第三章_环境毒理学的基本研究方法

1、 研究方法研究方法 流行病学研究流行病学研究 受控的临床研究受控的临床研究 毒理学体内试验毒理学体内试验 毒理学体外试验毒理学体外试验优点优点 真实的暴露条件真实的暴露条件 规定的限定暴露条规定的限定暴露条 易于控制暴露条件易于控制暴露条件 影响因素少，影响因素少，易于控易于控 在各化学物之间发生相在各化学物之间发生相 在人群中测定反应在人群中测定反应 能测定多种效应能测定多种效应 制制 互作用互作用 对某组人群对某组人群( (如哮喘如哮喘) ) 能评价宿主特征的作用能评价宿主特征的作用 可进行某些深入可进行某些深入的研的研 测定在人群的作用测定在人群的作用 的研究是有力的的研究是有力的 (

2、(如：性别、年龄、遗如：性别、年龄、遗 究究( (如：机制，代谢如：机制，代谢) ) 表示全部的人敏感性表示全部的人敏感性 能测定效应的强度能测定效应的强度 传特征等和其他调控因传特征等和其他调控因 人力物力花费较人力物力花费较少少 素饮食等素饮食等) ) 能评价机制能评价机制缺点缺点 耗资、耗时多耗资、耗时多 耗资多耗资多 动物暴露与人暴露相关动物暴露与人暴露相关 不能全面反映不能全面反映毒作用毒作用 多为回顾性，无健康多为回顾性，无健康 较低浓度和较短时较低浓度和较短时 的不确定性的不确定性 不能作为毒性评价不能作为毒性评价和和 保护保护 间的暴露间的暴露 受控的饲养条件与人的受控的饲养条

3、件与人的 危险性评价的最后危险性评价的最后依依 难以确定暴露，有混杂难以确定暴露，有混杂 限于较少量的人群限于较少量的人群 实际情况不一致实际情况不一致 据据 暴露问题暴露问题 ( (一般一般50) 50) 暴露的浓度和时间的模暴露的浓度和时间的模 难以观察慢性毒作难以观察慢性毒作用用 可检测的危险性增加必可检测的危险性增加必 限于暂时、微小、限于暂时、微小、 式显著地不同于人群的式显著地不同于人群的 需达到需达到2 2倍以上倍以上 可逆的效应可逆的效应 暴露暴露 测定指标较粗测定指标较粗( (发病率，发病率， 一般不适于研究最一般不适于研究最 死亡率死亡率) ) 敏感的人群敏感的人群 1 1

4、 实验动物和人对外源化学物的反应敏感实验动物和人对外源化学物的反应敏感 性不同，有时甚至存在着质的差别性不同，有时甚至存在着质的差别2 2 高剂量向低剂量外推的不确定性高剂量向低剂量外推的不确定性3 3 小数量实验动物到大量人群外推的不确小数量实验动物到大量人群外推的不确 定性定性4 4 成年健康动物向年老体弱及患病个体外成年健康动物向年老体弱及患病个体外 推的不确定性推的不确定性实验动物的毒理学实验资料外推到实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时的不确定性人群接触的安全性时的不确定性1 1 化学物在实验动物产生的作用，可以外推化学物在实验动物产生的作用，可以外推 于人。基本假设于人

5、。基本假设 人是最敏感的动物物人是最敏感的动物物 种；种；人和实验动物的生物学过程与体重人和实验动物的生物学过程与体重 ( (或体表面积或体表面积) )相关。相关。2 2 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对 人潜在危害的必需的和可靠的方法。人潜在危害的必需的和可靠的方法。 3 3 成年的健康成年的健康( (雄性和雌性未孕雄性和雌性未孕) )实验动物和实验动物和 人可能的暴露途径是基本的选择。人可能的暴露途径是基本的选择。描述毒理学试验的基本原则描述毒理学试验的基本原则1 1 受试物毒作用的表现和性质受试物毒作用的表现和性质 2 2 剂量剂量反应反应( (效

