时间分辨荧光分析法 - 副本

1、时间分辨荧光分析法及其应用目录 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 三、时间分辨荧光分析技术简介 四、时间分辨荧光分析法的应用 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用 六、展望一、基本概念：n 1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。n 2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光(fluorescence)。n 3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分

2、析法(fluorometry)。5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点1.原理 TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合

3、剂、增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。时间分辨荧光免疫原理图2.优点 TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点： 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激发光干扰就可以排除。 镧系元素与通常的荧光

4、物质相比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103106倍。 镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物，稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达 2 年。三、时间分辨荧光分析技术简介 TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、分析缓冲液、增强溶液。 基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。1.基础试剂：1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 B族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐(samarium ,Sm)

5、、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以 Eu3 +常用。 示踪剂的使用 一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和 常温真空抽干,然后干燥保存。1.2 稀有元素双功能螯合剂 稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸) 连接。1.3 增强溶液 免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬

6、灭剂。所以要加入一种增强液。增强液一般由-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0 3.2)组成。2.基本技术：2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基酸数

7、目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不成正比关系。镧系离子Eu3 +可用来标记核酸探针。2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋

8、白质类大分子化合物。2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相抗原.四、时间分辨荧光分析法的应用1.在免疫学的应用1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临床上常检测补体C3来评价免疫系统的功能。2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高

9、,在1979年它的理论形成后,研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗体TRFIA方法.3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前,稀土元素标记探针技术已用于检测HIV、检测前列腺特异性抗原( PSA)的mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA227等位基因,获得了满意的结果。4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测动物的激素; TR

10、FIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等各个方面。 五、时间分辨荧光分析法在真菌毒素检测方 面的应用 1.真菌霉素概述 真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对食品、农作物及饲料等污染很严重。 当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄

11、曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2 毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。 .2.真菌毒素的测定方法 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、HPLC 法等，这些方法都不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构类似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取进行净化处理，操作烦琐，有机试剂用量大，提取效率低，环境污染严重。 酶联免疫分析法（ELISA）灵敏、且快速、低成本，但 ELISA是一种定性或半定量的方法，当选择的不同单克隆抗体，会造成结果存在一定的误差，所以这种定量，相对不太准确。 TRFIA 具有排除其他荧光干扰，灵敏度高，一

12、次可以测多个样品的优势，将成为检测真菌毒素的主要方法.3.实例分析：黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫分析 黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）的某些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1 和G2。另外还从牛奶中分离出黄曲霉毒素的两种代谢产物M1、M2。黄曲霉毒素常存在于花生、核桃等坚果中，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常被发现。黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，在天然污染的食品中以黄曲

13、霉毒素B1（AFB1）最为多见，其毒性和致癌性也最强，AFB1 的毒性比氰化钾大10 倍，比砒霜大68 倍。 AFB1 干扰信息RNA 和DNA 的合成，是在翻译水平上干扰了蛋白质生物合成，影响细胞代谢，因而它与人类及动物的许多疾病存在着联系。 AFB1引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎, 肝区疼痛，黄疸，肝硬化, 肝坏死乃至死亡，还可有心脏扩大、痉挛、昏迷、胃肠道大出血等异常表现。长期食用被AFB1 污染的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因，也能诱发肾癌、乳腺癌及卵巢癌等。AFB1的作用机制及对人体的危害 世界卫生组织推荐食品、饲料中AFB1的含量不能超过15g/kg，在婴儿

14、食品中不能检出;欧盟国家的规定更加的严格，规定了日常生活食用品中的 AFB1的含量不得超过2g/kg，总量不超过4g/kg，最近已将部分食品中的 AFB1的含量限定在0.1g/kg 以内。 我国对 AFB1的污染和控制也非常重视，在1982年颁布了粮油和发酵食品中的AFB1允许量标准。规定大米、食用油中AFB1的含量不超过10g/kg，其他粮食、豆类及发酵食品的含量不能超过5g/kg。各国的标准材料与仪器 材料 黄曲霉毒素B1 、 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、 偶联牛血清白蛋白的黄曲霉毒素B1（AFB1-BSA）、 牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化酶（HRP）、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐

15、剂、96 孔微孔板、 亲和层析纯化的羊抗兔IgG 、Sephadex-G50 、 Eu3+标记盒（1244-302）、PD-10 等 仪器 紫外吸收测定仪DU-650 ，酶标测定仪3550-UV 全自动TRFIA 检测仪AutoDELFIA 1235AFB1-TRFIA 检测方法的建立： 采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的黄曲霉毒素B1( AFB1) 间接竞争免疫分析法( AFB1-TRFIA) 。以AFB1-BSA 为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗AFB1抗体；AFB1 与辣根过氧化酶的联结物（AFB1-HRP）包被96 孔板为固相抗原，与游离AFB1 共同竞争有限的抗AFB1 抗体；用稀土离

