第8章 电泳法

1、电泳技术电泳技术 n带电颗粒带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电在电场作用下向着与其电性相反的电极极移动移动，称为，称为电泳电泳( (electrophoresiselectrophoresis，EPEP) )。利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫方法和技术叫电泳法电泳法或或电泳技术电泳技术。正极正极负极负极带负电粒子带负电粒子带正电粒子带正电粒子 电泳技术概述电泳技术概述n1937年瑞典科学家年瑞典科学家Tiselius建立了建立了“移界电泳法移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成成

2、功地将血清蛋白质分成清蛋白、清蛋白、1-、2-、-和和-球蛋白球蛋白5个主要成分。他个主要成分。他于于1948年荣获年荣获诺贝尔奖诺贝尔奖。n2020世纪世纪5050年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。作为支持物。n6060年代，年代，DavisDavis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了支持物，在此基础上发展了SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电

3、聚焦电泳、双向电泳等电聚焦电泳、双向电泳和和印迹转移电泳印迹转移电泳等技术。这等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。n目前，电泳技术已成为目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学以及与以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中业分析中必不可少的手段必不可少的手段。电泳的分类电泳的分类Tise-leas式微量电泳式微量电泳显微电泳显微电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳等速电泳等速电泳密度梯度电泳密度梯度电泳电泳 自由电泳自由电泳（无支持体）（无支持体） 区

4、带电泳区带电泳（有支持体）（有支持体）滤纸电泳滤纸电泳（常压及高压）薄层电泳薄层电泳（薄膜及薄板）凝胶电泳凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）n自由界面电泳自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在又称移动界面电泳，是指在没没有有支持介质的溶液支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。n区带电泳区带电泳：是指有是指有支持介质支持介质的电泳，待分离物的电泳，待分离物质在支持介质上分离成质在支持介质上分离成若干区带若干区带。支持介质的。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以作用主要是

5、防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。又可分为不同的类型。缺点缺点：存在对流。：存在对流。成分相互重叠。成分相互重叠。定义定义: 在一根在一根U型管里的型管里的溶液溶液中，各物质据中，各物质据泳动速率泳动速率的不同，达到分离。的不同，达到分离。移界电泳移界电泳定义定义:在电泳过程中，应用各种不同的在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质惰性支持介质(醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等)使

6、具有使具有不同泳动速率不同泳动速率的各组分形成的各组分形成各自各自的区带。的区带。区带电泳区带电泳AB+B A B AABB AABCC B A移界移界区带区带A B C等速等速等电聚焦等电聚焦pH9 8 7 6混合混合分立分立稳态稳态时毗邻时毗邻稳态稳态时分立静时分立静止止 不同型号的不同型号的毛细管电泳仪毛细管电泳仪及其工作原理及其工作原理 毛细管电泳毛细管电泳1981年，年，Jorgenson和和Luckas，用用75m内径石英毛细管进行电泳内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达分析，柱效高达40万万/m，促进，促进电泳技术发生了根本变革，迅速电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与发展成

7、为可与GC、HPLC相媲美相媲美的崭新的分离分析技术的崭新的分离分析技术高效高效毛细管电泳毛细管电泳。电泳仪电泳仪DYY-11DYY-12C电泳槽电泳槽迷你双垂直电泳槽迷你双垂直电泳槽水平电泳槽水平电泳槽等电聚焦多用电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽卧式电泳槽紫外透射仪紫外透射仪手提式手提式暗箱式暗箱式第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理一、泳动度一、泳动度n带电颗粒带电颗粒在单位电场中在单位电场中泳动的速度泳动的速度称称迁移率迁移率或或泳动度泳动度( (mobility)mobility)，可用下式表示：可用下式表示： d/t dl d/t dl U = = = U = = = E V

8、/l vt E V/l vtn式中式中U(U(也可以用也可以用m m表示表示) )：泳动度：泳动度 cmcm2 2(V(Vs)s)；：颗粒泳动速颗粒泳动速度度( (cmcms)s)；E E：电场强度电场强度( (V Vcm)cm)；l l：支持物的有效长度支持物的有效长度( (cm)cm)；V V：实际电压实际电压( (V)V)；d d：颗粒泳动的距离颗粒泳动的距离；t t：通电时间通电时间( (s s或或min)min)。电泳后通过测量电泳后通过测量v v、t t、d d、l l，即可计算出被分离物质的泳动度。即可计算出被分离物质的泳动度。泳动度泳动度与带电颗粒所带与带电颗粒所带净电荷的数量