6、应效应) )研究研究 3 3 确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官 4 4 确定损害的可逆性确定损害的可逆性 毒理学毒性评价试验的基本目的毒理学毒性评价试验的基本目的实验动物（实验动物（laboratory animallaboratory animal）指经人工培育，对其携带微生物指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。清楚，可用于科学研究的动物。实验动物的选择实验动物的选择实验动物的选择实验动物的选择物种选择物种选择 选择对外液化学物的毒性反应及代谢选择对外液化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种；特点与人类接近的

7、物种；选择自然寿命不太长的物种；选择自然寿命不太长的物种；选择易于饲养和实验操作的物种；选择易于饲养和实验操作的物种；选择经济并易于获得的物种。选择经济并易于获得的物种。 近交系动物近交系动物 连续连续2020代以上兄妹交配或亲子交配培育代以上兄妹交配或亲子交配培育突变系动物突变系动物 突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性杂交群动物杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配，所产两个不同近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物，生的第一代动物， 亦称杂交一代动物。亦称杂交一代动物。封闭群动物封闭群动物 5 5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系年

8、以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群的动物在固定场所保存繁殖的动物群 实验动物的选择实验动物的选择品系选择品系选择无菌动物无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫体内外均无任何微生物和寄生虫无特定病原体动物（无特定病原体动物（SPFSPF）体内无特定微生物和寄体内无特定微生物和寄生虫存在的动物生虫存在的动物( (无传染病无传染病) )。饲养于封闭的系统。饲养于封闭的系统。清洁动物清洁动物 与与SPFSPF的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、病理改变及自然

9、死亡。饲养在半屏蔽系统。病理改变及自然死亡。饲养在半屏蔽系统。微生物控制的选择微生物控制的选择实验动物的选择实验动物的选择个体选择个体选择 1 1 年龄年龄2 2 性别性别 3 3 生理状态生理状态 4 4 健康状况健康状况 实验动物的选择实验动物的选择 品品 系系周龄周龄 WistarWistar SD SD雌性雌性雄性雄性雌性雌性雄性雄性 3 35454565650505252 4 4919197978686101101 5 5134134134134130130150150 6 6166166187187172172206206 7 7209209233233210210262262 8

10、 8214214297297240240318318 9 92322323253252582583653651010246246370370272272399399大鼠体重与周龄的关系大鼠体重与周龄的关系 小鼠体重与周龄的关系小鼠体重与周龄的关系 品品 系系 周龄周龄 昆明昆明 BALB/cBALB/c C57BL/6 C57BL/6 615 615 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 0 01.951.95 2.10 2.10 1.40 1.40 1.46 1.46 1.40 1.40 1.44 1.44 1.58 1.58 1.58 1.58 1

11、 15.545.54 5.82 5.82 3.35 3.35 3.50 3.50 3.42 3.42 3.50 3.50 4.64 4.64 4.64 4.64 2 27.907.90 8.35 8.35 5.50 5.50 5.60 5.60 5.55 5.55 5.60 5.60 7.96 7.96 7.96 7.96 3 313.5513.55 14.80 14.80 7.32 7.32 7.40 7.40 6.40 6.40 6.90 6.90 9.83 9.83 9.83 9.83 4 421.3521.35 22.60 22.6011.6011.6012.4512.4512.201

12、2.2012.5712.5715.7515.7519.0019.00 5 527.9027.90 33.25 33.2514.7514.7516.1016.1016.9016.9018.1018.1020.7520.7522.5822.58 6 632.8032.80 39.25 39.2515.6015.6017.4017.4018.4018.4020.5020.5021.8821.8825.9625.96 7 734.7034.70 39.90 39.9016.1016.1018.6518.6519.0019.0021.6021.6023.1223.1227.9627.96 8 834.8

13、034.80 40.05 40.0518.1618.1620.2520.2520.2520.2522.4022.4024.1624.1628.8328.831 1 未处理对照组未处理对照组( (空白对照组空白对照组) )：本底值，：本底值， 质量控制质量控制2 2 阴性阴性( (溶剂赋形剂溶剂赋形剂) )对照：与染毒组比对照：与染毒组比 较的基础较的基础 3 3 阳性对照：检测试验体系的有效性阳性对照：检测试验体系的有效性4 4 历史性对照：检查试验体系的稳定性，历史性对照：检查试验体系的稳定性， 即进行实验室质量控制和保证即进行实验室质量控制和保证 毒理学试验常用对照毒理学试验常用对照 对各

