基因工程 第五章 重组基因导入受体细胞

1、第五章第五章 重组基因导入受体细胞重组基因导入受体细胞5.1 受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞(receptor cell)又称为宿主细胞或寄主细胞又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实等，从实验技术上讲是能摄取外源验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。价值的细胞。作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：便于重组便于重组DNA分子的导入；分子的导入；能使重组能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；分子稳定存在于细胞中；便于重组

2、体的筛选；便于重组体的筛选；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。因的高效分泌表达。在遗传密码的应用上无明显偏倚性；在遗传密码的应用上无明显偏倚性；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。基因

3、工程中常用的受体细胞类型：基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞原核生物细胞真核生物细胞真核生物细胞真菌细胞真菌细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞原核生物细胞原核生物细胞优点：优点：1.大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源外源DNA的进入。的进入。2.没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。重组减少了麻烦。3.原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养

4、简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。4.基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。缺点：缺点：1.原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。间结构的多肽链。2.原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统

5、，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。或磷酸化等修饰作用。3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。不稳定。至今被用作受体菌的原核生物有至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌枯草杆菌、蓝细菌等。等。一、大肠杆菌受体细胞一、大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属大肠杆菌属革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因

6、工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。统。优点：优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。致人体热原反应。二、枯草杆菌受体细胞二、枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌。优点：优点：1.枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达的产物高效分泌到培养

7、基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。天然的构象和生物活性。2.枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。基因工程菌。3.枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。4.枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。分子遗传学背景清楚等优点

8、。应用：应用：已成功的用于表达人的已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素、干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。抗原等。三、蓝细菌（蓝藻）三、蓝细菌（蓝藻）蓝藻蓝藻又称又称蓝绿藻蓝绿藻或或蓝细菌蓝细菌，它含有叶绿素，它含有叶绿素a(缺乏叶缺乏叶绿素绿素b)和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统 (PS ) 和光合系统和光合系统 (PS )、能进行光合作用，但它又、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原

9、核生物。型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体外，不含叶绿体DNA和线粒体和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检的检测。测。细胞壁属细胞壁属G，主要由肽聚糖组成，便于外源，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。

10、适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。蓝藻，就可达到锦上添花的效果。真核生物细胞真核生物细胞一、真菌受体细胞一、真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分

11、泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。酵母菌细胞酵母菌细胞是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。优点：优点：1.酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。理比较清楚，遗传操作相对比较简单。2.具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。3.不含有特异性病毒，不产生

12、毒素。不含有特异性病毒，不产生毒素。4.培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。5.能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。加工。二、植物受体细胞二、植物受体细胞优点：优点：全能性，全能性，即一个分离的活细胞在合适的培即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。植株或品系。 缺点：缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，

13、植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组不利于摄取重组DNA分子。分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。 三、动物受体细胞：三、动物受体细胞：优点：优点：1.能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。2.真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的的蛋白质免疫原性，约为酵

14、母细胞的1620倍。倍。3.易被重组易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。4.经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。成本低。缺点：缺点：组织培养技术要求高，难度较大。组织培养技术要求高，难度较大。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种

15、的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。常用的动物受体细胞有小鼠常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点。点。 5.2.1 5.2.1 重组质粒重组质粒DNADNA分子转化大肠杆菌分子转化大肠杆菌转化：转化：重组质粒重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转

16、化。程称之为转化。转化现象最早是由转化现象最早是由Griffith于于1928年在肺炎双球年在肺炎双球菌中发现的。菌中发现的。 5.2 5.2 重组重组DNADNA分子转入原核生物细胞分子转入原核生物细胞目目 录录细菌转化的本质细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体是受体菌直接吸收来自供体菌的游离菌的游离DNADNA片段，即转化因子，并在细胞中片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能

17、机制包括如下基本步骤：能机制包括如下基本步骤：细菌感受态的形成。细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞当转化因子接近细菌细胞时受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又时受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分溶解，局部称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的暴露出细胞膜上的DNADNA结合蛋白和核酸酶等，此时结合蛋白和核酸酶等，此时细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。子以实现转化。 转化因子的吸收。转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的受体菌细胞膜上的DNADNA结结合蛋白可与转