9、净电荷的数量、颗粒大小颗粒大小和和形状形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中子在电场中所受的力所受的力( (F)F)为：为： F = E QF = E Qn式中式中 E E：电场强度电场强度，即每厘米支持物的电位降；，即每厘米支持物的电位降；Q Q为被分离物所带为被分离物所带净电荷净电荷。一、泳动度一、泳动度二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素 n1 1电场强度电场强度 是指每厘米的电位降，也称是指每厘米的电位降，也称电位梯度电位梯度( (电电势梯度势梯度)

10、)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电。根据电场强度的不同，电泳可分为两种。场强度的不同，电泳可分为两种。n(1)(1)常压常压(100(100500 500 V)V)电泳电泳 其电场强度为其电场强度为2 210 10 V Vcmcm。分离分离时间较长时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质等等大分子大分子物质。物质。n(2)(2)高压高压(2000(200010000 10000 V)V)电泳电泳 其电场强度为其电场强度为5050200200V Vcmcm，电泳电泳时间很短时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨

11、基酸、，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等多肽、核苷酸、糖类等小分子小分子物质。物质。 二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素n2 2溶液溶液pH pH 为使电泳时为使电泳时pHpH值恒定，必须采用缓冲液作值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的为电极液，溶液的pHpH值决定带电颗粒的解离程度，亦即值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少决定其所带电荷的多少。n对蛋白质而言，溶液对蛋白质而言，溶液pHpH值离等电点值离等电点( (pI)pI)越远，则颗粒所越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。；反之，则越慢。n

12、因此分离某种蛋白质混合液时，应选择一个合适因此分离某种蛋白质混合液时，应选择一个合适pH,pH,使欲使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。 二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素n3 3溶液的离子强度溶液的离子强度 缓冲液缓冲液离子强度越高，则颗粒的离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在。一般最适合的离子强度在O.02O.02O.2O.2之间。溶液离子强度之间。溶液离子强度( (ionic strength)ionic strength)的计算的计算公式如下：公式如下： I= 1

13、/2 I= 1/2 CZCZ2 2n式中式中 I I离子强度；离子强度；c c：离子的摩尔浓度离子的摩尔浓度( (molmolL)L)；z z：离子价数，价离子价数，价数越高，则离子强度越大。数越高，则离子强度越大。 如：求如：求O.15 mo/L NaO.15 mo/L Na2 2SOSO4 4离子的强度。离子的强度。n I=1/2I=1/2（0.150.152 21 12 2+0.15+0.152 22 2）=0.045 =0.045 二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素n4 4电渗电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸

14、附如纸电泳时，滤纸吸附OHOH- -带负电荷，与纸接触的缓冲液带带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。泳时，电渗小些为好。二、影响泳动度的因素二、影响泳动度的因素n5 5温度温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活。会使样品中的生物大分子变性失活。n因此电泳时，要控制因此电泳时，要控制电压或电流电压或电流，也可安装冷却，也可安装冷却散热装置。散

15、热装置。n6 6支持物支持物 要求是要求是均匀均匀，吸附力吸附力和和电渗小电渗小，机机械性能好械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好，便于染色或紫外光下检测，故最好透透明明，无紫外吸收无紫外吸收。n常用的支持物常用的支持物? ? 介质介质 原理原理 特点特点纸电泳纸电泳Paper electrophoresis 纸（纤维素）纸（纤维素） 质荷比质荷比分辨率低分辨率低醋酸纤维素薄醋酸纤维素薄膜电泳膜电泳醋酸纤维素醋酸纤维素质荷比质荷比在纸电泳基础上的改进在纸电泳基础上的改进PAGE电泳电泳聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶质荷比质荷比+分子筛分子筛凝胶不仅作为支持物，凝胶不仅作为支持物，且以分子筛主

16、动参与样且以分子筛主动参与样品的分离。品的分离。SDS-PAGE聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶分子筛分子筛用于测定蛋白质亚基的用于测定蛋白质亚基的分子量分子量琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳泳 琼脂糖琼脂糖分子筛分子筛因孔径大，用于核酸的因孔径大，用于核酸的研究研究第二节第二节 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳n醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙纤维素的羟基经乙酰化酰化而成。而成。n醋酸纤维素薄膜与滤纸相比醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下较，有以下优点优点。n分离效果好分离效果好。n快速省时快速省时。n灵敏度高，样品用量少灵敏度高，样品用量少。n应用面广应用

