第四讲酶催化、生物催化与微生物

1、12 酶是生物催化剂，生物催化剂不仅包括从酶是生物催化剂，生物催化剂不仅包括从生物体（微生物、动物、植物）中提取的生物体（微生物、动物、植物）中提取的各种各种游离酶游离酶，还包括可以直接作为酶源使，还包括可以直接作为酶源使用的各种用的各种生物细胞生物细胞、固定化的酶固定化的酶和和固定化固定化细胞。细胞。3 因此生物催化剂可以是微生物、动物、植因此生物催化剂可以是微生物、动物、植物的物的整体细胞整体细胞，也可以是从细胞中提出来，也可以是从细胞中提出来的的酶酶。它们可以游离的形式使用，也可以。它们可以游离的形式使用，也可以采用固定化技术将其固定在多孔介质表面采用固定化技术将其固定在多孔介质表面后再

2、使用。后再使用。 4 利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂实现化学转化的过程，称为剂实现化学转化的过程，称为生物催化生物催化。 生物催化中常用的有机体主要是微生物，其生物催化中常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶催化有机化合本质是利用微生物细胞内的酶催化有机化合物的生物转化，又称物的生物转化，又称微生物生物转化。微生物生物转化。 5 微生物生物转化微生物生物转化在有机合成中有着重要的在有机合成中有着重要的用途，它能提供廉价和多样的生物催化用途，它能提供廉价和多样的生物催化剂剂酶酶，或以，或以完整细胞完整细胞直接进行生物催直接进行生物催

3、化。化。6 在生化反应过程中，若采用活细胞在生化反应过程中，若采用活细胞(包括微包括微生物、动物、植物细胞生物、动物、植物细胞)为催化剂时称为催化剂时称发酵发酵或细胞培养或细胞培养过程，若采用游离酶或固定化过程，若采用游离酶或固定化酶时称为酶时称为酶催化过程酶催化过程。7 它们的区别在于它们的区别在于发酵过程发酵过程中除得到反应产中除得到反应产物外，还可能得到更多的生物细胞，而物外，还可能得到更多的生物细胞，而酶酶反应过程反应过程中，酶则不会增长。上述两类反中，酶则不会增长。上述两类反应过程，从催化作用的实质看是没有什么应过程，从催化作用的实质看是没有什么区别的，利用活生物细胞作为催化剂的发区

4、别的，利用活生物细胞作为催化剂的发酵生化反应，其实质也是酵生化反应，其实质也是通过生物细胞内通过生物细胞内部的酶起催化作用。部的酶起催化作用。8第一节第一节 微生物转化反应的特点微生物转化反应的特点 微生物转化反应，可以采用发酵方式进行微生物转化反应，可以采用发酵方式进行转化，也可以按静止的洗涤细胞或固定化转化，也可以按静止的洗涤细胞或固定化细胞等方式进行连续生产。它与有机化学细胞等方式进行连续生产。它与有机化学合成和酶法合成相比较有下列特点。合成和酶法合成相比较有下列特点。91 对立体结构合成具有高度的专一选择性对立体结构合成具有高度的专一选择性 微生物转化反应微生物转化反应是一种酶的催化反

5、应，对是一种酶的催化反应，对底物底物(即反应物即反应物)作用时，具有高度的立体结作用时，具有高度的立体结构选择性；它不仅对结构有构选择性；它不仅对结构有化学选择性化学选择性和和非对映异构体选挥性非对映异构体选挥性，并且有严格的，并且有严格的区域区域选择性选择性、面选择性面选择性和和对映异构体选择性对映异构体选择性。10（1）化学选择性）化学选择性 同一微生物在不同的培养基中培养，其转同一微生物在不同的培养基中培养，其转化底物产生不同的化底物产生不同的化学选择性化学选择性。 NONH2NOOH红球菌红球菌COCl2CNNNC(10.1)(10.2)(10.3)2-甲基丁腈光气3-氰基吡啶11 例

6、如红球菌生长在含有例如红球菌生长在含有COCl2培养基中，所培养基中，所产 生 的 酶 将 底 物 （产 生 的 酶 将 底 物 （ 1 0 . 1 ） 水 解 为 酰 胺） 水 解 为 酰 胺（10.2）；而生长在含有）；而生长在含有2-甲基丁腈甲基丁腈培养基培养基中，所产生的酶将底物（中，所产生的酶将底物（10.1）水解为羧酸）水解为羧酸（10.3）。）。12（2） 非对映异构体选挥性非对映异构体选挥性 非对映异构体选择性非对映异构体选择性是指对非对映异构体是指对非对映异构体的氢或基团进行催化反应，导入一个非对的氢或基团进行催化反应，导入一个非对映体的基团。这类选择性生物催化的例子，映体的