16、子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪。反应过程图 方法 1.抗AFB1 多克隆抗体的制备 先用弗氏完全佐剂1.2 mL 与1mg AFB1-BSA充分混合，形成抗原乳化剂。在兔子背部多位点地进行皮下注射，之后每隔12 周再用弗氏不完全佐剂与AFB1-BSA 充分混匀后多次免疫。在免疫4次后，从兔子的耳缘静脉抽血，分离血清，用免疫双扩散法进行抗体效价的鉴定。免疫6 次后，从兔子心脏采血，分离血清。 2.黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶（AFB1-HRP）的制备 AFB1 为小分子化合物，本身难以吸附到微孔板上，要先与蛋白结合后才可以包被到微孔板上形成固相抗原，AFB1 无活泼基团，要先活化AFB1，

17、合成黄曲霉毒素B1-羧甲基肟（AFB1-0 xime），引入羧基再偶联HRP。 3.固相抗原制备 将AFB1-HRP 用50 mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH9.6 缓冲液稀释至0.5mg/L的包被液, 96 孔微孔板各孔加100L，4放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150 L 含2 g/L 明胶的上述缓冲液封闭，4放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20冷冻保存。 4.Eu3+-羊抗兔抗体的制备 取溶解于50mmol/L PBS pH7.0 的5g/L 羊抗兔抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A2800.74A260)

18、，用洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取500-1000L稀释后的抗体，加入含0.2-0.4mg 的Eu3+-N2-p-异氰酸-苄基-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中反应。Sepharose CL-6B 柱层析之后，A280 监测收集蛋白峰。 5.主要试剂的配制 （1）AFB1 标准的配制 从AFB1 纯品中稀释AFB1，浓度分别为0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.2g/L，0.5g/L，1g/L， 5g/L，10g/L，50g/L，100g/L，200g/L 等，稀释液为甲醇:水=7:3 的溶液，0 g/L 标准为此溶液。 （2）分析缓冲液 为含8mmol/L NaCl、0.1%明胶、

19、50mol/L DTPA、0.1mL/L Tween-80 和0.1%NaN3的pH7.8 Tris-HCl 缓冲液。 6. 检测步骤（1）样品处理（2）间接竞争AFB1-TRFIA 检测步骤7.考核（1）稳定性 比较计数为0浓度点的ED20、ED50、ED80（2）灵敏度 标准曲线零点计数X(平均)-2SD(标准差)，找 对应的浓度（3）回收率 每克样品中加入不同量的AFB1，按检测步骤 测量，再计算实测值与理论值比值（4）特异性 检测抗体与被测物质的交叉反应程度（5）与商品化的AFB1-ELISA 试剂盒比较x结果1. 抗AFB1 兔血清的稀释实验 在AFB1-HRP 板条加分析缓冲液稀释

20、的不同浓度的抗AFB1 兔血清, 结果见图1,抑制率为最高浓度(1:63倍稀释)兔血清结合率的30%-50%时对应的稀释度约为1:1200-1:600 倍，因此合适的工作浓度应在此范围内，我们选择1:1000倍稀释。2. Eu3+-羊抗兔抗体的理化和免疫学鉴定 Eu3+标记物经Sepharose CL-6B 层析，收集第一洗脱峰。以PE-Wallac 提供的Eu3+标准为参考，Eu3+-羊抗兔抗体第一洗脱峰的Eu3+含量为83.5 mol/L，蛋白含量为9.7 mol/L，即平均每个羊抗兔抗体分子上连接了8.6 个Eu3+。3.AFB1-HRP 固相抗原包被量的优化 用包被液将AFB1-HRP

21、稀释为不同浓度进行包被，采用间接竞争AFB1-TRFIA 作各浓度点的结合率,见图2 当AFB1-HRP 固相抗原包被量为0.5mg/L 时，其0 点的结合率较高，曲线的斜率大，此时的竞争最适合,因此选用0.5mg/L AFB1-HRP 固相抗原进行包被。 4.AFB1-TRFIA 的考核 间接竞争AFB1-TRFIA 的结果经对数函数数据处理所得的标准曲线见图3 4.1 方法的灵敏度和稳定性 以零剂量点发光值均值减2SD 后的发光值在标准曲线上得到的相应值为检测的灵敏度，间接竞争AFB1-TRFIA 的灵敏度为0.01 g/L。8 条不同时间进行的间接竞争AFB1-TRFIA 的效应点均值ED80、ED50、ED20 分别为（0.070.01）g/L、（0.630.02）g/L 和（12.50.47）g/L。说明剂量反应曲线的位置漂移小，方法的稳定性好。