、杂菌污染了；培养基中混入了除尿素以培养基中混入了除尿素以外含氮物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养外含氮物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长基上生长。你能通过设置对照，帮助小张同学排除上述两个可能你能通过设置对照，帮助小张同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？影响实验结果的因素吗？实例分析实例分析3 3：原因分析：原因分析：所选用的土壤样品不同；所选用的土壤样品不同；培养基被杂菌污染了；培养基被杂菌污染了；培养基中混入了除尿素以外含氮物质，导致不能培养基中混入了除尿素以外含氮物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。方案一：其他同

16、学用与小张同学一样的土样进行实验，方案一：其他同学用与小张同学一样的土样进行实验，结果与小张同学一致，则证明小张无误；结果不同，则结果与小张同学一致，则证明小张无误；结果不同，则证明小张同学的操作或培养基的配制有问题。证明小张同学的操作或培养基的配制有问题。方案二：将方案二：将小张同学制备的培养基小张同学制备的培养基在在不加土样（空白平不加土样（空白平板）板）的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染是否受到污染方案三：从相应稀释倍数的稀释液涂布在方案三：从相应稀释倍数的稀释液涂布在完全培养基完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）（牛肉膏蛋白

17、胨培养基）设置对照设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将将未接种未接种的培养基同时进行培养。的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种接种后后培养观察菌落数目。培养观察菌落数目。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（1）实验目的从土壤中从土壤中分离分离出能够分解尿素的细菌。出能够分解尿素的细菌。计数计数每克土壤样品中究竟含有每克土壤样品中究竟含有多少多少这样的细菌。这样的细菌。（2）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成绝大多数微生

18、物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素，利用以的微生物才能分解尿素，利用以尿素尿素作为唯一氮源的作为唯一氮源的选择培选择培养基养基，可以从土壤中分离出分离尿素的，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌细菌。（3）实验设计 实验变量分析？实验组与对照组如何设置？实验变量分析？实验组与对照组如何设置？自变量：_因变量：_无关变量：_尿素是否为唯一尿素是否为唯一N N源源能分解尿素细菌的生长情况能分解尿素细菌的生长情况培养时间、培养基的培养时间、培养基的pHpH、温度等、温度等实验设计实验组：_对照组：_空白对照：_在以尿素为唯一在以尿素为唯一N N源的选择培养基上，源的选择培养基上

19、，接种菌液接种菌液在完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）上，在完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）上，接种菌液接种菌液空白的牛肉膏蛋白胨培养基空白的牛肉膏蛋白胨培养基空白的选择培养基空白的选择培养基检测培养基是否含有杂菌检测选择培养基是否有筛选作用（4）实验步骤土壤取样制备培养基样品稀释与涂布平板微生物的培养与观察1.土壤取样1 1）取样的位置：）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌生长，绝大多数的细菌分布距地表分布距地表3 3 8cm8cm的土壤

20、层。的土壤层。2 2）取样要求：取样要求：先铲去表层土先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。（铁铲与信封使用前要准备好的信封中。（铁铲与信封使用前要灭菌处理灭菌处理） 2.制备培养基制备以尿素为唯一氮源的选择培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基原则：确保菌落数在原则：确保菌落数在3030 300300之间。之间。接种：用接种：用稀释液涂布平板稀释液涂布平板。3.样品的稀释与涂布平板 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30300之间适于计数的平板。测细菌数：一般用测细菌数：一般用10104 4、101

21、05 5、10106 6稀释液。稀释液。测放线菌：一般用测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液。稀释液。测真菌数：一般用测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液。稀释液。BAC4.微生物的培养与观察 培养条件：培养条件：不同种类不同种类的微生物，往往需要的微生物，往往需要不同不同的培的培养养温度温度和培养和培养时间时间。细菌细菌一般在一般在30303737的温度下培养的温度下培养1 12d2d。 观察：每隔观察：每隔24h24h统计一次菌落数目，选取菌落数目统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定稳定时的记录作为结果。时的记录作为结果。防止因