18、化因子的双链合蛋白可与转化因子的双链DNADNA结构持异性结结构持异性结合，然后激活邻近的核酸酶，将双链合，然后激活邻近的核酸酶，将双链DNADNA分子分子中的一条链逐步降解，同时将另一条链逐步中的一条链逐步降解，同时将另一条链逐步转移到受体菌内。转移到受体菌内。 整合复合物前体的形成。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链进入受体细胞的单链DNADNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体，它能有效地保护单链物前体，它能有效地保护单链DNADNA免受各种胞内核免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色

19、体DNADNA处。处。 单链单链DNADNA转化因子的整合。转化因子的整合。整合复合物前体中的整合复合物前体中的单链单链DNADNA片段可以通过同源重组，置换受体细胞染片段可以通过同源重组，置换受体细胞染色体色体DNADNA的同源区域形成异源杂合双链的同源区域形成异源杂合双链DNADNA结构。结构。 转化子的形成。转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子。色体发生分离，形成一个新的转化子。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进大肠杆菌是一种

20、革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒根据人们需要构建的外源重组质粒DNADNA分子，而非分子，而非来自供体菌的游离来自供体菌的游离DNADNA片段片段( (转化因子转化因子) )。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法

21、受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是之一是CaCa2+2+诱导的大肠杆菌转化法。诱导的大肠杆菌转化法。（1 1） CaCa2+2+诱导的大肠杆菌转化法诱导的大肠杆菌转化法CaCa2+2+诱导诱导DNADNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：在在00的的CaclCacl2 2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaclCacl2 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。受

22、态。CaCa2+2+能与加入的能与加入的DNADNA分子结合，形成抗分子结合，形成抗DNADNA酶酶(DNase(DNase) )的羟的羟基基- -磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当当4242热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNADNA分子提供分子提供了进入细胞的通道。了进入细胞的通道。 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每受态

23、细胞。对这种感受态细胞进行转化，每g g质质粒粒DNADNA可以获得可以获得5 510106 62 2l0l07 7个转化茵落，完全可个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。以满足质粒的常规克隆的需要。 MgMg2+2+对对DNADNA分子有很大的稳定性作用，因此利用分子有很大的稳定性作用，因此利用MgclMgcl2 2与与CaclCacl2 2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNADNA的转化效率。如利用二甲基亚砜的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)和二硫苏糖和二硫苏糖醇醇(DDT)(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细等进一步处理细

24、胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高胞的形成，转化效率可提高10010010001000倍，且对大倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。小质粒分子均可进行有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。很少采用。 DNADNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制分子进入大肠杆菌受体细胞的机制 一般认为只有一般认为只有双链闭环或开环的质粒双链闭环或开环的质粒DNADNA分子才能分子才能转化转化，而，而线形线形DNADNA分子不能获得转化子分子不能获得转化子。因此，环。因此，环状状DNADNA分子中混杂线形分子中混杂线形DNADN

25、A分子，会影响环状分子，会影响环状DNADNA分分子的转化效率。子的转化效率。也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNADNA，但却以单链但却以单链DNADNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转化过程相似。化过程相似。转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：子的出现，因此须设以下几种对照处理： DNADNA对照处理。对照处理。转化处理液中用转化处理液中用0.2ml0.2ml无菌水代替无菌水代替0.2m10.2m1感感受态细胞，检验受态细胞，检验D

26、NADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。 感受态细胞对照处理。感受态细胞对照处理。转化处理液中用转化处理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE缓冲液缓冲液代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。溶液，检验感受态细胞是否染菌。 感受态细胞有效性对照处理。感受态细胞有效性对照处理。在在0.2ml0.2ml感受态细胞中加入感受态细胞中加入0.1ml0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNADNA。 （2 2）电穿孔转化法）电穿孔转化法基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔

