《中国药典》无菌检查法修订

1、中国药典无菌检查法修订1、无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。2、无菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。4、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。5、,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。 灭菌产品的无菌保证

2、不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证体系和严格的GMP管理。 1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性 主要内容我国药典无菌检查法的历史发展我国药典无菌检查法与欧美药典的差异中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容2015版中国药典无菌检查法医院制剂进行微生物控制的必要性 修订时间修订时间修订内容修订内容19531953年版年版直接接种法直接接种法 无阳性对照菌取样量无阳性对照菌取样量2 2支支/ /瓶瓶 19631963年版年版直接接种法直接接种

3、法 三种培养基培养基三种培养基培养基 阳性对照金葡阳性对照金葡19771977年版年版直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照金葡直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照金葡19851985年版年版直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。阳性对照金葡阳性对照金葡19901990年版年版同同19851985年版年版19951995年版年版培养基灵敏度检查藤黄、培养基灵敏度检查藤黄、 生孢、白念。阳性对照：金葡生孢、白念。阳性对照：金葡10106 6 ；生孢；生孢10106 6 ；白念；白念10105 51

4、9981998年年阳性对照：金葡阳性对照：金葡10106 6 ；生孢；生孢10106 6 ；白念；白念10105 520002000年版年版实验环境为实验环境为100100级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量6 61111支支/ /瓶；瓶；50 50 毫升以上毫升以上大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。阳性对照：金葡、生孢、大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。阳性对照：金葡、生孢、白念均白念均1010 100100个菌抑细菌和抑真菌试验个菌抑细菌和抑真菌试验20052005年版年版增收隔离系统，环境洁净

5、度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优先采增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为1414天、取消复试。天、取消复试。20102010年版年版在在20052005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展我国药典无菌检查法的历史发展 2005年版主要变化10000下局部100级，隔离系统， GB-洁净度验证培养基适用性检查方法验证试验优先用封闭式薄膜过滤器增加稀释液冲

6、洗液品种直接接种法 “一对一” 延长培养时间为14天对表1 强调了“每种培养基最少检验数量”取消复试2010年版主要变化对无菌检查人员提出专业要求和培训增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液方法验证试验菌：金、大、枯、生、白、黑冲洗量：少量（约100ml）多次，总量不超过1000ml强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异我国药典无菌检查法与欧美药典的差异比较项目比较项目ChP2010ChP2010USP35USP35EP7.0EP7.0检验条件规定检验条件规定总体总体1000010000级、局部级、局部100100级级应在无菌条

7、件下进行。应在无菌条件下进行。 应在无菌条件下进行。应在无菌条件下进行。人员要求人员要求具备微生物专业知识，并经过无菌具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训技术的培训 经培训和认可经培训和认可 经培训和认可经培训和认可 培养基、培养条培养基、培养条件与时间件与时间 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基30303535；202025(25(三部）三部）改良马丁培养基改良马丁培养基 23232828均均培养培养1414天天，转种后细菌培养转种后细菌培养2 2天、真菌培天、真菌培养养3 3天天硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基30303535胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基202

8、02525 培养培养不少于不少于1414天天转种后培养不少于转种后培养不少于4 4天天硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基30303535胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基 20202525培养培养不少于不少于1414天天转种后培养不少于转种后培养不少于7 7天天培养基灵敏度检培养基灵敏度检查与方法验证用查与方法验证用菌株菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉、黑曲霉检验方法检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法过滤法性状允许的样品采用薄膜过滤性状

9、允许的样品采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除，利于抗菌影响去除采用薄膜过滤，利于抗菌影响采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除去除稀释剂与薄膜过稀释剂与薄膜过滤冲洗液滤冲洗液1 1、0.10.1蛋白胨水溶液；蛋白胨水溶液；2 2、pH7.0pH7.0氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液3 3、其他经验证过的溶液、其他经验证过的溶液10.1%蛋白胨水溶液；蛋白胨水溶液；20.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液1ml吐吐温温803动物组织消化液牛肉浸膏动物组织消化液牛肉浸膏吐温吐温8010.1蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液20.1蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液0.1（聚乙氧基乙醇、（聚乙氧基乙醇、0.1吐吐温温-80）3

10、十四烷酸异丙酯。十四烷酸异丙酯。 结果判断与复试结果判断与复试规定规定一次检出结果为准一次检出结果为准 ( (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试) ) 2015版药典无菌检查法的增、修订内容 1、方法应用范围增加“生物制品”。 2、实验环境的修订。 3、培养基体系的修订。 4、检查方法的整合修订。 5、参照USP 对表2、表3的整合修订。501

11、00200不作规定不作规定不作规定不作规定290003520000D级级25501002900035200002900352000C级级555102900352000293520B级级 1 1 1 120 3520203520A级级5指手指手套套cfu /手手套套接触碟接触碟/（f f55mm）cfu /5.0m0.5m5.0m0.5m表面微生物表面微生物沉降沉降菌（菌（f f90mm）cfu /4h(2)浮游浮游菌菌cfu/m3动态动态静态静态微生物监测的动态标准微生物监测的动态标准(1)悬浮粒子最大允许数悬浮粒子最大允许数/立方米立方米洁洁净净度度级级别别实验环境的重大修订 动态动态 20

