Westernblot实验步骤

1、Western blot（免疫印迹）（免疫印迹）Western blotWestern blot是是2020世纪世纪7070年代末和年代末和8080年代初，年代初，在蛋白质凝胶在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的一种广泛应用于电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的一种广泛应用于蛋白质检测的分子生物学技术。它是将蛋白质凝胶电泳、蛋白质检测的分子生物学技术。它是将蛋白质凝胶电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。与。与SouthernSouthern、NorthernNorthern杂交方法类似，但杂交方法类似，但Western B

2、lotWestern Blot被检被检测物是蛋白质，测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，它具有直观、特异、灵是抗体，它具有直观、特异、灵敏（敏（pg)pg)的优点，且可进行蛋白质的定性及半定量分析。的优点，且可进行蛋白质的定性及半定量分析。 Western blotWestern blot实验原理：实验原理： 蛋白质混合样品经蛋白质混合样品经SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带（带（其中含有能与特异性抗体相应的待检测的蛋白即其中含有能与特异性抗体相应的待检

3、测的蛋白即抗原蛋白抗原蛋白）原位转移到固相载体膜上（蛋白条带转移）原位转移到固相载体膜上（蛋白条带转移到到NCNC、PVDFPVDF膜上此过程称为膜上此过程称为blotting blotting ），用无关蛋），用无关蛋白质封闭液（如白质封闭液（如BSABSA）封闭膜的非特异性位点（）封闭膜的非特异性位点（膜上膜上没有蛋白转移上去的位点没有蛋白转移上去的位点），加入特异性抗体（即一），加入特异性抗体（即一抗，是抗目的蛋白的抗体）后印迹上的目的蛋白（抗抗，是抗目的蛋白的抗体）后印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加原）与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加入能与一

4、抗发生免疫结合反应的酶标记二抗入能与一抗发生免疫结合反应的酶标记二抗( (二抗即二抗即抗抗体，是以一抗为抗原免疫动物产生的抗体抗抗体，是以一抗为抗原免疫动物产生的抗体) )，最，最后通过二抗上标记酶的性质进行检测，即根据底物显后通过二抗上标记酶的性质进行检测，即根据底物显色的颜色有无及深浅（或发光有无及发光强弱）来探色的颜色有无及深浅（或发光有无及发光强弱）来探测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少。测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少。Western blot 实验步骤实验步骤 1.1.蛋白样品的制备蛋白样品的制备 2. SDS-PAGE 2. SDS-PAGE 蛋白电泳蛋白电泳 3. 3

5、. 转膜转膜 4. 4. 封闭封闭 5. 5. 一抗反应一抗反应 6. 6. 洗膜洗膜 7. 7. 二抗反应二抗反应 8. 8. 洗膜洗膜 9. 9. 底物显色或发光底物显色或发光 10. 10. 终止反应终止反应, ,并照片记录结果并照片记录结果标记二抗的酶标记二抗的酶1.辣根过氧化合酶（辣根过氧化合酶（HRPHRP），），来源于来源于植物植物，用于用于动物性样品动物性样品的检测（目的是消除的检测（目的是消除样样品中内源性酶的干扰品中内源性酶的干扰，降低背景）。，降低背景）。2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶，来源于，来源于动物牛小肠（目前动物牛小肠（目前也有细菌表达的产物），也有细菌表达的产物）

6、，用于用于植物性样植物性样品品的检测，（目的是消除样品中内源性的检测，（目的是消除样品中内源性酶的干扰，降低背景）。酶的干扰，降低背景）。 试验材料介绍：试验材料介绍：酶酶底物底物生成的颜色生成的颜色灵敏度灵敏度生色生色辣根过氧化合酶辣根过氧化合酶（HRPHRP）4-4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/H2O2/H2O2不溶性紫色不溶性紫色1ng1ng二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)/H2O2(DAB)/H2O2不溶性棕褐色不溶性棕褐色250pg250pg3,35,5-3,35,5-四甲基联苯四甲基联苯胺胺(TMB)(TMB)不溶性青蓝色不溶性青蓝色100 pg100 pg碱性磷酸酯酶（碱性磷酸酯酶