17、面广。n易保存，易定量易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳操作操作n1、配制缓冲液；、配制缓冲液；n2、薄膜的处理：裁剪浸泡、薄膜的处理：裁剪浸泡(注意防酶污染注意防酶污染)n3、点样、点样n4、安装装置、安装装置n5、电泳：电场强度为、电泳：电场强度为1025V/cm,0.52h.n6、显色、显色:染色、漂洗、检测染色、漂洗、检测醋酸纤维素薄膜电泳装置醋酸纤维素薄膜电泳装置醋酸纤维素薄膜电泳的应用：醋酸纤维素薄膜电泳的应用：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳其优点是简便迅速，便于保存照相，比

18、纸电泳分辨率高。分辨率高。 特点：由于介质的孔径度大，没有分子筛效特点：由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。第三节第三节 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 n 一、琼脂糖凝胶的特点一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂天然琼脂( (agar)agar)是一种是一种多聚糖，主要由琼脂糖多聚糖，主要由琼脂糖( (agaroseagarose，约占约占8080) )及琼及琼脂胶脂胶( (agaropectin)agaropectin)组成。组成。琼脂糖是由半乳糖及其琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷衍生物构成的中性物质，不带

19、电荷。n目前多用琼脂糖凝胶为电泳支持物进行平板电泳。目前多用琼脂糖凝胶为电泳支持物进行平板电泳。n应用应用: :分离蛋白质和同工酶、分离蛋白质和同工酶、鉴定核酸、鉴定核酸、DNADNA限制限制性内切核酸酶图谱制作等。性内切核酸酶图谱制作等。二、二、DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳琼脂凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的琼脂凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相相对分子质量对分子质量及及分子构型分子构型，同时与凝胶的，同时与凝胶的浓度浓度也有密也有密切关系。切关系。n1 1核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系n(1)(1)DNADNA分子的大小分子的大小

20、在凝胶中，在凝胶中，DNADNA片段迁移片段迁移距离距离( (迁移率迁移率) )与与碱基对碱基对的的对数成反比对数成反比，因此通过已知大，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。比较，便可测出未知片段的大小。二、二、DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳n(2)(2)琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 不同大小的不同大小的DNADNA需要用不同浓度的琼需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。脂糖凝胶进行电泳分离。二、二、DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳n 2 2核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

21、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系n不同构型不同构型DNADNA的移动速度次序为：的移动速度次序为：共价闭共价闭环环DNADNA直线直线DNADNA开环的双链环状开环的双链环状DNADNA。二、二、DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3 3电泳方法电泳方法 n(1)(1)凝胶类型凝胶类型 用于分离琼脂糖凝胶电泳可分为用于分离琼脂糖凝胶电泳可分为垂垂直型直型及及水平型水平型( (平板型平板型) )。3 3电泳方法电泳方法n(2)(2)缓冲液系统缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，缺少离子时，电流太小，DNADNA迁迁移慢；相反，高离子型强度的缓冲液由于电流太移慢；相反，高离子型强度的缓冲液

22、由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNADNA的变的变性。性。n常用的电泳缓冲液有常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)EDTA(pH8.0)和和Tris-Tris-乙酸乙酸( (TAETAE) )，Tris-Tris-硼酸硼酸( (TBETBE) )或或Tris-Tris-磷酸磷酸( (TPETPE) )等，等，浓度约为浓度约为50 50 mmolmmolL(pH7.5L(pH7.57.8)7.8)。3 3电泳方法电泳方法n(3)(3)凝胶的制备凝胶的制备 以以稀释的电极缓冲液稀释的电极缓冲液为溶剂，用为溶剂，用沸水浴或微波炉沸水浴或微波炉配

23、制一定浓度的配制一定浓度的溶胶溶胶，灌入灌入水平水平胶框胶框或垂直胶膜，或垂直胶膜，插入梳子插入梳子，自然冷却自然冷却。n(4)(4)样品配制与加样样品配制与加样 DNADNA样品用适量样品用适量Tris-EDTATris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有缓冲液溶解，缓冲液内含有O.25O.25溴酚蓝溴酚蓝或其他或其他指示染料，含有指示染料，含有10101515蔗糖蔗糖或或5 51010甘甘油油，以增加其，以增加其比重比重，使样品集中。，使样品集中。上样缓冲液上样缓冲液nDNADNA加样过程中须以一定的比例加入上样液加样过程中须以一定的比例加入上样液( (通常加入样品通常加入样品体积体积的的1

24、 16 6或或1 11010) )，上样液中各组分的作用分别如下。，上样液中各组分的作用分别如下。n(1) 10 (1) 10 mmolmmolL L左右的左右的EDTAEDTA，作用是作用是螯合螯合MgMg2+2+，防止电泳防止电泳过程中过程中DNADNA被降解。被降解。n(2) 300 (2) 300 g gL L的的聚蔗糖聚蔗糖，或，或400400500 500 g gL L的的蔗糖、甘油蔗糖、甘油，目的在于使目的在于使样品的密度增大样品的密度增大，防止样品在加样孔中，防止样品在加样孔中扩散扩散；聚蔗糖还可减少聚蔗糖还可减少DNADNA条带的弯曲与拖尾现象，这一点在大条带的弯曲与拖尾现象