7、基团。这类选择性生物催化的例子，大多是对亚甲基中大多是对亚甲基中2个非对映体氢的进行催个非对映体氢的进行催化，导入一个基团。化，导入一个基团。 13OOCH3OOCH3HO黑根霉OOCH2OHOAcOOCH2OHOAcHO新月弯孢霉(10.4)(10.5)(10.6)(10.7)黄体酮黄体酮14 例如来自黑根霉生物体的酶选择性氧化羟例如来自黑根霉生物体的酶选择性氧化羟基基黄体酮黄体酮（10.4）的）的11-位氢，生成位氢，生成11-羟羟基黄体酮（基黄体酮（10.5）；而来自新月弯孢霉生）；而来自新月弯孢霉生物体的酶则选择性地氧化物体的酶则选择性地氧化甾体化合物甾体化合物的的（10.6）的）的1

8、1-位非对映异构体氢，形成位非对映异构体氢，形成11-羟基化合物（羟基化合物（10.7）。）。 15（3）区域选择性）区域选择性 HOCOOH诺卡氏菌粪产碱杆菌16 应用粪产碱杆菌对乙基环己烷选择性氧化应用粪产碱杆菌对乙基环己烷选择性氧化时仅作用于时仅作用于4-位上的次甲基位上的次甲基，生成反式乙，生成反式乙基环己烷醇，侧链不起氧化反应；而诺卡基环己烷醇，侧链不起氧化反应；而诺卡氏菌对丁基环己烷选择性氧化时，仅作用氏菌对丁基环己烷选择性氧化时，仅作用于于环己烷的侧链丁基环己烷的侧链丁基，生成环己烷丁酸，生成环己烷丁酸，显示了酶的区域选择性氧化反应。显示了酶的区域选择性氧化反应。17（4）面选择

9、性）面选择性 无环无环-酮酯易被酵母还原为酮酯易被酵母还原为-羟酯，羟酯， -羟羟酯酯(这种产物这种产物)是是-内酰胺、昆虫激素和类胡内酰胺、昆虫激素和类胡萝卜素等合成的手性源。萝卜素等合成的手性源。OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母18OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母R1小小 COOR2大大R1大大 COOR2小小H-H-酮酯酮酯-酮酮酯酯19 氢负离子按氢负离子按Prelog规则从空间位阻小的一规则从空间位

10、阻小的一面向羰基亲核进攻，形成稳定的优势中间面向羰基亲核进攻，形成稳定的优势中间体，还原醇的手性中心构型由体，还原醇的手性中心构型由底物结构决底物结构决定定，即与羰基两侧取代基的大小有关。，即与羰基两侧取代基的大小有关。 20（5）对映异构体选择性）对映异构体选择性 OHOOCCOOHHHHOHHOOCCOOHOHHHOHHOOCCOOHOHH粪产碱杆菌枯草杆菌(10.8)(10.9)(10.10)环氧马来酸环氧马来酸(S,S)-酒石酸(R,R)-酒石酸21 如 一 种 粪 产 碱 杆 菌如 一 种 粪 产 碱 杆 菌 ( A l c a l i g e n e s levotartaricu

11、s)微生物催化环氧马来酸微生物催化环氧马来酸(10.8)的水解反应，其产物为的水解反应，其产物为(S,S)-酒石酸酒石酸(10.9)；而以枯草杆菌微生物催化（；而以枯草杆菌微生物催化（10.8）的水解产物则为的水解产物则为(R,R)-酒石酸酒石酸（10.10）。）。22 这种严格的立体结构选择性，对有机合成这种严格的立体结构选择性，对有机合成特别是药物合成来说是非常重要的。因为特别是药物合成来说是非常重要的。因为药物的异构体不仅无效或低效，并且往往药物的异构体不仅无效或低效，并且往往还有副作用，甚至有相反的药效和强力的还有副作用，甚至有相反的药效和强力的毒性。毒性。23 特别像生理活性很高的激

