生物化学蛋白质1

1、第4章蛋白质(protein)的共价结构1.1.简单蛋白简单蛋白 完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。 根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7 7类：清类：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80%70%-80%的的乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强

2、酸）。蛋白（只能溶于强酸）。2.2.结合蛋白结合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7 7类：类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。黄素蛋白和金属蛋白。 3.3.按蛋白质的生物学功能分类按蛋白质的生物学功能分类 （1 1）催化功能）催化功能 生物体内的生物体内的酶酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。的各种化学反应就无法正常进行。 （2 2

3、）结构功能）结构功能 蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/41/4；细胞膜、线；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。 （3 3）运输功能）运输功能 脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转氧气的作用

4、；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。 （4 4）贮存功能）贮存功能 某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白卵清蛋白、奶类中的奶类中的酪蛋白酪蛋白和小麦种子中的和小麦种子中的麦醇溶蛋白麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，

5、供缺铁时使用。蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。 （5 5）运动功能）运动功能 肌肉中的肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。在水中游动。 （6 6）防御功能）防御功能 高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系

6、统的蛋白因子、通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。 （7 7）调节功能）调节功能 某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。 （8 8）感觉功能）感觉功能 生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如，生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如，感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。视杆细胞中的视紫红质，只需视杆细胞中的视紫红质，只需1 1个光子即可被激

7、发，产生视觉。个光子即可被激发，产生视觉。 （9 9）遗传调控功能）遗传调控功能 遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNADNA在在染色体中在在染色体中是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成阻遏蛋白的抑制，当需要合成半乳糖苷酶时经过去阻遏作半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。用才能表达。 （1010）其他功能）其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。

8、白喉毒某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。素可抑制真核生物的蛋白质合成。 ( (二二) )蛋白质的形状和大小蛋白质的形状和大小 按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。蛋白质的相对分子质量差别很大。蛋白质的相对分子质量差别很大。 （肌联蛋白） 蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次：蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次： 1. 1.一级结构一级结构：多肽链的氨基酸序列。：多肽链的氨基酸序列。 2. 2.二级结构二级结构：多肽链借助氢键形成的有

9、规则的：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如局部结构，如螺旋、螺旋、折叠等。折叠等。 3. 3.三级结三级结构：球状蛋白质在二级结构基础上，构：球状蛋白质在二级结构基础上，借助次级键形成的相对独立的完整结构。借助次级键形成的相对独立的完整结构。 4. 4.四级结构四级结构：具有三级结构的组成单位（亚基）：具有三级结构的组成单位（亚基）之间的聚合方式。之间的聚合方式。（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构 肽键的肽键的C C和和N N均为均为spsp2 2杂化，有部分双键的杂化，有部分双键的性质，相关的性质，相关的6 6个原子处于共平面，称作个原子处于共平面，称作肽肽平面平面，肽平面内两个

10、，肽平面内两个CC多处于反式构型。多处于反式构型。 （二）（二） 肽的物理和化肽的物理和化学性质学性质 肽的等电点计算肽的等电点计算需先分别判断各解离需先分别判断各解离基团的带电荷情况，基团的带电荷情况，再统计净电荷的量再统计净电荷的量（P166P166表表4-64-6）。）。 肽的化学反应与肽的化学反应与氨基酸类似，同时，氨基酸类似，同时，由于肽键的存在由于肽键的存在, ,肽可肽可以进行以进行双缩脲反应双缩脲反应。NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH

11、鹅膏覃碱的化学结构（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽 主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素。主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素。环状八肽，真核生物RNA合成的抑制剂+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催产素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加压素*均为均为9 9肽，肽，仅仅2 2个氨基个氨基酸有差别，酸有差别，生理功能生理功能差别极大。差别极大。 L-Leu-D-Phe

12、-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，含有由细菌分泌的多肽，含有D-D-氨基酸和一些不常氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, Ornithine, 缩写为缩写为 OrnOrn）。）。 它的分子中有一个特殊的肽键，是由谷氨酸的羧基与半胱氨酸的氨基缩合而成。?1Glutathione谷胱甘肽谷胱甘肽O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸( (二二)

13、)N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定 1.1.N-N-末端的测定末端的测定 （1 1）二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB )(DNFB )法法 (Sanger(Sanger法法):):2,4-2,4-二硝基二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离氨基作用，生成端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（二硝基苯衍生物（DNPDNP）。在酸性条件下水解，得到黄色）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基氨基酸可以用色谱法进行鉴定。酸

14、可以用色谱法进行鉴定。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 （2 2）丹磺酰氯法）丹磺酰氯法: :在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与萘磺酰氯）可以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。此法的优点是丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光吸收，氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9mol,mol,比比

15、DNFBDNFB法灵敏法灵敏100100倍。倍。 （3 3）异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(PITC)(PITC)法法: N: N末端氨基酸生末端氨基酸生成相应的成相应的PTHPTH（苯乙内酰硫脲）（苯乙内酰硫脲）AAAA，并脱离肽链，并脱离肽链，可连续测定可连续测定N N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定基酸序列测定 。 （4 4）氨肽酶法氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的它能从多肽链的N-N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸根据不同的反应时间测出酶

16、水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的力学曲线，可以确定蛋白质的N-N-末端残基。末端残基。2.2.C-C-末端的测定末端的测定 （1 1）还原法还原法。C C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 （2 2）肼解法肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除有的肽键，除C C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰末端氨基酸外，其他氨基酸都转变

