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文档简介
1、精选优质文档-倾情为你奉上【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程,学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。【实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Gly)组成的天然三肽,是一种含巯基(SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物,在波长412nm处具有最大光吸收。因此,利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。【器材与试
2、剂】1. 实验仪器与用具研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计2. 实验试剂还原型谷胱甘肽标准液;偏磷酸溶液;磷酸溶液缓冲液(pH7);二硫代硝基苯甲酸(5,5-dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)溶液; 蒸馏水。3. 实验材料小麦叶片【实验步骤】1. 标准曲线制作取7支试管,编号,按照下表加入各种试剂,混匀,25保温反应10min。以1号管为参比调零,测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标,还原型谷胱甘肽物质的量(mol)为横坐标,绘制标准曲线。试剂(ml) 试管号123456710g/ml GSH标准液00.10.20.40.60.8
3、1.0蒸馏水2.01.91.81.61.41.21.0pH7磷酸缓冲液4.04.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.40.40.40.40.40.40.4GSH浓度 g/2ml012468102. 提取取材后,称取0.2g样品置于研钵中,加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后,定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量,测量提取液体积。3. 测定取上清液2ml,显色,操作同标准曲线。重复3次。显色反应后,分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值,从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量,计算还原型谷胱甘肽含量(mol/g)。4.计
4、算GSH含量(mol/g)=(Cx×Vt)/ (FW×VS)式中,Cx为2ml样品中GSH的含量(g);Vt为样品提取液总体积(ml);Vs为显色时样品液体积(ml);FW为样品质量(g)。【实验结果】1.标准曲线试管编号1234567GSH浓度(g/2ml)01246810吸光度值A00.0670.1340.3140.4520.5790.723以GSH浓度(g/2ml)为横坐标,吸光度值为纵坐标,建立标准曲线。2.小麦叶片中GSH含量实验重复三次,测定结果如下:重复123样品质量(FW)0.2050.2040.206吸光度0.1930.1920.196Cx0.01410.01400.0143GSH含量(mol/g)0.2060.2060.208GSH含量平均值0.207【注意事项】1. 在提取样品时,需要沉淀出去蛋白质,以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽(GSSG+GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。在谷胱甘肽还原酶(GR)作用下,将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。3. 建议在第
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