14、个毒理学试验应该用同一种、同一批号受对各个毒理学试验应该用同一种、同一批号受 试物试物 受试物成分和配方必须固定受试物成分和配方必须固定 如是异构体混合物，异构体比例必须固定如是异构体混合物，异构体比例必须固定 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也 应固定应固定 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性 必须进行研究并报告必须进行研究并报告 受试物应一次备齐全部实验的用量受试物应一次备齐全部实验的用量受试样品受试样品毒理学试验设计的统计学要求毒理学试验设计的统计学要求 随机、重复、对照原则随机、重复、对照原则

15、对常规毒理学试验资料的统计学方法对常规毒理学试验资料的统计学方法 计量资料：计量资料：一般用一般用t t检验或检验或ANOVAANOVA 记数资料：记数资料：卡方检验卡方检验毒理学试验的统计学毒理学试验的统计学1 1 处理组与对照组比较差别有无显著性处理组与对照组比较差别有无显著性 2 2 有无剂量有无剂量- -反应关系反应关系3 3 是否伴有其他相关参数的改变是否伴有其他相关参数的改变4 4 是否在是否在 “ “正常正常”值范围值范围 实验结果的判断实验结果的判断LD501lglg1090nLDLDi1lglg0100nLDLDi同理可得LC5、 LC10、24SSmppp第二节第二节 亚慢

16、性和慢性毒性试验亚慢性和慢性毒性试验一、蓄积试验及其方法：一、蓄积试验及其方法：（一）蓄积作用：（一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种： 物质蓄积物质蓄积：毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积； 功能蓄积功能蓄积：毒物进入机体后，并未发现在体内明显贮留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的反应性增强。)1(50)(50EDEDKn)1(50)(50LDLDKn 1固定剂量法固

17、定剂量法 ：固定每天染毒剂量为1/201/5 LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD50 动物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。 2递增剂量法递增剂量法 ：先测定LD50（1），然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达28天，可结束实验，计算系数。 3. 二十天试验法二十天试验法 ：选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20 LD50分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50组动物有死亡，且有剂量反应关系，则有较强

18、蓄积作用；如1/20 LD50组无死亡，则为弱蓄积。4、剂量选择与分组、剂量选择与分组 剂量：剂量：180I50LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少剂量。 设34个实验组和1个对照组。 实验组要求：实验组要求：在实验结束时 最低剂量组最低剂量组不产生可观察到的毒性反应； 最高剂量组最高剂量组能引起明显毒性反应，但不引起死亡； 中间剂量组中间剂量组产生轻微毒性反应。三、慢性毒性作用及其试验方法三、慢性毒性作用及其试验方法1、目的：、目的：评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点确定阈剂量和最大无作用剂量。2、试验方法：、试验方法：（1）

19、 动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验相似；（2）染毒期限：1-2年或终身染毒，也有人提出6月。（3）剂量分组： 3个染毒组和一个对照组。 高剂量组：1/51/2亚慢性试验阈值； 中间剂量：1/501/10； 低剂量组：1/100。营养缺陷）突变型微生物（组氨酸回复突变正向突变野生型沙氏菌环境流行病学除了上述一般内容，还有它本身的特点。 (1)它不仅研究疾病的分布规律，而且更经常地研究疾病前的状态，即包括无异常健康)、微弱的功能改变、疾病的前期(亚临床状态)等各种健康状况，揭示环境污染或某些微量元素的健康效应。 (2)环境流行病学研究的暴露因素主要是理化因素。已知暴露因素，研究其对健康的影响；环境毒理学工作者所进行的大量工作就属于这种。例如金属冶炼厂铅污染大气对居民健康影响，磷肥厂氟污染大气对居民健康影响的调查等。出现健康异常，追究引起异常的暴露因素，这属于探讨病因的研究。例如，近年来我国学者对于鼻咽癌、食道癌病因的研究，对克山病、大骨节病病因的研究，均属于此种类型。日本的水误病和痛痛病的病因是重金属污染