17、为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离，端氨基酸分离，C C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 （3 3）羧肽酶法羧肽酶法: :将蛋白质在将蛋白质在pH 8.0, 30pH 8.0, 30与与羧肽酶一

18、起保温，按一定时间间隔取样，用纸层羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道间的关系，就可以知道C C末端氨基酸的排列顺序。末端氨基酸的排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自来自胰脏；胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。羧肽酶来自面包酵母。羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸末端氨基酸残基；残基；B B只能水解只能水解ArgAr

19、g和和LysLys为为C-C-末端残基的肽键。末端残基的肽键。通常将二者混合使用。通常将二者混合使用。羧肽酶羧肽酶Y Y可作用于任何氨可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定基酸，因而，除用来测定C C末端氨基酸外，还可末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。以用来测定氨基酸的排列顺序。（三）二硫桥的断裂 巯基化合物还原法巯基化合物还原法过甲酸氧化法过甲酸氧化法（四）氨基酸组成的分析 一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，24小时即可完成。 蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。（五)多肽链

20、的部分裂解和肽段混合物的分离纯化肽段的分离纯化可用层析法或电泳法可以用酶水解法或化学水解法将蛋白质水解成肽段 溴化氰断裂法羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键. 1.Edman化学降解法: 用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54(六)肽段氨基酸序列的测定 2.2.降解法降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶的几个氨基酸。羧肽酶Y Y可作用于任何氨基酸，有可可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基

21、酸的顺序测定仪。能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。 3.3.根据核苷酸序列推定法根据核苷酸序列推定法：分离：分离mRNAmRNA，经反转录经反转录测定测定cDNAcDNA的核苷酸序列的核苷酸序列, , 再用遗传密码推定氨基酸序再用遗传密码推定氨基酸序列。列。 4. 4.质谱法质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序

22、列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。和异亮氨酸。( (七七) )肽段在多肽段在多肽链中次序的肽链中次序的决定肽段决定肽段(八)二硫桥位置的确定用对角线电泳法( (九九) )蛋白质蛋白质测序举例测序举例（胰岛素的（胰岛素的序列测定）序列测定） （一）（一） 同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化细细胞胞色色素素C C的的物物种种差差异异（二）同源（二）同源蛋白质具有蛋白质具有共同的进化共同的进化起源起源1.1.血红素蛋白血红素蛋白与肌红蛋白与肌红蛋白2. 丝氨酸蛋白酶类:显示明显的序列同源性。 基本要

23、求基本要求1.1.掌握蛋白质的分类和功能多样性；掌握蛋白质的分类和功能多样性；2.2.掌握肽的结构特点和基本性质；掌握肽的结构特点和基本性质；3.3.熟悉蛋白质一级结构的测定方法；熟悉蛋白质一级结构的测定方法；4.4.掌握蛋白质一级结构与生物学功能的掌握蛋白质一级结构与生物学功能的关系，熟悉有关的典型例子。关系，熟悉有关的典型例子。（一）酰胺平面与-碳原子的二面角（和）： 规定键两侧基团为顺式排列时为0o，从C沿键轴方向观察，顺时针旋转的角度为正值。由印度学者Ramachandran制作(一)螺旋1.螺旋的结构 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为

24、0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm; 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每一个氨基酸残基的酰胺基团的-NH基与其后第四个氨基酸残基酰胺基团的-CO基形成氢键。 蛋白质分子为右手-螺旋。*3.613螺旋2.螺旋的偶极矩和帽化3.螺旋的手性4.4.影响影响螺旋形成的因素螺旋形成的因素：R R基太小使键角自由度过大，带基太小使键角自由度过大，带同种电荷的同种电荷的R R基相互靠近，基相互靠近，碳原子上有分支均碳原子上有分支均不利于形成不利于形成螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成螺旋。螺旋。5 .其他类型的螺旋4.416螺旋( (二二)

25、)折叠片折叠片 - -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。两个氨基酸之间的轴心距为两个氨基酸之间的轴心距为0.350.35nmnm； - -折叠结构可以由两条肽链之间形成，也可以折叠结构可以由两条肽链之间形成，也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。轴接近垂直。 -转角由四个氨基酸残基组成，弯曲处的第

26、一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。 ( (四四) ) 无规卷曲无规卷曲 无一定的规则无一定的规则, ,但对一定的球蛋白而言但对一定的球蛋白而言, ,特特定的区域有特定的卷曲方式定的区域有特定的卷曲方式. .原纤维原纤维初原纤维初原纤维卷曲的螺旋卷曲的螺旋(一) -角蛋白( (三三) ) 胶原蛋白胶原蛋白( (一一) ) 球状蛋白质的分类球状蛋白质的分类 : : 1. 1.反平行反平行螺旋螺旋2. /-2. /-结构结构3.3.全全-结构结构4.4.富富含含金金属属或或二二硫硫键键的的蛋蛋白白质质胰岛素磷脂酶A2高氧还势铁蛋白铁氧还蛋白( (二二) ) 球状蛋白质三维结构的特征球状蛋白质三维结构的特征 1. 1.含多种二级结构元件含多种二级结构元件; ; 2. 2.具有明显的折叠层次具有明显的折叠层次; ; 3. 3.球蛋白分子是紧密近似球状的实体球蛋白分子是紧密近似球状的实体; ; 4. 4.疏水侧链在分子内部疏水侧链在分子内