12、素、抗生素以及特别像生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效对立心血管系统和神经系统等药物的药效对立体结构的要求很高往往具有严格对映体体结构的要求很高往往具有严格对映体构型的要求，此为有机化学合成方法难以构型的要求，此为有机化学合成方法难以达到的。达到的。242 微生物转化反应条件温和、设备简单、微生物转化反应条件温和、设备简单、公害少并且反应速率快公害少并且反应速率快 微生物转化反应一般都在常温和微生物转化反应一般都在常温和pH为为7左左右进行催化合成，无需高压、强热等苛刻右进行催化合成，无需高压、强热等苛刻的条件，所以设备简单，反应条件温和，的条件，所以设备简单，反应

13、条件温和，生产安全；原料除底物和普通培养基外没生产安全；原料除底物和普通培养基外没有其他化学品，因此一般无公害。有其他化学品，因此一般无公害。25 微生物转化反应是酶催化反应，在最适条微生物转化反应是酶催化反应，在最适条件下，酶能在一秒钟内使件下，酶能在一秒钟内使102106个底物个底物分子转变成产物。分子转变成产物。 263 微生物转化收率高、成本低微生物转化收率高、成本低 微生物转化反应是在全细胞内进行，保持微生物转化反应是在全细胞内进行，保持原有整体酶系统比较符合生物催化所需环原有整体酶系统比较符合生物催化所需环境与条件，在境与条件，在氧化氧化-还原还原等催化反应时不需等催化反应时不需添

14、加辅酶（辅酶非常不稳定，难以分离制添加辅酶（辅酶非常不稳定，难以分离制取，这是酶法合成中很难补救的）。取，这是酶法合成中很难补救的）。27 微生物转化反应可以持续进行，反应量大，微生物转化反应可以持续进行，反应量大，收率高，可以大规模工业生产。加上设备收率高，可以大规模工业生产。加上设备和原料简单易得等优点，生产成本不仅低和原料简单易得等优点，生产成本不仅低于酶法合成，并且也低于化学合成。于酶法合成，并且也低于化学合成。284 微生物转化可以减少反应步骤微生物转化可以减少反应步骤 通过酶合成基因构建得到的基因工程菌，通过酶合成基因构建得到的基因工程菌，可以将原需几步催化中间体过程在一次发可以将

15、原需几步催化中间体过程在一次发酵中转化完成。酵中转化完成。 将几步中间体合成中转化酶的合成基因，将几步中间体合成中转化酶的合成基因，通过基因构建于同一个工程菌中，在发酵通过基因构建于同一个工程菌中，在发酵法转化时需几步催化合成的中间体就能一法转化时需几步催化合成的中间体就能一步转化成功。步转化成功。29 例如维生素例如维生素C生物合成中基因重组生物合成中基因重组葡萄糖酸葡萄糖酸氧化杆菌氧化杆菌的代谢工程菌，将的代谢工程菌，将L- -山梨糖脱氢山梨糖脱氢酶基因酶基因和和L- -山梨酮脱氢酶山梨酮脱氢酶基因，通过基因基因，通过基因重组构建成一个代谢工程菌，发酵可以在重组构建成一个代谢工程菌，发酵可

16、以在同一次转化发酵中将同一次转化发酵中将D-山梨醇转化成山梨醇转化成-酮酮-L-古洛糖酸古洛糖酸。30第二节第二节 生物转化实验方法生物转化实验方法 1 生物催化剂的来源与制备方法生物催化剂的来源与制备方法 2 微生物转化实验过程微生物转化实验过程 3 微生物转化方法微生物转化方法 4 微生物转化的影响因素微生物转化的影响因素 5 产物的检测与分离纯化产物的检测与分离纯化 6 对映体过量对映体过量311 生物催化剂的来源与制备方法生物催化剂的来源与制备方法 离体酶主要来源于动物、植物、微生物等离体酶主要来源于动物、植物、微生物等的含酶细胞、组织或器官，通过提取法可的含酶细胞、组织或器官，通过提

17、取法可制得多种离体酶。制得多种离体酶。32 例如，从动物胃中提取分离例如，从动物胃中提取分离胃蛋白酶胃蛋白酶；从；从动物胰脏中提取动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶脂肪酶，或这些酶的混合制剂胰酶；从动，或这些酶的混合制剂胰酶；从动物血液中提取物血液中提取超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（SOD）；）；从木瓜中提取从木瓜中提取木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶；从波萝中提取；从波萝中提取波萝蛋白酶波萝蛋白酶；从大肠杆菌中提取；从大肠杆菌中提取谷氨酰胺谷氨酰胺酶酶等。等。33 完整细胞主要来自于微生物，通过微生物完整细胞主要来自于微生物，通过微生物发酵法来制备各种含酶细胞。例如以酿酒发