25、，这一点在大片段电泳或制备性电泳大量加样时尤为重要。片段电泳或制备性电泳大量加样时尤为重要。上样缓冲液上样缓冲液n(3) (3) 迁移指示剂迁移指示剂，即带，即带有负电荷的小分子有色有负电荷的小分子有色物质，用于监测电泳的物质，用于监测电泳的行进过程，可选用的有行进过程，可选用的有溴酚蓝与二甲苯青溴酚蓝与二甲苯青FFFF。3 3电泳方法电泳方法n (5)(5)电泳电泳 n在在低浓度低浓度、低电压低电压下，下，分离分离效果效果较好较好。n在在低电压低电压条件下，线性条件下，线性DNADNA分子的电泳分子的电泳迁移率迁移率与所用的与所用的电电压呈正比压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的。但是，

26、在电场强度增加时，较大的DNADNA片段迁片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离率反而下降，为了获得电泳分离DNADNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度电场强度不宜高于不宜高于5 5 V Vcmcm。3 3电泳方法电泳方法(6)(6)染色和拍照染色和拍照 常用荧光染料常用荧光染料溴乙锭溴乙锭( (EB)EB)染染色，在色，在紫外光下观察紫外光下观察DNADNA条带条带，用紫外分析，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。进行有关的

27、数据分析。第四节第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 n 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。胶作为支持介质的一种电泳方法。一、一、聚丙烯酰胺凝胶的特点聚丙烯酰胺凝胶的特点n聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺( (AcrAcr) )和和交联剂交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( (BisBis) )在在加加速剂速剂和和催化剂催化剂的作用下聚合，并联结成的作用下聚合，并联结成三三维网状结构维网状结构的凝

28、胶，以此凝胶为支持物的的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶的优点优点n在一定浓度时，在一定浓度时，凝胶透明

29、凝胶透明，有弹性，有弹性，机械性能机械性能好。好。n化学化学性能稳定性能稳定，与被分离物不发生化学反应。，与被分离物不发生化学反应。n对对pHpH和温度变化较和温度变化较稳定稳定。n几乎几乎无电渗无电渗作用。作用。n样品样品不易扩散不易扩散，其，其灵敏度灵敏度可达可达1010-6-6g g。n凝胶凝胶孔径孔径可通过选择单体及交联剂的浓度可通过选择单体及交联剂的浓度调节调节。n分辨率高分辨率高。nPAGEPAGE应用范围广应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性分离、定性、定量定量及少量的及少量的制备制备，还可测定，还可测定相对分子质量相对分子

30、质量、等电点等电点等。等。 二、凝胶聚合的原理及有关特性二、凝胶聚合的原理及有关特性 n 1 1聚合反应聚合反应 n凝胶的聚合常用凝胶的聚合常用过硫酸铵过硫酸铵( (APAP) )为为催化剂催化剂，四甲基乙二胺四甲基乙二胺( (TEMEDTEMED) )为为加速剂加速剂。nTEMEDTEMED的碱基可催化的碱基可催化APAP水溶液产生游离氧原子，激活水溶液产生游离氧原子，激活AcrAcr单体，使其聚合成单体长链，在单体，使其聚合成单体长链，在BisBis作用下，聚合成网作用下，聚合成网状凝胶。状凝胶。n碱性条件碱性条件下凝胶下凝胶易聚合易聚合，室温下，室温下7.57.5的凝胶在的凝胶在pH8.

31、8pH8.8时时30 30 minmin聚合，在聚合，在pH4.3pH4.3时约需时约需90 90 minmin。2. 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（T T）和和AcrAcr与与BisBis两者之比。凝胶总两者之比。凝胶总浓度（浓度（T T）和交联度（和交联度（C C）的计算公式分别为：的计算公式分别为：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T =凝胶孔径大小，主要受凝

32、胶浓度的影响。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，凝胶浓度越大，孔径越小孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交当凝胶浓度确定后，交联度为联度为5%5%时，凝胶具有最小孔径，时，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶时凝胶孔径都要增大。孔径都要增大。 在浓度为在浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5

