细胞培养基本技术_(2)

1、细胞培养基本技术细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位n1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella（小室）词。n1838年德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”的基本原则。n（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；n（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的“生命”。n（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。n进化论，遗传学和细胞学说定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是后二者的基石。细胞培养细胞培养 从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件

2、下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法 。细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。细胞培养的基本概念n 传代：传代：n 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。n 原代培养原代培养n 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 n细胞培养：使用单个细胞悬液n组织培养：使用组织块（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）n器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿n原代培养期n传代期n衰退期n有限细胞系，无限细胞系 n细胞系

3、 cell linen细胞株 cell strain 培养细胞的特性n 培养细胞的生长方式n贴附生长：n 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞n悬浮生长：n 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）n游离期：n 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n 10分钟一4小时n贴壁期：n 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等

4、糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）n潜伏期n 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。n对数生长期：n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。n停止期（平台期）：n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n 机制：接触抑制、密度依赖性细胞生长状况的观察细胞周期0Count 200 400 600 8001000DNA content研究细胞动力学、细胞的研究细胞动力学、细胞的DNA合成代谢和合成代谢和有丝分裂。每一个增值过程都要经过一

5、个周有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个周期来进行，包括：期来进行，包括：有丝分裂期（有丝分裂期（M期）期）分裂间期（生长期）：生长前期（分裂间期（生长期）：生长前期（G1)、DNA合成期（合成期（S）、生长后期（）、生长后期（G2）细胞周期的检测方法流式细胞仪测定法流式细胞仪测定法培养细胞生长的条件n1 细胞的营养需要n2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压n 3 无污染n 4 无毒 实验准备实验用品：实验用品：n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸nCO2培养箱n倒置显微镜n酶

6、标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪n耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管n压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广n电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 n滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 n超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台n n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台

7、内构成无菌环境。 滤 器高压灭菌锅n不同压力蒸汽所达温度不同压力蒸汽所达温度压力（磅）温度（度）5108.410115.215121.020126.025130.430134.5 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内留蒸馏水3000毫升于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。常用消毒方法及选择常用消毒方法及选择消毒物品压力蒸汽干热过滤紫外线化学气体化学消毒剂电力辐射抗生素培养室/工作台 玻璃制品 金属器械 塑料制品 橡胶制品 培养用液 棉

8、布类 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板 培养瓶n 常用玻璃器皿清洗n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干清洁液的配制2 细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 mln消化液：n 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使

9、细胞分离。 n 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。n天然培养基：天然培养基：n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。n优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限。n 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。n 易发生支原体污染 合成培养基n 合成培养基是根据细胞生存

10、所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。n 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低 n 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 n血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子； n激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n一般说来含5小牛血清的培养基

11、对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清n对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。n在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞n无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。n无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。n1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株

12、，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。n无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。n向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支

13、原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌n抗菌素的使用：n 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。n 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。n 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素 各100单位毫升培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10

14、） 无菌技术概念n【操作野消毒】n无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)， 紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。 然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同 时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。【洗手和着装】n原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工 作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并

15、于开始 操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗 手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】n在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶 口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。体外培养细胞的常见问题体外培养细胞的分型n（一）贴附型：n大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下 四型：成纤维细胞型：n胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核， 胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细 胞外，凡由中胚层间充质起源的

16、组织，如心肌、 平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可 称之为成纤维细胞。n名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的n来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：n真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，n血管内皮n形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则n三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，n中有卵圆形核n生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，n细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独n的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞2、上皮型细胞：n细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移

17、动，处于膜边缘 的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚 层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、 肺泡上皮等皆成上皮型形态。n名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同n来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：n皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤n形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核n生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状n生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动上皮型细胞3、游走细胞型：n呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以 和其他细胞相区别。小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞4、多型细胞

18、型n有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型n见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。n概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长n来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿瘤细胞n特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团n优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态n缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞传代方法n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。n 1. 悬浮生长细胞传代n 离心法传代：离心（1

19、000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。n 2 . 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。n 3. 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：n1 、吸光培养瓶中的培养液n2 、加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n3 、 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。n4 、用吸管吸取瓶内培养液，反复

20、吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n5、 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n6 、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n7、 将后者放入培养箱中培养。细胞传代培养消化法n培养细胞的取材n取材的基本要求：1.尽快培养2.严格无菌操作3.减少对细胞的机械损伤4.去除坏死组织，避免组织块干燥5.培养液营养丰富6.易培养的组织成功率高7.详细记录原代细胞的培养取材的基本器材和用品1.眼科组织弯剪、弯镊、手术刀2.小瓶装无血清培养基、Hanks液3.小烧杯4.培养皿各部位组织的取材n皮肤和黏膜n内脏和实体瘤n血细胞n骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞n鼠胚组织n鸡胚组织组织材料的分离n细