22、培养时间不足而导致遗防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。漏菌落的数目。 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出出稳定的菌落特征稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。，如形状、大小和颜色等。ABC1）1、2、3为每个稀释浓度下涂布的3个平板（平行重复实验）；2）1、2、3与4形成对照，以判断选择培养基是否具有筛选作用；3）还要有两个空白对照，即不接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。提示：提示：如果没有接种的培养

23、基上没有菌落生长，说明如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。培养基筛选出了一些尿素分解菌。A（5）结果分析与评价提示：提示：如果得到了两个或多个菌落数为如果得到了两个或多个菌落数为3030300300的平板，的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 你是否获得了某一稀释度下菌落数为30300的平板？在这一稀释度下，

24、是否至少有2个平板的菌落数接近？B 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？提示：提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。制是否合理等方面查找原因。C 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。如何进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。（6）进一步探究方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养

25、基中加入酚红指示酚红指示剂剂，培养某种细菌后，如果，培养某种细菌后，如果pHpH升高升高，指示剂将，指示剂将变红变红：液体培养基可以直接看液体的变色情况；液体培养基可以直接看液体的变色情况；固体培养基上可以观察固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强强。需要用“鉴定培养基”鉴别培养基：在培养基中在培养基中加入某种加入某种指示剂或化学药品指示剂或化学药品( (不影响微生物正常生长不影响微生物正常生长) )，使，使微生物的某种代谢产物微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示

26、剂或化学药品发生反应与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而。从而达到达到鉴定的作用鉴定的作用。伊红伊红和美蓝和美蓝培养基鉴别培养基鉴别大肠杆菌大肠杆菌刚果红培养基鉴别纤维素刚果红培养基鉴别纤维素分解菌分解菌项目选择培养基鉴别培养基原理加入不影响甚至促进目标微生加入不影响甚至促进目标微生物生长，而物生长，而抑制或阻止其他种抑制或阻止其他种类类微生物生长的化学物质微生物生长的化学物质加入某种加入某种指示剂或化学药品指示剂或化学药品( (不影响微生物正常生长不影响微生物正常生长) )，使，使微生物的某种代谢产物与培养微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品基中的特定指示剂或化学药

27、品发生反应发生反应用途培养、分离出目标微生物培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物鉴别目标微生物举例培养酵母菌和霉菌时，可在培培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素源的培养基来培养可分解尿素的细菌的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆水或乳制品中是否含有大肠杆菌菌( (若有，则菌落呈黑色若有，则菌落呈黑色) )图示尿素尿素分分解菌解菌大肠杆大肠杆菌菌选择培养基和鉴别培养基的比较选择培养基和鉴别培养基的比较 是是将一定体积的水用将一定体

28、积的水用细菌过滤器细菌过滤器过滤后，将过滤后，将滤膜放到放到 伊红伊红- -美蓝美蓝 培养基上培养，培养基上培养，大肠杆菌大肠杆菌菌落呈现菌落呈现黑色黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 到生活中去测测定饮水中大肠杆菌数量的方定饮水中大肠杆菌数量的方法：法：滤膜法滤膜法例：怎样例：怎样选择选择出出抗氨苄青霉素能力抗氨苄青霉素能力的细菌的细菌?完全培养基完全培养基（不加（不加氨苄青氨苄青霉素霉素）培养培养影印法转移到转移到培养基培养基（加（加氨苄青霉素氨苄青霉素）培养培养没有没有氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗性性的的细菌细菌被淘汰被淘汰不具有不具有抗氨苄青抗氨苄

29、青霉素能力霉素能力的菌落的菌落影印法影印法具有具有抗氨苄青霉抗氨苄青霉素能力素能力的菌落的菌落课堂小结微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法 稀释涂布平板法直接计数 计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验步骤（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。提示：提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培物除了需要准备选择培