12、10年版无菌检查 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行2015年版无菌检查在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。无菌检查环境修订 2010年版 1.硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 ； 20252.改良马丁培养基 23 28 培养。3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 营养肉汤培养基6. 营养琼脂培养基 7. 改良马丁琼脂培养基2015年版1. 硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 ； 2025培养2. 胰酪大豆胨肉汤培养基 20 25培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基5. 胰酪大豆胨琼脂培养基 6. 沙氏

13、葡萄糖肉汤培养基 7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基 培养基增修订内容硫乙醇酸盐流体培养基 厌氧菌检查（首选） 需气菌检查。胰酪大豆胨液体培养基 真菌和需气菌的检查。 适用范围培养基灵敏度检查实验菌株的修订 2010年版 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌改良马丁培养基 白色念珠菌、黑曲霉 2015年版硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、胰酪大豆胨液体培养基 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液制备用培养基2010年版1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流

14、体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基4、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上2015年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基 2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。2015版硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌

15、、生孢梭菌各2管胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。方法适用性试验的修订ICH Q6B， USP、EP、BP、JP无菌检查法中生物技术产品/及生物制品检定规程、标准没有对生物制品作出特殊的规定。整合中的焦点：培养温度 三部无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别置3035、 2025两个温度下培养。以致在取样量、检验量、接种方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。 修订原则： 以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲的要求进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点，在检验数量、检验量、阳性对照

16、、培养温度方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定。致力于逐步修订完善。 检验数量的整合检验数量的整合 2010 2010版版检验数量检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表厂产品按表1 1规定；上市产品监督检验按表规定；上市产品监督检验按表2 2、表、表3 3规定。表规定。表1 1、表、表2 2、表、表3 3中最少中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。 一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，

17、应增加1/21/2的最小检验数的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性对照用。对照用。 20152015版版检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表出厂产品按表1 1规定；上市产品监督检验按表规定；上市产品监督检验按表2 2规定规定表表1 1、表、表2 2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。检验量的整合检验量的整合 2010版版 20

18、15版版 检验量：检验量： 是指一次试验所用的供试品总量是指一次试验所用的供试品总量（g g或或mlml）。除另有规定外，每份培）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表养基接种的供试品量按表2 2、表、表3 3规定规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容，只要供试品特性允许，应

19、将所有容器内的全部内容物过滤。器内的全部内容物过滤。 检验量检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（基的最小量（g g或或mlml）。）。除另有规定外供试品检验按表除另有规定外供试品检验按表3 3规定。若每规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。，应将所有容器内的全部内

20、容物过滤。 检验量的整合检验量的整合 2010版版 检验量是指一次试验所用的供试品总量（检验量是指一次试验所用的供试品总量（g g或或mlml）。除另有规定外，每份培养基）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表接种的供试品量按表2 2、表、表3 3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接

21、种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。应将所有容器内的全部内容物过滤。 2015版版 检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g g或或mlml）。）。除另有规定外供试品检验按表除另有规定外供试品检验按表3 3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。采用薄膜

22、过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。 参照参照USP USP 对表对表1 1、表、表2 2、表、表3 3整合修订内容整合修订内容2010版表1. 批出厂产品最少检验数量 。表2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量。表3. 固体制剂最少检验及上市抽验样品的最少检验数量。2015版表1.批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量。注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。表2. 上市抽验样品的最少检验数量 （包括液体和固体制剂）。注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。 抗生素粉针剂（

23、5g) 及抗生素原料药的最少检验数量为6瓶（或支）。 筒装固体原料的最少检验数量为4个包装。根据具体情况定表3. 供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）。注 如果医疗器械体积过大，培养基用量可在2000 ml以上，将其完全浸没。 阳性对照试验 按原二部的规定： 供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。 阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小 于100CFU。 阳性对照管培养4872小时应生长良好。 阴性对照试验 阴性对照试验 按原二部的规定： 取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。薄膜过滤法 2010版 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过

24、滤器，也可使用一般薄膜过滤器水溶液供试品 ： 取规定量，直接过滤，或混合至适量含适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。 2015版 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。水溶液供试品 ：增加：一般样品冲洗后，1份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。 生物制品样品冲洗后，2份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。直接接种法2010版直接接种法取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培

25、养基中。 2015版增订：直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品等量接种于硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨肉汤培养基中除生物制品外，一般样品两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。 培养及观察整合 2010版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；外观上判断不能从有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天2015版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；增订：接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置3035培养，一份置2025培养。 修订：不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天。 结果判断整合按原二部的规定 2015版无菌检查法增、修订内容说明1.无菌检查法收载于中国药典三部通则中，一部和二部内容一致2.以2010年版二部的“无菌检查法”为基础进行整合和修订3. 保留了生物制品的特点。如检查数量、硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。4.在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。5.改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨液体培养基。6.方法验证试验修订为方法适用性试验。7.由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验