7、（APAP）氮蓝四唑氮蓝四唑/5-/5-溴溴-4-4-氯吲哚氯吲哚磷酸磷酸(NBT/BCIP)(NBT/BCIP)不溶性黑紫色不溶性黑紫色沉淀沉淀 100 pg100 pg化学发光化学发光辣根过氧化合酶辣根过氧化合酶ECLECL（过氧化物（过氧化物+ +鲁米诺）鲁米诺） 发蓝色光发蓝色光10 pg10 pg碱性磷酸酶碱性磷酸酶AMPPDAMPPD发光发光1 pg1 pgWestern blot 的酶及其底物的酶及其底物用于免疫印迹的膜及其预处理用于免疫印迹的膜及其预处理 硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NC NC 膜）的预处理：膜）的预处理：转移缓冲液转移缓冲液湿润膜；湿润膜；硝酸纤维素膜硝酸纤维

8、素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，下，带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力地结合在一起疏水作用而高亲和力地结合在一起。从膜的质地上来看，从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，最大能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，最大的蛋白结合量可达的蛋白结合量可达80-150g/cm80-150g/c

9、m2 2。硝酸纤维素膜很脆，易破。硝酸纤维素膜很脆，易破。 根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是。但是膜孔径如果小于膜孔径如果小于0.1m0.1m，蛋白的转移就很难进，蛋白的转移就很难进行了。因此，通常用行了。因此，通常用0.45m0.45m和和0.2m0.2m两种规两种规格的硝酸纤维素膜。大于格的硝酸纤维素膜。大于20kD20kD的蛋白就可以用的蛋白就可以用0.45m0.45m的膜，小于的膜，小于2

10、0kD20kD的蛋白就要用的蛋白就要用0.2m0.2m的膜了，如果用的膜了，如果用0.45m0.45m的膜就会发生转移到的膜就会发生转移到膜反面或穿过膜的现象膜反面或穿过膜的现象。 PVDFPVDF膜（膜（ 聚偏二氟乙烯，聚偏二氟乙烯，polyvinylidene polyvinylidene fluoride)fluoride)的预处理的预处理 ： 在甲醇浸泡在甲醇浸泡1010秒湿润膜，转移缓冲液浸泡秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10101515分钟，除去甲醇。分钟，除去甲醇。PVDFPVDF是是疏水性的，在转膜缓冲疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲液里很难浸透，甲醇处

11、理后使更容易浸润，且甲醇处理活化醇处理活化PVDFPVDF膜上面的正电基团，使它更容易膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合跟带负电的蛋白质结合； PVDFPVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDFPVDF膜膜可以结合蛋白质，而且可以可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质结合小片段的蛋白质，最初是将它用于最初是将它用于蛋白质的序列测定蛋白质的序列测定，虽然，虽然PDVFPDVF膜膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；

12、 带正电的尼龙膜带正电的尼龙膜( (目前已不用目前已不用) )； 蛋白结合于膜的作用力为非共价键的蛋白结合于膜的作用力为非共价键的疏水力、疏水力、静电力静电力 硝酸纤维素膜是通过疏水作用与蛋白质结合，硝酸纤维素膜是通过疏水作用与蛋白质结合，而而PVDFPVDF膜主要通过它膜上的正电荷和负电荷的膜主要通过它膜上的正电荷和负电荷的蛋白结合，同时也有疏水作用，因而，蛋白结合，同时也有疏水作用，因而，PVDFPVDF膜膜和蛋白接合较牢，不易脱落。和蛋白接合较牢，不易脱落。 SDS-PAGE中中SDS（十二烷基硫酸钠）的作用（十二烷基硫酸钠）的作用 强阴离子去污剂使蛋白质强阴离子去污剂使蛋白质变性、亚基