33、%7.5% 凝胶称为标准胶凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%2.4%的大孔凝胶，的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%0.5%琼脂糖，琼脂糖，或在或在3%3%凝胶中加入凝胶中加入20%20%蔗糖以增加机械强度而蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。又不影响凝胶孔径大小。3 3. .凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系

34、凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系三、三、PAGEPAGE凝胶电泳凝胶电泳操作操作n1、配制缓冲液；、配制缓冲液；n2、配制凝胶、配制凝胶n3、加样、加样n4、安装装置、安装装置n5、电泳：电场强度为、电泳：电场强度为1025V/cm, 0.52h.n6、显色、显色:染色、漂洗、检测染色、漂洗、检测PAGEPAGE电泳操作电泳操作 nPAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为根据其有无浓缩效应，分为连续连续系统与系统与不连续不连续系系统两大类：统两大类：n连续电泳体系只有一层凝胶，缓冲液连续电泳体系只有一层凝胶，缓冲液pHpH值值及凝及凝胶浓度胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠相同，带电

35、颗粒在电场作用下，主要靠电荷电荷及及分子筛分子筛效应；效应；n不连续电泳体系采用二层或三层性质不同的凝胶，由不连续电泳体系采用二层或三层性质不同的凝胶，由于缓冲液于缓冲液离子成分离子成分、pHpH、凝凝胶浓度胶浓度及及电位梯度电位梯度的的不连不连续性续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷电荷效应、效应、分子分子筛筛效应，还具有效应，还具有浓缩浓缩效应，故分离效应，故分离效果更好效果更好。n不连续体系由电极缓冲不连续体系由电极缓冲液、液、样品胶样品胶、浓缩胶浓缩胶及及分分离胶离胶组成，两层玻璃板中组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层样品排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩

36、胶、下层分胶、中间浓缩胶、下层分离胶。离胶。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶垂直管型盘状电泳垂直管型盘状电泳夹心垂直电泳示意图夹心垂直电泳示意图凝胶膜示意图凝胶膜示意图聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳垂直板型电泳四、不连续凝胶电泳的特点四、不连续凝胶电泳的特点n在不连续的系统里，存在三种物理效在不连续的系统里，存在三种物理效应，即应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应筛效应和电荷效应，由于这三种物理，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。效应，使样品分离效果好，分辨率高。 1 1样品浓缩效应样品浓缩效应n(1)(1)凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的

37、不连续性 样品胶样品胶及及浓缩胶为大浓缩胶为大孔胶孔胶；分离胶为小孔胶分离胶为小孔胶。n在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。大，移动速度减慢。n因而在两层凝胶因而在两层凝胶交界处交界处，样品迁移受阻而压缩成，样品迁移受阻而压缩成很窄很窄的的区带区带。 1 1样品浓缩效应样品浓缩效应n(2)(2)缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 在三层凝胶中均在三层凝胶中均有有三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷( (简称简称Tri

38、s)Tris)及及HClHCl。TrisTris的作用是维持溶的作用是维持溶液的液的电中性电中性及及pHpH值值，是，是缓冲配对离子缓冲配对离子。HClHCl在任何在任何pHpH溶液中均溶液中均易解离出易解离出ClCl- -，在电场中在电场中迁移率快迁移率快，走在最前面称为，走在最前面称为快离子快离子。 n在电极缓冲液中，还有在电极缓冲液中，还有甘氨酸甘氨酸, ,其其pI=6.OpI=6.O，在在pH8.3pH8.3的电极缓的电极缓冲液中，易解离出冲液中，易解离出甘氨酸根甘氨酸根( (NHNH2 2CHCH2 2COOCOO- -) )，而在而在pH6.7pH6.7的凝胶的凝胶缓冲体系中，缓冲

39、体系中， GlyGly解离度仅有解离度仅有O.1O.11 1，因而在电场中迁因而在电场中迁移很慢，称为移很慢，称为慢离子慢离子。Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%n血清血清中大多数蛋白质中大多数蛋白质pIpI在在5.5.O O左右，在左右，在pH6.7pH6.7或或8.38.3时均时均带带负电荷负电荷向正极移动，迁移率介于向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之快离子与慢离子之间间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓浓缩缩成为极成为极窄窄的的

40、区带区带。n当进入当进入pH8.9pH8.9的分离胶时，的分离胶时， GlyGly解离度增加解离度增加，其有效迁，其有效迁移率超过蛋白质；因此移率超过蛋白质；因此ClCl- -及及NH2CH2COONH2CH2COO- -沿着离子界面沿着离子界面继续前进。继续前进。n蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带分成多个区带。n(3)(3)电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 电泳开始后，电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的子强度很低的低电导区低电导区，使局部电位梯，使局部电位梯度