27、膜上进行电穿孔(electro poration(electro poration) )形成可逆的形成可逆的瞬间通道，从而促进外源瞬间通道，从而促进外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源源DNADNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每ugDNAugDNA可以得到可以得到10109 910101010转化子。转化子。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50507070细菌死亡时，转化水平达到最高。细菌死亡时，转

28、化水平达到最高。 用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多当细菌生长到对数中期后予以冷却、备容易得多当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用的离子强度，并用1010甘油重悬细胞，使其细胞浓甘油重悬细胞，使其细胞浓度为度为3 3l0l01010个个m1m1。分装，在干冰上速冻后置于。分装，在干冰上速冻后置于7070贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达有效期达6 6个月以上。个月以上。 电穿

29、孔转化须在低温下电穿孔转化须在低温下(0(04)4)进行，转化效率要进行，转化效率要比在室温下操作提高约比在室温下操作提高约100100倍。倍。 （3 3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌）三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为简称为三亲本杂交转移法三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种迁移作用而建立的一种DNADNA转化方式适用于那些难转化方式适用于那些难以采用以采用CaCa2+2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所须的全部基因，不能象接合

30、型质粒那样在宿主细胞须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒（即合性的接合型质粒（即辅助质粒辅助质粒），非接合型质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为非接合型质粒的转移过程称为迁移作用迁移作用。 接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载

31、体使用。目前常用的质粒载体多是以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒的基础上构建的，故重组质粒DNADNA分子也不能直接接进分子也不能直接接进行接合转化而只能通过其迁移作用来完成。行接合转化而只能通过其迁移作用来完成。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重细胞进行混合，促使两者发生接合转化作

32、用，将重组质粒导入受体细胞。组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到整个接合转化过程涉及到3 3种有关的细菌菌株，种有关的细菌菌株，即即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNADNA的供的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此，因此称称为三亲本杂交接合转化法为三亲本杂交接合转化法。（4 4）转化率的计算及其影响因素）转化率的计算及其影响因素 转化率转化率是指是指DNADNA分子转化受体菌获得转化子的效率，分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的一是以转化子数与

33、用于转化处理的DNADNA分子数或质量的比分子数或质量的比率表示；率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。示。 用每单位质量的用每单位质量的DNADNA分子获得的转化子数来表示，分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。难以反映分子大小与转化率之间的关系。 以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液转化率，首先必须通过菌液ODOD值测定或细菌值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与

34、受体菌的比率。总数。然后计算转化子与受体菌的比率。 影响转化率的因素影响转化率的因素分子质量较小的重组质粒分子质量较小的重组质粒DNADNA分子转化率较高分子转化率较高，分子质量，分子质量较大的重组质粒较大的重组质粒DNADNA分子转化率较低，对于大于分子转化率较低，对于大于30kb30kb的重的重组质粒则很难进行转化。组质粒则很难进行转化。 组成重组组成重组DNADNA分子的载体类型及其构型分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和与受体细胞亲和性性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而处于而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体自然双螺旋闭

35、环结构的质粒载体比开环结构成线性比开环结构成线性结构的质粒载体有更高的转化率。经结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作体外酶切、酶连操作后的载体后的载体DNADNA或重组或重组DNADNA分子分子由于空间构象难以恢复，转化由于空间构象难以恢复，转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。重组重组DNADNA分子的浓度和纯度分子的浓度和纯度。在。在10ng10ng100u1100u1以下的以下的DNADNA浓浓度范围内，转化效率与度范围内，转化效率与DNADNA分子数成正比关系。分子数成正比关系。 同一重组质粒同一重组质粒DNADNA分

36、子转化不同的受体菌细胞，转化分子转化不同的受体菌细胞，转化率不同率不同受体细胞的选择受体细胞的选择对于重组对于重组DNADNA分子的转化分子的转化也是极为重要。也是极为重要。 前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高（10108 810101010）；）；CaCa2+2+诱导转化法居中（诱导转化法居中（10107 710108 8）；而）；而三亲本杂交转移法最低（三亲本杂交转移法最低（10104 410105 5），但它适于前两），但它适于前两种方法难以转化的受体菌。种方法难以转化的受体菌。 在转化操作方而，受体细胞的预处理或感受态细胞在转化操作