13、解离变性、亚基解离：SDSSDS打打开蛋白质中半胱氨酸残基之间的开蛋白质中半胱氨酸残基之间的二硫键二硫键, , 破坏蛋白破坏蛋白质的质的四级结构四级结构, , 它可以断开它可以断开分子内和分子间的氢键分子内和分子间的氢键, ,破坏蛋白质分子的破坏蛋白质分子的二级及三级结构二级及三级结构； 带带负电荷的负电荷的SDSSDS覆盖于蛋白质表面，把蛋白质本身覆盖于蛋白质表面，把蛋白质本身的电荷封闭，并使蛋白质表面带负电荷，从而使蛋的电荷封闭，并使蛋白质表面带负电荷，从而使蛋白质在电泳时向白质在电泳时向正极移动正极移动； SDSSDS与多肽结合的量与多肽的分子量成正比而与其与多肽结合的量与多肽的分子量成

14、正比而与其序列无关序列无关（平均每两个氨基酸残基结合一个（平均每两个氨基酸残基结合一个SDSSDS分分子），因此子），因此SDS-SDS-多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽中的迁移率只与多肽分子量分子量大小相关。大小相关。聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）原理）原理 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）是蛋白质）是蛋白质分析过程中最常用的技术。分析过程中最常用的技术。 蛋白质在电泳分离时，其蛋白质在电泳分离时，其迁移率迁移率主要取决于主要取决于蛋白质本蛋白质

15、本身所带的电荷多少、分子量大小和形态身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在。但如在PAGEPAGE中加入阴离子去污剂中加入阴离子去污剂SDS, SDSSDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性，键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDSSDS将包裹在变性将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDSSDS带带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的SDSS

16、DS量，而量，而SDSSDS与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比，即迁移率决定于蛋白质分子量大小。因此利用即迁移率决定于蛋白质分子量大小。因此利用SDS-SDS-PAGEPAGE可测定蛋白质的分子量。可测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE 蛋白电泳试剂蛋白电泳试剂1 1. . 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（AcrAcr和和Bis)Bis)：丙烯酰胺丙烯酰胺30g 30g ，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺0.8g0.8g，加水，加水100ml 100ml ，滤，滤纸过滤后储存于棕色瓶中，纸过滤后储存于棕色瓶中，44避光保存，避

17、光保存，pHpH不得超过不得超过7.07.0。（。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应光催化或碱催化其发生脱氨基反应） 2. 2. 4x4x分离胶缓冲液分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HClHCl调调pHpH至至8.8, 8.8, 定容到定容到100ml100ml。 3. 3. 4 4浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液：称趣：称趣Tris 6.06gTris 6.06g，加入，加入1010SDS SDS 4ml4ml，用，用12mol/l HCL12mol/l HCL调至调至pHpH至至6.86.8，定容至，定容至100

18、ml100ml。 4. 4. 10%10%过硫酸胺过硫酸胺： 称取过硫酸胺称取过硫酸胺0.5g, 0.5g, 加水至加水至5ml5ml。提供两种丙稀酰胺聚合所必。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。本存储液应现配现用。须的自由基。本存储液应现配现用。 TEMED TEMED （N N，N N，NNNN四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）原溶液，原溶液， TEMEDTEMED催化过硫酸铵形成自由催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。基而加速两种丙稀酰胺的聚合。 5. 5. 1010电极缓冲液电极缓冲液：称取：称取Tris 30gTris 30g、甘、甘氨酸氨酸144g144g，加入，加入101

19、0SDS 100mlSDS 100ml，定容至，定容至1000ml, pH8.81000ml, pH8.8 6. 6. 2X2X样品缓冲液样品缓冲液: :甘油甘油2ml2ml（或称取蔗糖（或称取蔗糖2g 2g ），加），加入入1010SDS 2mlSDS 2ml，溴酚蓝，溴酚蓝0.25mg0.25mg，浓缩胶缓冲液，浓缩胶缓冲液2.5ml2.5ml、 巯基乙醇巯基乙醇0.5ml0.5ml，加水定容至，加水定容至10ml10ml。 （加入溴酚蓝染料加入溴酚蓝染料, , 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, ,可以自由通过凝胶孔径可以自由通过凝胶孔径, , 所以它显示着电泳的