18、酵法来制备各种含酶细胞。例如以酿酒酵母为菌种进行发酵，可得到含有酵母为菌种进行发酵，可得到含有丙酮酸丙酮酸脱羧酶脱羧酶和和乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶等多种酶和辅酶的酵等多种酶和辅酶的酵母细胞。母细胞。34 有机合成中所用的酶一般为粗品，其酶含有机合成中所用的酶一般为粗品，其酶含量仅有量仅有130，其余是无活性的蛋白质、，其余是无活性的蛋白质、稳定剂、盐或者含有提取过程中混杂进来稳定剂、盐或者含有提取过程中混杂进来的多糖。的多糖。酶的粗品比纯品更为稳定，但粗酶的粗品比纯品更为稳定，但粗酶催化反应的副产物多酶催化反应的副产物多。随着蛋白质分离。随着蛋白质分离纯化技术的发展，生物催化反应中纯酶的纯化技术的

19、发展，生物催化反应中纯酶的使用正在逐步增加。使用正在逐步增加。352 微生物转化实验过程微生物转化实验过程 微生物转化实验的简要过程如下：微生物转化实验的简要过程如下： 选择菌种选择菌种成熟菌丝或孢子的培养成熟菌丝或孢子的培养选择选择适当的转化方式适当的转化方式转化培养转化培养(即生物转化即生物转化)或或转化菌丝及孢子悬浮液转化转化菌丝及孢子悬浮液转化转化液的分转化液的分离提取离提取产品精制产品精制 36（1）选择菌种）选择菌种 选好菌种是进行转化反应的关键步骤选好菌种是进行转化反应的关键步骤；可；可以根据转化反应类型，选择能产生催化这以根据转化反应类型，选择能产生催化这类反应酶的微生物。一般

20、可向国家、地方类反应酶的微生物。一般可向国家、地方保管菌种委员会或学校、研究机关去函索保管菌种委员会或学校、研究机关去函索取、购买。取、购买。37（2）配制培养基）配制培养基 一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满和富含需要的酶。按转化菌种的培养特征和富含需要的酶。按转化菌种的培养特征和转化反应需要配制培养基。和转化反应需要配制培养基。 为成熟菌丝或孢子的培养做准备。为成熟菌丝或孢子的培养做准备。38（3）投转化底物）投转化底物 选择适当的菌株生长期加底物，并考虑选选择适当的菌株生长期加底物，并考虑选择加底物的方法择加底物的方法(例如固体加料或液体加料例如固体

21、加料或液体加料)和方式和方式(例如连续或间歇加料例如连续或间歇加料)。39（4）添加刺激剂或抑制剂）添加刺激剂或抑制剂 添加刺激剂的目的是提高酶活力和增加酶添加刺激剂的目的是提高酶活力和增加酶生长量。添加抑制剂的目的是抑制酶副反生长量。添加抑制剂的目的是抑制酶副反应或抑制其他对反应不良酶的生长。应或抑制其他对反应不良酶的生长。 40(5) 转化过程中各项影响因素的控制转化过程中各项影响因素的控制 例如开始加底物时间，加入的底物和转化例如开始加底物时间，加入的底物和转化的产物在转化环境中最大稳定的滞留时间；的产物在转化环境中最大稳定的滞留时间；适宜的转化温度；适宜的转化温度；pH值和菌丝浓度等。

22、值和菌丝浓度等。 41（6）转化反应终点的控制）转化反应终点的控制 根据影响转化反应的各种因素，控制好转根据影响转化反应的各种因素，控制好转化反应培养终点，使底物转化达最大反应化反应培养终点，使底物转化达最大反应完全值。当取样分析反映转化培养液中转完全值。当取样分析反映转化培养液中转化产物积累量不再增加时，立刻采用物理化产物积累量不再增加时，立刻采用物理方法将菌丝体方法将菌丝体(包括转化反应的胞外酶包括转化反应的胞外酶)及培及培养物除去来停止转化反应。养物除去来停止转化反应。42（7）分离精制转化产物）分离精制转化产物 转化产物已与生物转化系统分开，可按化转化产物已与生物转化系统分开，可按化学