37、方而，受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。的制备对转化率影响最大。如如CaCa2+2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、诱导大肠杆菌转化法，菌龄、CaclCacl2 2处理时间、处理时间、感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响因素。因素。电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转化率，要比不经此预处理的转化率高后的转化率，要比不经此预处理的转化率高1010100100倍。倍。 5.2.2 5.2.2 重组重组噬菌体噬菌体DNADNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌 将重组将重组噬菌体噬

38、菌体DNADNA分子直接导入受体细胞中的过程，分子直接导入受体细胞中的过程，称为称为转染转染。 将重组将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是规方法是转导转导操作。操作。转导转导(transduction)(transduction)是指通过是指通过噬菌体噬菌体( (病毒病毒) )颗粒颗粒感染宿主细胞的途径把外源感染宿主细胞的途径把外源DNADNA分子转移到受体细分子转移到受体细胞内的过程。胞内的过程。 具有感染能力的具有感染能力的噬菌体颗粒除含有噬菌体颗粒除含有噬菌体噬菌体DNADNA分分子外，还包括子外，还包括外被蛋白外被蛋白。以噬菌体

39、颗粒感染受体细胞，首先必须对重组以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组A A噬噬菌体菌体DNADNA分子进行分子进行体外包装体外包装 。体外包装，体外包装，是指在体外模拟是指在体外模拟噬菌体噬菌体DNADNA分子在受体分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子包装为成熟的具有感染能力的分子包装为成熟的具有感染能力的噬噬菌体颗粒的技术。菌体颗粒的技术。 基本原理，根据基本原理，根据噬菌体噬菌体DNADNA体内包装的途径，分别体内包装的途径，分别获得缺失获得缺失D D包装蛋白的包装蛋白的噬菌体突变株和缺失噬菌体突

40、变株和缺失E E包装蛋包装蛋白的白的噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装装噬菌体噬菌体DNADNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中，但将它们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失提取缺失D D蛋白的包装物（含蛋白的包装物（含E E蛋白蛋白) )和缺失和缺失E E蛋白的蛋白的包装物包装物( (含含D D蛋白蛋白) )，两者混合后就能包装，两者混合后就能包装噬菌体噬菌体DNADNA。 噬菌体噬菌体DNADNA体外包装的主要过程体外包装的主要过程制备包装物制备包装物。 首先，须培养两种溶原菌首先，须培养两种溶原菌 第二，诱导溶菌生长第二，诱导溶菌生长 第三，收集

41、和贮存包装物。第三，收集和贮存包装物。体外包装体外包装。制备制备噬菌体噬菌体DNADNA混合液混合液。第一次包装。第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物可立即用于包装。包装物可立即用于包装。 第二次包装第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率。进行第二次包装，可提高包装效率2 25 5倍，倍，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的进行。进行。去除细胞屑。去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入第二次包装后，在反应液中加入SMSM溶液和溶液和氯仿，混匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌

42、体颗氯仿，混匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌体颗粒。粒。经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受体菌经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受体菌细胞，并将重组细胞，并将重组噬菌体噬菌体DNADNA分子高效导入细胞中。分子高效导入细胞中。在良好的体外包装反应条件下，每在良好的体外包装反应条件下，每g g野生型的野生型的噬菌体噬菌体DNADNA可形成可形成10108 810109 9的的pfupfu。对于重组的。对于重组的噬噬菌体菌体DNADNA，包装后的成斑率要比野生型的有所下降，包装后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可达到但仍可达到10106 610107 7pfupfu，完全可以满足构

43、建真核基，完全可以满足构建真核基因组基因文库的要求。因组基因文库的要求。5.2.3 5.2.3 受体细胞的选择受体细胞的选择 野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑：的突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑：限制与修饰系统限制与修饰系统这是导致外