20、前沿位所以它显示着电泳的前沿位置置, ,当指示剂到达凝胶底部时当指示剂到达凝胶底部时, , 即可停止电泳即可停止电泳） 5X5X样品缓冲液样品缓冲液：0.312mol/L Tris-HCl, pH6.8 , 0.312mol/L Tris-HCl, pH6.8 , 10%SDS, 25% 10%SDS, 25% 巯基乙醇巯基乙醇,0.05%,0.05%溴酚蓝。溴酚蓝。 加入样品加入样品后再添加后再添加1010甘油甘油 5X5X样品缓冲液样品缓冲液： 0.225mol/L Tris-HCl, pH6.8 0.225mol/L Tris-HCl, pH6.8 ；50%50%甘油；甘油；5 5 SD

21、S SDS ；0.050.05溴酚蓝；溴酚蓝；0.25M DTT0.25M DTT 7.7.染色液：染色液：称取考马斯亮蓝称取考马斯亮蓝R-250 2.5gR-250 2.5g，加入，加入甲醇甲醇450ml450ml，冰乙酸，冰乙酸100ml100ml、水、水650ml650ml。 8.8.脱色液脱色液 ：甲醇：甲醇100ml100ml，冰乙酸，冰乙酸700ml700ml，加水，加水830ml830ml。 9.9.十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）溶液）溶液:10%(w/v) 1g :10%(w/v) 1g SDSSDS，10ml10ml去离子水配制，室温保存。去离子水配制，室温保

22、存。 SDS-PAGESDS-PAGE电泳采用电泳采用Tris-Tris-甘氨酸系统甘氨酸系统，即按分子克隆，即按分子克隆中中SambrookSambrook等的方法（等的方法（Sambrook, 1989Sambrook, 1989）进行）进行成份成份 凝胶浓度凝胶浓度 8.51012.51517.5H2O（mL）3.25/5.253.1/4.652.5/3.751.8/2.71.2/1.830Acr: Bis（mL）2.0/3.02.4/3.63.0/4.53.7/5.554.3/6.454 分 离 胶 缓 冲 液分 离 胶 缓 冲 液（mL）1.9/3.611.9/3.611.9/3.6

23、11.9/3.611.9/3.6110% 过硫酸氨（过硫酸氨（ L）112/168112/168112/168112/168112/168TEMED（ L）5.0/7.55.0/7.55.0/7.55.0/7.55.0/7.5分离范围（分离范围（kDa） 36-150 20-120 15-100 12-50 10-40制胶制胶表表1 不同浓度变性聚丙烯酰氨凝胶（分离胶）的配方不同浓度变性聚丙烯酰氨凝胶（分离胶）的配方 浓缩胶制备的方法浓缩胶制备的方法：将丙烯酰胺和甲：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液叉双丙烯酰胺单体储备液0.6ml0.6ml，浓，浓缩胶缓冲液缩胶缓冲液888888 m m、

24、水、水2ml2ml、1010过过硫酸胺硫酸胺 5656l l、TEMED 10TEMED 10l l混合均匀混合均匀后，立即灌胶。后，立即灌胶。 SDS-PAGE 步骤步骤 1. 1. 制胶制胶：根据所需要分离的蛋白质分子量选择分离：根据所需要分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需要的储备液可参考胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需要的储备液可参考上表上表. .按比例按比例配制分离胶配制分离胶，轻缓地摇动溶液，轻缓地摇动溶液, ,使混合均匀，将使混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝

25、胶溶液中入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中( (因液体中含有因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合外界氧气的结合) ) ，然后静置，然后静置40-60min40-60min同前按比例同前按比例配制浓缩胶配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入水分，以

26、连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静止梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静止20min20min以上以保以上以保证完全聚合。证完全聚合。 预电泳预电泳: :将聚合好的凝胶安置于电泳将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。现在一般不进行预电泳现在一般不进行预电泳) ) 2.2. 样品制备样品制备 蛋白质的样品制备是蛋白质的样品制备是West