41、增高，将蛋白质度增高，将蛋白质浓缩浓缩成成狭窄狭窄的的区带区带。 2 2分子筛效应分子筛效应 n大小大小和和形状形状不同的蛋白质通过不同的蛋白质通过一定孔径一定孔径分离胶时，分离胶时，受阻受阻滞滞的程度的程度不同不同而表现出而表现出不同的迁移率不同的迁移率，这就是，这就是分子筛分子筛效效应。应。n蛋自质进入蛋自质进入pH8.9pH8.9的同一孔径的分离胶后，的同一孔径的分离胶后，分子小分子小且为且为球球状状的蛋白质分子所受的蛋白质分子所受阻力小阻力小，移动快移动快，走在前面；反之，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作

42、用将各种蛋白质分成各自的区带。作用将各种蛋白质分成各自的区带。n这种分子筛效应这种分子筛效应不同于柱层析不同于柱层析中的中的分子筛效应分子筛效应，后者是，后者是大分子先大分子先从凝胶颗粒间的缝隙从凝胶颗粒间的缝隙流出流出，小分子后流出小分子后流出。 3 3电荷效应电荷效应 n在在pH8.9pH8.9的的分离胶分离胶中，各种带中，各种带净电荷不同净电荷不同的蛋白的蛋白质有不同的质有不同的迁移率迁移率。净电荷多，则迁移快；反。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。之，则慢。n因此，各种蛋白质按因此，各种蛋白质按电荷多少电荷多少、相对分子质量相对分子质量及及形状形状，以一定，以一定顺序排成顺序排成一个个区

43、带，因而称一个个区带，因而称为为区带电泳区带电泳。 四、四、SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳nSDSSDS即即十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠( (Sodium Dodecyl SulfateSodium Dodecyl Sulfate，简称简称SDSSDS) )是是阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种结合，形成一种SDSSDS一蛋白质一蛋白质复合物。复合物。n此复合物可用具有此复合物可用具有SDSSDS的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶( (包括包括连续连续的和的和不连续不连续的系统的系统) )电泳进行分离，通常把这种电泳称为电

44、泳进行分离，通常把这种电泳称为SDSSDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳一聚丙烯酰胺凝胶电泳( (简称简称SDS-PAGESDS-PAGE) )。它的主要用途它的主要用途是是分离蛋白质和测定其分子量。分离蛋白质和测定其分子量。1.SDS-PAGE1.SDS-PAGE原理原理 n聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据，是样品中各种物质的主要依据，是样品中各种物质的电荷和分子量电荷和分子量的差异性。的差异性。n而而SDSSDSPAGEPAGE的主要依据的主要依据，则是各种物质，则是各种物质分子量的差异分子量的差异性。性。n因为当因为当SD

45、SSDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量大量的的负电负电荷荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子问的问的电荷差别电荷差别就就降低降低乃至乃至消除消除了。了。n与此同时蛋白质在与此同时蛋白质在SDSSDS作用下结构变得松散，作用下结构变得松散，形状形状趋向趋向一致一致，所以各种所以各种SDSSDS一蛋白质复合物一蛋白质复合物在电泳时产生的在电泳时产生的泳动率差异泳动率差异，就反映了就反映了分子量的差异分子量的差异。 1.SDS-PAGE1.SDS-PAGE原理原理n当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在

46、17,000165,000之间时之间时，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。一般用下式表示：关系。一般用下式表示： lgMr=lgK-bm=K1-bm n式中，式中，Mr代表蛋白质分子量，代表蛋白质分子量，K、K1代表常数，代表常数，b代表斜率，代表斜率，m代表迁移率。代表迁移率。将已知分子量的标准将已知分子量的标准蛋白质在蛋白质在SDS -聚丙聚丙烯酰胺凝胶中的电泳烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对迁移率对分子量的对数作图，即可得到一数作图，即可得到一条标准曲线。条标准曲线。只要测得未知分子量的只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的蛋

47、白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。标准曲线求得其分子量。红细胞膜蛋白红细胞膜蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分部聚丙烯酰胺凝胶电泳分部SDS一蛋白质复合物一蛋白质复合物在强在强还原剂还原剂(如巯基乙如巯基乙醇醇)存在下，蛋白质分存在下，蛋白质分子内子内二硫键二硫键被打开，被打开，而不被氧化，这样分而不被氧化，这样分离出的谱带即为离出的谱带即为蛋白蛋白质亚基质亚基五、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳五、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳n用连续用连续SDS-PAGE测定蛋白质分子量，由于测定蛋白质分子量，由于SDS及巯基乙及巯基乙醇的作用，醇的作用，天然蛋白质解离为亚基或肽

