细胞原代培养与传代

1、细胞培养定义细胞培养定义u定义：定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。u优点：优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 细胞培养的基本概念v 传代：传代：v

2、 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。v 原代培养原代培养v 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。v 接触抑制接触抑制（Contact inhibition）v细胞相互接触时，将停止增长；v细胞停留在细胞周期的G0期；v转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-

3、10代。 细胞传代次数细胞传代次数（Passage Number） 原代培养 （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 原代培养与细胞系原代培养与细胞

4、系原代培养细胞的生命归宿v原代培养期v传代期v衰退期 The American Type Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA细胞系资源细胞系资源v有限细胞系，无限细胞系 v细胞系 cell linev细胞株 cell strain 培养细胞的特性v 培养细胞的生长方式v贴附生长：v 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各

5、种实体瘤细胞v悬浮生长：v 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程v游离期v贴壁期v潜伏期v对数生长期v停止期（平台期）v游离期：v细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。v10分钟一4小时v贴壁期：v细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。v底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等v血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。v进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团

6、）v潜伏期v此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为624小时。v对数生长期：v细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。v停止期（平台期）：v细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂v机制：接触抑制、密度依赖性二、细胞培养基本要求二、细胞培养基本要求v常用仪器设备常用仪器设备v培养器皿培养器皿v培养基培养基v血清血清v其他细胞培养试剂其他细胞培养试剂培养细胞生长的条件v1 细胞的营养需要v2 细胞的生存环境v 温度: 37 v O2v CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-v pH: 7.2-7.4v 渗透压v 3 无污染v 4 无毒常用

7、仪器设备v超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸vCO2培养箱v倒置显微镜v酶标仪、微孔板震荡器v液氮罐v自动双重纯水蒸馏器，纯水仪v耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管v压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广v电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃v器皿消毒 v滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 v酶液等均采用滤过法除菌 v超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境v紫外灯紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料v培养皿和培养板等表面消毒 超净台v n超净工作台的工作原理是利用鼓风机

8、驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培养器皿 v浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、v流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸

9、泡和冲洗、50烘干烘干n常用玻璃器皿清洗 清洁液的配制培养基的选择培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考： v建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 v其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 1.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 血清使用注意事项血清使用注意事项v血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结

10、冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 v血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。v热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。v勿将血清置于37太久，若在37放置

11、太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质v凝絮物：凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮

12、沉淀物，因为会养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。阻塞过滤膜。 v显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点小黑点”，常，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此中欲培养此“微生物微生物“，但在但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小

13、黑点应但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。另一批号的血清。 血清沉淀物血清沉淀物 如何避免沉淀物的产生如何避免沉淀物的产生?v解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至至4至室温至室温)，若血清，若血清解冻时改变的温度太大解冻时改变的温度太大(如如-20至至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。，实验显示非常容易产生沉淀物。v 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发解冻血清时，请随

14、时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。生。v 请勿将血清置于请勿将血清置于37太久。若在太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。v 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。v 若必须做血清的热灭活，请遵守若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀

15、物的增多。匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。谷氨酰胺谷氨酰胺v谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，44下放置下放置7 7天天即可分解约即可分解约50%50%，所以都是在使用前添加，所以都是在使用前添加v配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上时，要重新周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加

16、入培养液内入培养液内v使用终浓度为使用终浓度为1-4mM1-4mMv一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mM200mM（29.22g/L29.22g/L）v配制方法为配制方法为 ：谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mM200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温的溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，分），过滤除菌，分装小瓶，装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷谷氨酰胺浓缩液，终浓度为氨酰

17、胺浓缩液，终浓度为1-4mM 1-4mM 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞培养用液的配制v抗菌素的使用：v在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。v通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。v庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成v基础培养基 80一95v血清 5一20v碳酸氢钠 2.0 g/Lv青、链霉素 各100单位毫升培养基

18、的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 三、细胞培养基本技术三、细胞培养基本技术v细胞原代培养细胞原代培养 v细胞换液与传代细胞换液与传代v细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏换液：全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。细胞状态细胞换液细胞传代方法v 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代v 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。v

19、直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）v此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代v 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：v1. 吸光培养瓶中的培养液v2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。v3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。v4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。v5. 加适量新鲜培养液于接

20、种了细胞悬液的新培养瓶内。v6. 将后者放入培养箱中培养。细胞冻存和复苏v细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融v当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。v v 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用v在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。v常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透

21、性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法v1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO v2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)v3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。v4 年后，存活率可达80一90。vDMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 ( (一一) )v1. 收到细胞株包裹时，收到细胞株包裹时，

22、请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存或立即冷冻保存(置于置于70 C， 隔夜后，隔夜后， 移到液氮移到液氮)。 v2. 冷冻细胞解冻程序冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，之血清种类， 若因实验需要，若因

23、实验需要， 必须有所不同时，必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，基组成， 确定细胞适应后，确定细胞适应后， 方进行所需之实验。方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清小牛血清)和和HS (horse serum, 马血清马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。之血清种类培养之。 v2.3. 将培养基置于将培养基置于37 C 水槽中回温，水槽中回温， 回温后喷以回温后喷以7

24、0 % 酒精并擦拭之，酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管，移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入立即放入37 C 水槽中快速解冻，水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在使其在1 分钟内全部融化后，分钟内全部融化后， 以以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部，擦拭冷冻管外部， 移入移入无菌操作台内。无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至培养基加至T25 或或T75 flask中。取出已解冻

25、之细胞悬浮液，缓缓加入中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或或T75 flask 内内之培养基，之培养基， 混合均匀，放入混合均匀，放入37 C，5 % CO2 培养箱培养。培养箱培养。 2.5. 对绝大多数细胞而言，对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除成细胞

26、分化之细胞，需立即去除DMSO 者，者， 则可将解冻后之细胞悬浮则可将解冻后之细胞悬浮液放入液放入5 - 10 ml 培养基中，离心培养基中，离心300 xg (约约1000 rpm)，5 分钟，小心分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶转移至培养瓶中，中， 再放入再放入37 C， 5 % CO2 培养箱培养。培养箱培养。收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 ( (二二) )v收到收到T25 flask T25 flask 细胞时，细胞时， 处理方式为处理方式为 1. 1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 T25 flask flask 均加满培养基。请检查均加满培养基。请检查flask flask 外观，并