27、ern BlotWestern Blot的关键步骤，的关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，防止蛋白质降要求尽可能的获得所有蛋白质，防止蛋白质降解，样品处理过程应在低温下进行，并在提取解，样品处理过程应在低温下进行，并在提取缓冲液中加入合适的蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑缓冲液中加入合适的蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂制剂cocktailcocktail、 PMSFPMSF），以避免细胞破碎释，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的降解作用。放出的各种酶类的降解作用。 苯甲基黄酰氟苯甲基黄酰氟 （PMSFPMSF）蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂：在溶在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂液中不稳定，应在临用前从

28、储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSFPMSF，应立即，应立即用大量的水冲洗。用大量的水冲洗。PMSFPMSF通常配成通常配成10mmol/L10mmol/L浓度浓度储液，保存于储液，保存于-20-20度度 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。蛋白质样品在上样电泳前均需变性。 蛋白质分子量标准蛋白质分子量标准markermarker在上样电泳前不用变性。在上样电泳前不用变性。 通常是将样品蛋白质溶液与等体积的通常是将样品蛋白质溶液与等体积的2x2x上样缓冲液混合上样缓冲液混合后置于后置于eppendorfeppendorf管中，将混合物置于管中，将混合物置

29、于100 100 加热加热3-103-10分钟，立即置于冰上，但分钟，立即置于冰上，但有些样品如植物、细菌有些样品如植物、细菌需要离需要离心处理后取上清电泳。蛋白质样品应溶于低离子强度的心处理后取上清电泳。蛋白质样品应溶于低离子强度的缓冲液中。蛋白质的终浓度最好为缓冲液中。蛋白质的终浓度最好为1mg/ml1mg/ml，每个泳道的，每个泳道的上样量取决于所使用染色方法的灵敏程度。考马斯亮蓝上样量取决于所使用染色方法的灵敏程度。考马斯亮蓝染色一般有染色一般有10102020g g样品也已经足够了样品也已经足够了 考马斯亮蓝染色的灵敏度为考马斯亮蓝染色的灵敏度为0.30.31ug1ug，但银染更灵敏

30、，但银染更灵敏 蛋白样品的提取方法：蛋白样品的提取方法：100100毫克的组织（动植物、毫克的组织（动植物、细菌等微生物）液氮磨碎，加细菌等微生物）液氮磨碎，加100100微升的微升的2X2X蛋蛋白质上样缓冲液混匀，白质上样缓冲液混匀，100100煮沸煮沸1010分钟，分钟，5000rpm5000rpm离心离心5 5分钟，取上清进行蛋白电泳分钟，取上清进行蛋白电泳。 当提取的样品中蛋白的含量太低时，可加当提取的样品中蛋白的含量太低时，可加2-32-3倍倍体积的丙酮沉淀，体积的丙酮沉淀，10000rpm10000rpm离心，去上清，沉离心，去上清，沉淀加淀加2X2X蛋白质上样缓冲液，蛋白质上样缓

31、冲液， 100100煮沸煮沸5 5分钟分钟后进行蛋白电泳。后进行蛋白电泳。3.3.上样及电泳上样及电泳 样品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，样品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加满电泳用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加满电泳缓冲液。根据实验需要加样（缓冲液。根据实验需要加样（注意加样时间要尽量短，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边际效应，可在未加样的孔中以免样品扩散，为避免边际效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液加入等量的样品缓冲液）。加样完毕后马上盖好电泳）。加样完毕后马上盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行

32、电泳，通常在不连续槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在不连续系统中，系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，一般采用恒电泳时，一般采用恒压的方式压的方式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶一般采用恒压浓缩胶70-80V70-80V，分离胶分离胶90-100V90-100V，电泳，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。电直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。电泳时间需泳时间需2-32-3小时。小时。 4. 4.