48、链天然蛋白质解离为亚基或肽链，因此测得的分子，因此测得的分子量不是天然蛋白质的分子量，要确定其真正的分子量还需配量不是天然蛋白质的分子量，要确定其真正的分子量还需配合其他方法验证。合其他方法验证。n为弥补这一缺陷，为弥补这一缺陷，1968年以来，年以来，Margolis和和Slater等人以等人以聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺(polyacrylamid简称简称PAA)为支持物，制备成为支持物，制备成孔孔径梯度径梯度(pore gradient简称简称PG)或称为梯度凝胶或称为梯度凝胶，进行进行PAGE(简称简称PG-PAGE)分离和鉴定各种蛋白质组分，并首分离和鉴定各种蛋白质组分，并首次用来测定蛋白质

49、分子量。次用来测定蛋白质分子量。1、PG-PAGE操作操作n线性梯度凝胶制备，不同于均一浓度凝胶制备，应预先配线性梯度凝胶制备，不同于均一浓度凝胶制备，应预先配制低浓度胶制低浓度胶(2或或4)贮液置贮液瓶中；高浓度胶贮液置贮液瓶中；高浓度胶(16或或30)贮液置混合瓶中贮液置混合瓶中(两者体积比为两者体积比为11)，在梯度混，在梯度混合器及蠕动泵的协助下，从下至上灌胶，凝胶聚合后，合器及蠕动泵的协助下，从下至上灌胶，凝胶聚合后，则形成从下到上，则形成从下到上，从从浓至稀浓至稀依次依次排列的排列的线性线性梯度凝胶梯度凝胶n自上而下，自上而下，孔径逐渐变小孔径逐渐变小，形成，形成梯度梯度。n在在p

50、H大于蛋白质大于蛋白质pI的缓冲体系中电泳时，蛋的缓冲体系中电泳时，蛋白质样品从白质样品从负极向正极负极向正极移动，也就是说从上向移动，也就是说从上向下，向着凝胶浓度增加下，向着凝胶浓度增加(孔径逐渐减小孔径逐渐减小)的方向的方向移动，随着电泳的继续进行，蛋白质颗粒的迁移动，随着电泳的继续进行，蛋白质颗粒的迁移由于孔径渐小，移由于孔径渐小，阻力愈来愈大阻力愈来愈大。 n蛋白质在凝胶中的蛋白质在凝胶中的迁移速度迁移速度主要受主要受2个个因素影响因素影响；n一是蛋白质本身的一是蛋白质本身的电荷密度电荷密度，电荷密度，电荷密度愈高愈高，迁移率愈，迁移率愈快快；n二是蛋白质本身的二是蛋白质本身的大小大

51、小，分子量，分子量愈大愈大，迁移速度愈，迁移速度愈慢慢。当。当蛋白质迁移到所受阻力最大蛋白质迁移到所受阻力最大时，则完全停止前进。此时，则完全停止前进。此时，时，低电荷密度的蛋白质将低电荷密度的蛋白质将“赶上赶上”与它大小相似，但具有较与它大小相似，但具有较高电荷密度的蛋白质。高电荷密度的蛋白质。n因此，在梯度凝胶电泳中，蛋白质的最终因此，在梯度凝胶电泳中，蛋白质的最终迁移位置迁移位置仅取决仅取决于其于其本身分子大小本身分子大小，而与蛋白质本身的，而与蛋白质本身的电荷密度无关电荷密度无关。 2、分子筛效应、分子筛效应n图中圆球分别代表图中圆球分别代表大、中、小大、中、小3种不同种不同分子量分子

52、量的蛋白质。的蛋白质。大、中、小分子分大、中、小分子分别滞留在与分子大别滞留在与分子大小相当的凝胶孔径小相当的凝胶孔径中，不再前进，因中，不再前进，因而而分离成分离成3个区带个区带。n在梯度凝胶电泳中，凝胶的在梯度凝胶电泳中，凝胶的分子筛效应分子筛效应极为重要。极为重要。 3 3、PGPGPAGEPAGE的优点的优点 n(1)由于梯度凝胶由于梯度凝胶孔径孔径的的不连续性不连续性，可使样品中各组分充分，可使样品中各组分充分浓缩浓缩，即使样品很稀，在电泳过程中，分二、三次加样，即使样品很稀，在电泳过程中，分二、三次加样，也可由于分子量大小不同，最终均滞留于其相应的凝胶孔也可由于分子量大小不同，最终