23、方法将产物分离精制。一般来说转化过学方法将产物分离精制。一般来说转化过滤液中杂质含量大，产物浓度低。滤液中杂质含量大，产物浓度低。 43微生物转化实验过程微生物转化实验过程 选择菌种选择菌种 成熟菌丝或孢子的培养成熟菌丝或孢子的培养 选择适当的转化方式？选择适当的转化方式？ 转化培养转化培养(即生物转化即生物转化)或转化菌丝及孢子悬或转化菌丝及孢子悬浮液转化浮液转化 转化液的分离提取转化液的分离提取 产品精制产品精制443 微生物转化方法微生物转化方法 生长细胞培养转化法生长细胞培养转化法 静止细胞培养转化法静止细胞培养转化法 固定化细胞转化法固定化细胞转化法45生长细胞培养转化法生长细胞培养

24、转化法 生长细胞培养生长细胞培养转化法，是在微生物细胞培转化法，是在微生物细胞培养前或培养一段时间后，直接将养前或培养一段时间后，直接将底物底物投入投入到微生物生长培养基中，利用微生物自身到微生物生长培养基中，利用微生物自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化。繁殖生长的同时对底物进行生物转化。 这种转化一般在这种转化一般在摇瓶摇瓶或或发酵罐发酵罐中进行培养中进行培养转化。转化。 46 摇瓶转化摇瓶转化实验主要用于筛选菌种和发酵罐实验主要用于筛选菌种和发酵罐放大转化反应条件的选择。放大转化反应条件的选择。 在通气的条件下将微生物培养至生长旺盛在通气的条件下将微生物培养至生长旺盛的的对数生长期的中期

25、对数生长期的中期，或在，或在后期后期所产生酶所产生酶的晚期时加入底物进行转化；极个别也有的晚期时加入底物进行转化；极个别也有在生长早期加底物，此根据转化需要的酶在生长早期加底物，此根据转化需要的酶生长情况。生长情况。47 加入的底物可以粉末状的固体或底物的水加入的底物可以粉末状的固体或底物的水溶液，必要时也可以应用有机溶剂；投料溶液，必要时也可以应用有机溶剂；投料方式可以一次或分批。方式可以一次或分批。48 生长细胞培养转化法是最简单和最常用的生长细胞培养转化法是最简单和最常用的一种方法，一种方法，优点是微生物生物转化容易、优点是微生物生物转化容易、效率高，缺点是产物的后处理及分离纯化效率高，

26、缺点是产物的后处理及分离纯化烦琐。烦琐。 一般适用于经过诱变处理的微生物菌株，一般适用于经过诱变处理的微生物菌株，它可以底物作为唯一碳源，也能适应连续它可以底物作为唯一碳源，也能适应连续化生产过程。化生产过程。 49静止细胞培养转化法静止细胞培养转化法 静止细胞培养静止细胞培养转化法，是把微生物细胞在转化法，是把微生物细胞在一定的条件下培养一段时间后，经离心收一定的条件下培养一段时间后，经离心收集菌体，将菌体悬浮于水或缓冲溶液中，集菌体，将菌体悬浮于水或缓冲溶液中，然后加入底物，在适宜的温度、然后加入底物，在适宜的温度、pH和振荡和振荡条件下进行转化的方法。条件下进行转化的方法。50 静止细胞

27、转化法是静止细胞转化法是将一种生长影响减至最将一种生长影响减至最小情况下进行生物转化小情况下进行生物转化。 它通过提高菌丝体浓度可以达到加快转化它通过提高菌丝体浓度可以达到加快转化速率的目的。速率的目的。51 应用应用干细胞进行转化干细胞进行转化是另一种静止细胞转是另一种静止细胞转化法，便于贮备随时使用。干细胞制备有化法，便于贮备随时使用。干细胞制备有两种方法，两种方法，冷冻干燥法冷冻干燥法和和丙酮干粉制备法。丙酮干粉制备法。 静止细胞培养转化法的优点是静止细胞培养转化法的优点是产物后处理产物后处理简单、没有培养基成分的污染，缺点是增简单、没有培养基成分的污染，缺点是增加了额外的菌体收集与重悬