33、 凝胶的染色和脱色凝胶的染色和脱色 电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。小心的取出凝胶，置于小心的取出凝胶，置于考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液中中, ,以浸没凝胶为宜以浸没凝胶为宜, ,在水平摇床上摇动在水平摇床上摇动, ,直到凝胶直到凝胶上上出现明显的条带出现明显的条带为止为止, ,一般需一般需3-63-6小时或者小时或者44过夜过夜; ;然后倾去染色液，用脱色液摇动脱色然后倾去染色液，用脱色液摇动脱色, ,其间要不断更换脱色液其间要不断更换脱色液, ,脱色至脱色至蓝色背景消失蓝色背景消失为止为止。此凝胶即可用于分析。在。此凝胶即可用于分析。在W

34、estern blotWestern blot时电泳完毕后不染色直接进行蛋白转膜。时电泳完毕后不染色直接进行蛋白转膜。 SDS-PAGE注意事项及常遇到的问题注意事项及常遇到的问题1.1.分离胶不要倒得太满，需要有一定的浓缩胶空间分离胶不要倒得太满，需要有一定的浓缩胶空间（1.5cm1.5cm高），否则起不到浓缩效果。高），否则起不到浓缩效果。2.2.混合速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。混合速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。3.3.凝胶总是凝胶总是“缩缩”是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度；也可能母保鲜膜包起来，在里

35、面加点水保持湿度；也可能母液（液（30%30%聚丙烯酰胺）有问题，重新配制。聚丙烯酰胺）有问题，重新配制。 4.4.电泳中常出现的一些现象：电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好，可降低电压。却不好，可降低电压。 条带呈皱眉状条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。完全。拖尾拖尾：样品溶解性不好。：样品溶解性不好。纹理纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

36、条带偏斜条带偏斜：电极不平衡。：电极不平衡。条带两边扩散条带两边扩散：加样量过多或盐离子浓度过高。：加样量过多或盐离子浓度过高。 5. .未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性, , 操作时应戴手套操作时应戴手套6.6.梳子插入浓缩胶时梳子插入浓缩胶时, , 应确保没有气泡应确保没有气泡, , 梳子拔出来时梳子拔出来时应该小心应该小心, ,不要破坏加样孔不要破坏加样孔, ,如有加样孔上的凝胶歪斜如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内可用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内 7.7.上样品缓冲液中煮沸的样品可在上样品缓冲液中煮沸的样品可在-2

37、0-20存放存放 8.8.为减少蛋白质条带的扩散为减少蛋白质条带的扩散, ,上样后应尽快电泳上样后应尽快电泳, ,电泳结电泳结束后也应直接染色或者转印束后也应直接染色或者转印 9.9.上样时上样时, ,小心不要使样品溢出而污染相邻加样孔小心不要使样品溢出而污染相邻加样孔 10.10.取出凝胶后应注意分清加样顺序取出凝胶后应注意分清加样顺序, ,可用刀片切去凝胶可用刀片切去凝胶的一角作为标记的一角作为标记( (如左上角如左上角) )，转膜时也应用同样的方，转膜时也应用同样的方法对法对NCNC膜做上标记膜做上标记( (如左上角如左上角) )以分清正反面和上下关以分清正反面和上下关系系非变性非变性聚

38、丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 分连续和非连续的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分连续和非连续的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，非连续的仅多一层浓缩胶，其他两者相同。非连续的仅多一层浓缩胶，其他两者相同。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的仪器、试剂非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的仪器、试剂和程序与和程序与SDS-PAGESDS-PAGE系统几乎相同，只是电极缓系统几乎相同，只是电极缓冲液中除去冲液中除去SDSSDS, ,上样缓冲液中除去上样缓冲液中除去SDSSDS及及巯巯基乙醇、基乙醇、DTTDTT非变性凝胶电泳与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过非变性凝胶电泳与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电

39、泳过程中和电泳后都不会变性。程中和电泳后都不会变性。最主要不同：最主要不同：凝胶的配置中非变性凝胶不能加入凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDSSDS；非变性凝胶电泳上样缓冲液中没有非变性凝胶电泳上样缓冲液中没有SDSSDS和巯基乙醇和巯基乙醇在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像以及分子大小，不像SDS-PAGESDS-PAGE电泳中蛋白质分离只电泳中蛋白质分离只与其分子量有关；与其分子量有关；非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像完全不同的，不像SDS-PAG

40、ESDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳；才可以电泳；1.1. 因为是非变性凝胶电泳，所用的电流不能太大，以因为是非变性凝胶电泳，所用的电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且电泳免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且电泳都要在都要在0-40-4的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的降解。的活性，也可以降低蛋白质的降解。