44、源重组这是导致外源重组DNADNA转化或转导效率低下的主要转化或转导效率低下的主要原因之一。原因之一。应选用应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源以提高外源DNADNA分子的转化或转导效率。分子的转化或转导效率。进一步进一步使修饰系统也发生缺陷使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源能修饰，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重组分子，更便于重组DNADNA分子的多种基因操作。分子的多种基因操作。 重组系统重组系统 进入野生型细胞的外源进入野生型细胞的外源DNADNA分子能分子能自发自发地与染色体地与染

45、色体DNADNA发生的体内同源重组反应由发生的体内同源重组反应由recrec基因家族的编码基因家族的编码产物所控制。产物所控制。RecARecA蛋白能促进蛋白能促进DNADNA分子之间的同源分子之间的同源联会和联会和DNADNA单链交换，单链交换，recArecA基因的突变使大肠杆菌基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至细胞内的遗传重组频率降低至1010-6-6。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突变也可以降低遗传重组基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。的发生频率。因此因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型

46、表型，基因型为，基因型为recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大肠等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。 易于转化或转导易于转化或转导可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞细胞的菌株作为受体菌细胞有明显的选择性差异有明显的选择性差异遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使遗传表型差异大，可便于

47、重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。性状。如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMPAMP抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组素敏感。当重组DNADNA分子转入受体细胞后，载体上分子转入受体细胞后，载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。可以区分转化子与非转化子。如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的如果受体细胞具有与外源

48、基因表达产物活性互补的遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。胞。 感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。染寄生性。 5.2.4 5.2.4 重组重组DNADNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞 5.2.4.15.2.4.1重组重组DNADNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞（1 1）农杆菌介导的）农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数

49、单子叶植物无染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。侵染能力。 具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA的转移至细胞内部。根据这一性质，的转移至细胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入将待转移的目的基因组入TiTi质粒载体，通过农杆菌介质粒载体，通过农杆菌介导进入植物细胞，与染色体导进入植物细胞，与染色体DNADNA整合，得以稳定维持或整合，得以稳定维持或表达。表达。 用于植物基因转化操作的受体通常称为用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体外植体。选择选择适宜的外植体是成功进

50、行遗传转化的首要条件适宜的外植体是成功进行遗传转化的首要条件，而外，而外植体的选择主要是依据受体细胞的转化能力来决定的。植体的选择主要是依据受体细胞的转化能力来决定的。目前作为基因转化的外植体材料非常广泛，涉及到植目前作为基因转化的外植体材料非常广泛，涉及到植物的各个组织、器官和部位。物的各个组织、器官和部位。 选择合适的转化外植体选择合适的转化外植体优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期

51、。转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。切割外植体时应尽可能地所在的部位及其数量。切割外植体时应尽可能地暴露分生组织细胞，增加农杆茵与分生组织的接暴露分生组织细胞，增加农杆茵与分生组织的接种面积。种面积。 农杆菌接种操作农杆菌接种操作 外植体的农杆菌接种外植体的农杆菌接种就是把农杆菌接种到外植体的就是把农杆菌接种到外植体的损伤切面。通常采用较低的菌液损伤切面。通常采用较低的菌液ODOD值和较短的浸泡值和较短的浸泡时间来进行外植体的接种。时间来

52、进行外植体的接种。 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上，随着外植体的细胞分裂和定芽固体分化培养基上，随着外植体的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养农杆菌与外植体的共培养。由于农杆菌的附着侵染、由于农杆菌的附着侵染、T-DNAT-DNA的转移及整合都是的转移及整合都是在共培养时期内完成，因此在共培养时期内完成，因此共培养技术条件的掌握共培养技术条件的掌握是整个转化的关键环节是整个转化的关键环节。其中共培

53、养时间对转化率。其中共培养时间对转化率有着很大影响，有着很大影响， 与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正常生长会产生不共生有大量农杆菌，对外植体的正常生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的生长。生长。脱菌培养脱菌培养是指把共培养后的外植体转移到含有抗生是指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。目前使用最多素的培养基上继续培养生长的过程。目前使用最多的是头孢霉素。的是头孢霉素。最后，还须将外植体转移至筛选培养基上继续培养，最后，