28、过程。加了额外的菌体收集与重悬过程。52固定化细胞转化法固定化细胞转化法 固定化细胞固定化细胞转化法是指利用化学或物理手转化法是指利用化学或物理手段将段将游离的细胞游离的细胞定位于限定的空间区域并定位于限定的空间区域并使其保持活性及可以反复使用的特性，然使其保持活性及可以反复使用的特性，然后用于催化有机化合物的生物转化得到所后用于催化有机化合物的生物转化得到所需产物的方法。需产物的方法。 53 制取固定化细胞的方法分为两大类：制取固定化细胞的方法分为两大类： 将细胞与固定材料通过化学反应相结合或将细胞与固定材料通过化学反应相结合或分子键的缔合，称分子键的缔合，称共价键合共价键合； 将整个细胞包

29、埋在胶质材料（如角叉菜胶、将整个细胞包埋在胶质材料（如角叉菜胶、卡拉胶和海藻胶等）内，称卡拉胶和海藻胶等）内，称包埋法包埋法。 54 目前获得广泛应用的固定化方法有聚丙烯目前获得广泛应用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合的固定化方法和角叉菜胶的包埋酰胺聚合的固定化方法和角叉菜胶的包埋法，其固定化细胞也可悬浮于培养基中发法，其固定化细胞也可悬浮于培养基中发酵生长同时进行生物转化，以保证辅酶的酵生长同时进行生物转化，以保证辅酶的再生以及新活细胞的生长。再生以及新活细胞的生长。55 固定化细胞转化最大优点固定化细胞转化最大优点可以长期反复使可以长期反复使用用，有的能维持有效催化达数月之久，还，有的能维持有

30、效催化达数月之久，还有有分离纯化容易分离纯化容易，因此便于自动化和大规，因此便于自动化和大规模工业生产；模工业生产； 缺点缺点是固定化细胞的生物转化活性比游离是固定化细胞的生物转化活性比游离细胞的生物活性低。细胞的生物活性低。 564 微生物转化的影响因素微生物转化的影响因素 微生物生物转化最重要的步骤是微生物生物转化最重要的步骤是底物与催底物与催化反应的酶之间的相互接触化反应的酶之间的相互接触，而参与生物，而参与生物转化反应的微生物酶一般是转化反应的微生物酶一般是微生物胞内酶，微生物胞内酶，底物必须能透过细胞壁和细胞膜底物必须能透过细胞壁和细胞膜。57 因此底物添加方法对转化率有很大影响，因

31、此底物添加方法对转化率有很大影响，必须考虑底物的各种性质必须考虑底物的各种性质 如如渗透性渗透性、溶解性溶解性、稳定性稳定性及毒性等。及毒性等。58 如果添加能溶于水的底物到培养基中进行如果添加能溶于水的底物到培养基中进行转化是比较容易的，主要注意的问题是转化是比较容易的，主要注意的问题是加加底物量的多少，添加的速度和底物对转化底物量的多少，添加的速度和底物对转化的微生物是否有毒性的微生物是否有毒性。 应用含酶活力强和含酶量多的微生物进行应用含酶活力强和含酶量多的微生物进行转化时，添加底物的速度可以快，添加底转化时，添加底物的速度可以快，添加底物的量也可以多。物的量也可以多。59 对一般微生物

32、转化来说，非离子化合物的对一般微生物转化来说，非离子化合物的底物底物最大投料质量浓度约为最大投料质量浓度约为10；对离子；对离子化合物的底物最大的投料质量浓度约化合物的底物最大的投料质量浓度约5。 60 此外，不同的微生物对有毒的底物的忍受此外，不同的微生物对有毒的底物的忍受力是不一样的，添加底物速度与添加量要力是不一样的，添加底物速度与添加量要低于微生物的忍受量；低于微生物的忍受量；一般在微生物生长一般在微生物生长期耐受有毒底物的能力比较低。期耐受有毒底物的能力比较低。61 必须注意的是即使非毒性的底物，当转化必须注意的是即使非毒性的底物，当转化到积累至大量时，也能产生对转化微生物到积累至大

33、量时，也能产生对转化微生物的抑制作用。的抑制作用。最好随时分离转化产物。最好随时分离转化产物。 例如采用两相例如采用两相(水、有机溶剂水、有机溶剂)转化法或固定转化法或固定化细胞转化法。化细胞转化法。62 如果如果添加不能溶于水的底物添加不能溶于水的底物是比添加水溶是比添加水溶性的底物要困难得多。可以采用多种方法性的底物要困难得多。可以采用多种方法加以克服：加以克服：63 （1）用细粉末状的固体投料。用细粉末状的固体投料。这样可使转这样可使转化细胞和粉末底物之间有最佳的接触面积。化细胞和粉末底物之间有最佳的接触面积。若要转化气体状态的碳氢化合物若要转化气体状态的碳氢化合物(如甲烷如甲烷)，以气