21、胞悬液的分离方法：血液、羊水、胸水、腹水等细胞悬液离心分离，5001000r/min，510minn组织块的分离方法1.机械分散法2.剪切分离法3.消化分离法机械分散法n纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。方法： 1.剪刀剪切，吸管反复吹打分散组织细胞。 2.组织放在注射器内通过针头压出。 3.注射器针芯挤压通过不锈钢筛网（50目、200目、400目）剪切分离法n组织块移植培养时，将组织剪成或切成小块（1cm3）用眼科剪反复剪切组织至糊状，吸取培养液反复吹打，低速离心去上清，再分离培养。消化分离法胰蛋白酶消化法n用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等，同时

22、也用于培养的细胞。npH 、温度、浓度、组织块大小和硬度。n0.10.5%，常用0.25%npH= 8n5mm3胚胎类软组织， 0.25%胰蛋白酶，37，20-30min即可。n钙、镁离子及血清对胰蛋白酶有抑制作用。n分次消化nEDTA较胰蛋白酶缓和，从组织环境中吸取钙、镁离子，破坏组织的完整性。n0.02%，用不含钙、镁离子的BSS配置。n不能被血清中和，用洗涤、离心方法去除。n胰蛋白酶与EDTA联合使用提高效果，1:1或1:2细胞计数n血细胞计数器：手工计数细胞nCoulter计数仪：人工计数细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在

23、盖片边缘，使悬液充满盖片和计 数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和 上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计 算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 n任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。n1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 n 克隆形

24、成率比克隆形成数接种细胞数n缺点：操作繁琐n优点：精确、可靠台盼蓝法n活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占n细胞中的百分比表示细胞活力 。四唑盐（MTT）比色法n四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝n 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值n MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 验、肿瘤放射敏感性实验等。n操作步骤n （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104

25、细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5nCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）n （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。n （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线其他染色方法n未固定凋亡细胞染色：AO/EB双染色法：n致密浓染黄绿色：早期凋亡细胞，n致密浓染鲜红色：晚期凋亡细胞，n鲜红色膨大状：坏死细胞n凋亡细胞固定后染色观察：nMGG染色法：玻片晾干后用MGG

26、染液染色20 min，光镜观察nHoechst3325染色法nHE染色法其他：nAnnexin V /PI双染法：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染nTUNEL染色：检测细胞凋亡nCFSE染色：检测细胞增殖AO/EB双染色原理：AO能够透过细胞膜，把细胞核内的DNA染成绿色，细胞浆内的RNA 呈桔红色。早期凋亡细胞的细胞膜尚完整，细胞浆发生固缩，细胞核固缩或碎裂，因此呈致密浓染的黄绿色，有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的细胞膜通透 性增加，EB能够通过，使其呈鲜红色固缩体或碎块。坏死细胞不仅细胞膜不完 整，

27、而且线粒体肿胀，为鲜红色的膨大细胞。方法：25 Ld离壁漂浮的细胞悬液与2 l AO染液(100 g/ml)和2 l EB染液(100 g/ml)混合后滴片，立即用荧光显微镜观察。n结果：大部分细胞主要呈致密浓染的黄绿色染色或黄绿色碎片(早期凋亡细胞)；部分细胞呈致密浓染的鲜红色染色或鲜红色碎片(晚期凋亡细胞)；少部分为鲜红色的膨大细胞。而在正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染，细胞浆桔黄或桔红色。坏死对照大部分为鲜红色的膨大细胞。MGG染色nMGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色，可兼两者的优 点，

28、常用于细胞涂片染色。n正常细胞呈细胞浆淡蓝色，细胞核粉红色着色。实验组的大部分细胞固缩变圆，整个细胞呈深蓝色。坏死对照为外形不规则的淡蓝色膨大细胞。TUNEL 技术nTUNEL 是末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介导的dUTP 原位切口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling TUNEL） 技术，是原位检测细胞凋亡情况的一种基本方法。细胞发生凋亡时，染色体DNA 会发生断裂，DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产

29、生的一系列DNA的3- OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和 荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末 端，从而可进行凋亡细胞的检测。细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小

30、冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序n标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器n简易程序：n 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法n1.预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO n2. 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)n3 .加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细