54、还须将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建针对不同的外植体以及不同的转化目的而建立多种转化方法，主要包括立多种转化方法，主要包括叶盘转化法、植叶盘转化法、植株接种共转化法、植物愈伤组织共培养转化株接种共转化法、植物愈伤组织共培养转化法、植物悬浮细胞共培养转化法和原生质体法、植物悬浮细胞共培养转化法和原生质体共培养转化法共培养转化法等。等。整体植株接种转化法：整体植株接种转化法：人为地在整体植株人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤上造成创伤部位，然后把农

55、杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植株体内、表面，或用针头把农杆菌注射到植株体内、使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。植株。原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法即取含重组即取含重组TiTi质粒质粒的农杆菌同刚刚再生出新细胞壁的原生质体的农杆菌同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌与植物细胞之作短暂的共培养，促使农杆菌与植物细胞之间发生遗传物质的转化。用此方法已成功地间发生遗传物质的转化。用此方法已成功地实现了植物细胞的体外转化。实现了植物细胞的

56、体外转化。 悬浮细胞共培养转化法悬浮细胞共培养转化法。此方法类似于原。此方法类似于原生质体共培养转化法，主要差别是首先建立生质体共培养转化法，主要差别是首先建立悬浮细胞系。悬浮细胞系。 (2)DNA (2)DNA的直接转移的直接转移 DNADNA的直接转移的直接转移是指利用植物细胞的生物学特是指利用植物细胞的生物学特件、通过物理化学的方法将外源基因转入受件、通过物理化学的方法将外源基因转入受体植物细胞的技术。体植物细胞的技术。为克服农杆菌介导法的宿主局限性，巳发展为克服农杆菌介导法的宿主局限性，巳发展了电击法了电击法( (电穿孔法电穿孔法) )、基因枪法、基因枪法( (微弹轰击微弹轰击法法)

57、)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法，多聚物介导法、花粉管通导法等介导法，多聚物介导法、花粉管通导法等DNADNA直接转移技术。直接转移技术。 多聚物介导法多聚物介导法聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是常、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是常用的协助基因转移的多聚物，尤以用的协助基因转移的多聚物，尤以PEGPEG应用最广。应用最广。这些多聚物和二价阳离子这些多聚物和二价阳离子( (如如MgMg2+2+、CaCa2+2+、MnMn2+2+) )与与DNADNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过混合，能在原生质体表面形成沉淀颗

58、粒，通过原生质体的内否噬作用而被吸收进入细胞内。原生质体的内否噬作用而被吸收进入细胞内。 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是细胞融合剂。它们可以使细胞膜之间或使细胞融合剂。它们可以使细胞膜之间或使DNADNA与膜与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。还可以引形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜间的融合和外源利于细胞膜间的融合和外源DNADNA进入原生质体。进入原生质体。本法中本法中线性线性DNADNA比环形比环形DNADNA有

59、更高的转化效率，而单有更高的转化效率，而单链链DNADNA又比双链又比双链DNADNA更为有效更为有效。这与质粒。这与质粒DNADNA分子对分子对大肠杆菌细胞的转化完全相反。大肠杆菌细胞的转化完全相反。 电穿孔转化法电穿孔转化法细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后，被击穿的膜孔胞致命的伤害，当移去外加电压后，被击穿的膜孔可被修复。可被修复。 激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法此方法是利用此方法是利用直径很小，能量很高的激光微

60、束能引起细胞膜直径很小，能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成用激光光源替代荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源膜穿孔，处于细胞周围的外源DNADNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。这种利用激光微束照射受体细胞实现外源这种利用激光微束照射受体细胞实现外源DNADNA直接导入、整直接导入、整合和表达的技术称之为合和表达的技术称之为激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法。激光微束穿孔转化法的优点：操作简便快捷；基因转移效率