34、泡形式从底部通气，使泡慢慢通过转以气泡形式从底部通气，使泡慢慢通过转化培养基来增加相互接触面积，获得良好化培养基来增加相互接触面积，获得良好的转化效果。的转化效果。64 （2）利用非毒性表面活性剂利用非毒性表面活性剂 利用非毒性利用非毒性表面活性剂如表面活性剂如吐温吐温80类类也能分散不溶性底也能分散不溶性底物，增加转化细胞和底物相间接触。物，增加转化细胞和底物相间接触。 65 (3) 利用无毒性溶剂利用无毒性溶剂 如如95%乙醇、丙酮、乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜等来溶解底二甲基甲酰胺和二甲亚砜等来溶解底物，这是较理想的办法；但是这类有机溶物，这是较理想的办法；但是这类有机溶剂

35、在水中的溶解度很大，且底物浓度很高，剂在水中的溶解度很大，且底物浓度很高，因此每次添加的量应尽量的少，最好在添因此每次添加的量应尽量的少，最好在添加底物前测定该有机溶剂的忍耐度。加底物前测定该有机溶剂的忍耐度。66 另外，在培养菌丝体和转化过程中的适当另外，在培养菌丝体和转化过程中的适当阶段，有时另加诱导物，促进剂或抑制剂阶段，有时另加诱导物，促进剂或抑制剂来促进酶的生成，提高酶的转化活力或抑来促进酶的生成，提高酶的转化活力或抑制副反应产生。制副反应产生。675 产物的检测与分离纯化产物的检测与分离纯化 在生物转化过程中底物的减少或产物的增在生物转化过程中底物的减少或产物的增加可采用薄层色谱法

36、加可采用薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱、高效液相色谱法法(HPLC)或气相色谱法或气相色谱法(GC)等分析技术进等分析技术进行鉴定。行鉴定。68 根据分析结果可以随时判断生物转化进行根据分析结果可以随时判断生物转化进行的程度，确定底物的最高转化率和产物的的程度，确定底物的最高转化率和产物的收率等，得出生物转化反应的最佳条件。收率等，得出生物转化反应的最佳条件。69 产物的分离纯化产物的分离纯化一般先将微生物细胞与转一般先将微生物细胞与转化液相分离化液相分离，常采用抽滤或离心法（固定，常采用抽滤或离心法（固定化细胞转化法则可省去此步骤）。化细胞转化法则可省去此步骤）。 然后用有机溶剂从滤液中

37、萃取转化产物，然后用有机溶剂从滤液中萃取转化产物，若为非中性产物则应调节溶液若为非中性产物则应调节溶液pH值，以提值，以提高萃取效率。高萃取效率。 70 虽然生物转化产物绝大多数存在于转化液虽然生物转化产物绝大多数存在于转化液中，但在菌丝体中也会残留一些，因此很中，但在菌丝体中也会残留一些，因此很有有必要用有机溶剂对菌丝体萃取必要用有机溶剂对菌丝体萃取12次次，以，以提高转化产物的收率。提高转化产物的收率。71 真菌类转化产物的分离一般先采用真菌类转化产物的分离一般先采用离心或离心或抽滤法抽滤法将菌丝体与转化液相互分离；将菌丝体与转化液相互分离； 但细菌类转化产物的分离一般则不需要采但细菌类转化产物的分离一般则不需要采用分离步骤，可直接用有机溶剂萃取产物。用分离步骤，可直接用有机溶剂萃取产物。直接用有机溶剂萃取可能会导致产物中含直接用有机溶剂萃取可能会导致产物中含有少量细胞组分。有少量细胞组分。72 萃取所得粗品需进一步的分离纯化才能得萃取所得粗品需进一步的分离纯化才能得到纯品。到纯品。 常用的精制方法有重结晶、柱层析法和色常用的精制方法有重结晶、柱层析法和色谱法等。谱法等。736 对映体过量对映体过量 有机合成中常用有机合成中常用化学产率化学产率(yield)来描述有来描述有机合成反应的实验结果，产率是指实际产机合成反应