53、均滞留于其相应的凝胶孔径中而得到分离。径中而得到分离。 n(2)可提供更清晰的蛋白质区带，用于蛋白质可提供更清晰的蛋白质区带，用于蛋白质纯度的鉴定纯度的鉴定。n(3)可在可在一个凝胶板一个凝胶板上，同时上，同时测定数个分子量相差很大测定数个分子量相差很大的蛋的蛋白质。例如用白质。例如用430PGPAGE可分辨分子量为可分辨分子量为500002 000 000之间的各种蛋白质。之间的各种蛋白质。n (4)可直接测定可直接测定天然状态天然状态蛋白质分子量，不被解离为亚基。蛋白质分子量，不被解离为亚基。因此，本法可作为因此，本法可作为SDSPAGE测定测定蛋白质蛋白质分子量的补充分子量的补充。六、聚

54、丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳六、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳n利用利用pI不同，以不同，以PAGE为电泳支持物，并在其中为电泳支持物，并在其中加入加入两性电解质载体两性电解质载体，在电场作用下，两性电解在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成质载体在凝胶中移动，形成pH梯度梯度.n蛋白质在凝胶中迁移至其蛋白质在凝胶中迁移至其pI的的pH处，即不再泳动处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电聚丙烯酰胺等电聚焦电泳泳(isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE)。 1 1两性电解质载体两性电解质载体 n两性电解质载体是用两性电解质载体

55、是用多烯多胺和不饱和酸多烯多胺和不饱和酸合成的合成的脂肪族多脂肪族多氨基多羧基化合物氨基多羧基化合物的的混合物混合物，其中不同的分子因氨基和羧，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的基比例不同而具有不同的pI。n目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如而有不同的商品名称，如Ampholine(LKB公司公司)、Servalyte(德国德国Serva公司公司)、Pharmalyte(Pharrnacia公司公司)。国。国内生产的均称为两性电解质载体，生产厂家有内生产的均称为两性电解质载体，生产厂家有上上海东

56、风生化海东风生化试剂厂、试剂厂、北京军事医学科学院北京军事医学科学院等。等。n一般溶液浓度为一般溶液浓度为40或或20，其，其pH范围分别为：范围分别为：2.55，46.5，58，6.59，810.5，310等。等。 CH2=CHCOOHCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NHRNHR( )nCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NRNHR( )nCH2CH2COOHCH2CH2COOH随机加成随机加成多胺同系物多胺同系物丙烯酸丙烯酸加成度不同的混加成度不同的混合物，分子量大合物，分子量大小不同，胺基和小不同，胺基和羧基的比例不同羧基的比例不同。两性电解质载体两性电解

57、质载体n两性电解质载体两性电解质载体是是IEF-PAGE中中最关键的试剂最关键的试剂，它直接影响它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦。梯度的形成及蛋白质的聚焦。n因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为其终浓度一般为12。npH梯度梯度的线性依赖于的线性依赖于两性电解质的性质两性电解质的性质，选择，选择哪种哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的离蛋白质的pI有关。有关。2、pH梯度形成的机制梯度形成的机制n载体两性电解质既有酸性基团载体两性电解质既有酸性基团( (NHNH2 2) )，也

58、有碱性基团也有碱性基团( (COOCOO) )，既可接受质子，也可释放质子。既可接受质子，也可释放质子。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。 正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异，电泳时，向的不同，其所带正电荷数量就有所差异，电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同。负极泳动的速度也就因此不同。 负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负极是碱性环境，载体两性电解

59、质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。负电荷，以不同速度向正极泳动。 在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的的pH。当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，区域，不在移动。不在移动。 所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解随载体两性电解质的质的pI梯度而形成梯度而形成pH梯度。梯度。 3 3、IEF-PAGE测定测定pIn用用IEF-PAGE分离蛋白质分离蛋白质并并测定测定pI时可

60、先选用时可先选用pI310的两性电解质载体及同一范围的标准的两性电解质载体及同一范围的标准pI蛋白，将其与未知样品同时电泳，固定染色后，蛋白，将其与未知样品同时电泳，固定染色后，以以pH值为纵轴，距阴极迁移距离值为纵轴，距阴极迁移距离(cm)为横轴作为横轴作出出pH梯度标准曲线梯度标准曲线(图图4-2)，根据染色后未知蛋，根据染色后未知蛋白质迁移距离白质迁移距离可推知其可推知其pI。 3 3电极溶液电极溶液 n应选择在电极应选择在电极上不产生易挥发物上不产生易挥发物的液体作为电极缓冲液，的液体作为电极缓冲液，阴、阳电极溶液的阴、阳电极溶液的作用作用是是避免样品避免样品及及两性电解质载体两性电解