41、Western blotWestern blot实验实验 试剂及材料试剂及材料（1 1）硝酸纤维素膜或）硝酸纤维素膜或PVDFPVDF膜。膜。（2 2）APAP酶的底物：酶的底物：NBTNBT和和BCIPBCIP（氮蓝四唑（氮蓝四唑/5-/5-溴溴- -4-4-氯吲哚磷酸）储备液（浓度均为氯吲哚磷酸）储备液（浓度均为50mg/ml50mg/ml），），将将NBTNBT溶于溶于7070二甲基甲酰胺中，二甲基甲酰胺中，BCIPBCIP溶于溶于100100二甲基甲酰胺中，已商品化。二甲基甲酰胺中，已商品化。（3 3）第一抗体（简称一抗）即针对目标蛋白抗原第一抗体（简称一抗）即针对目标蛋白抗原的抗体的

42、抗体，可根据研究的目标自制，应预先测定其，可根据研究的目标自制，应预先测定其效价。常用的为效价。常用的为兔抗体或鼠、兔单抗兔抗体或鼠、兔单抗。（4 4）碱性磷酸酶（或辣根过氧化合酶）标记的碱性磷酸酶（或辣根过氧化合酶）标记的第二抗体第二抗体（简称二抗，即针对一抗的抗体，（简称二抗，即针对一抗的抗体，工作浓度工作浓度1 1：50005000），），根据使用的第一抗体选根据使用的第一抗体选择，如第一抗体为兔抗体，则可使用羊抗兔择，如第一抗体为兔抗体，则可使用羊抗兔IgGIgG抗体，若为鼠源抗体，则可使用羊抗鼠抗体，若为鼠源抗体，则可使用羊抗鼠IgGIgG抗体或兔抗鼠抗体或兔抗鼠IgGIgG抗体。抗

43、体。也可选用其他动也可选用其他动物如驴抗兔或抗鼠物如驴抗兔或抗鼠IgGIgG的抗体。的抗体。（5 5）western blotwestern blot转移缓冲液：转移缓冲液：TrisCl TrisCl 48mmol/l,48mmol/l,甲醇甲醇2020，甘氨酸，甘氨酸 39mmol/l,SDS 39mmol/l,SDS 0.037%,pH8.30.037%,pH8.3。（6 6）TBSTBS缓冲液缓冲液：TrisCl 20mmol/l,NaCl 150mmol/lTrisCl 20mmol/l,NaCl 150mmol/l，pH7.5pH7.5。 (7)(7)TBSTTBST缓冲液缓冲液：T

44、BSTBS缓冲液加缓冲液加0.05% 0.05% 吐温吐温-20-20（v/vv/v）。）。（8 8）封闭缓冲液封闭缓冲液：TBSTBS缓冲液加缓冲液加1 1BSABSA。或。或 5 5 脱脂脱脂奶粉奶粉 (9)(9) NBT NBT和和BCIPBCIP底物显色缓冲液底物显色缓冲液：TrisCl TrisCl 100mmol/l,NaCl 100mmol/l100mmol/l,NaCl 100mmol/l，MgClMgCl2 2 5mmol/l5mmol/l，pH9.5pH9.5。（1010）丽春红染液储存液丽春红染液储存液：丽春红：丽春红S 2g ,S 2g ,三氯乙酸三氯乙酸30g ,30

45、g ,磺基水杨酸磺基水杨酸 30g 30g 加水至加水至100ml 100ml ，用时上述储存液稀，用时上述储存液稀释释1010倍即成丽春红倍即成丽春红S S使用液，脱色液用使用液，脱色液用TBSTBS或或PBSPBS （1111）HRPHRP酶的酶的底物显色液底物显色液：- -氯氯-1-1-萘酚溶萘酚溶液液：1ml 4 -1ml 4 -氯氯-1-1-萘酚溶液（溶于甲醇，浓度萘酚溶液（溶于甲醇，浓度30mg/ml30mg/ml）, , 加加10ml 10ml 甲醇，加甲醇，加TBS TBS 至至50ml;50ml;加加30l H30l H2 2O O（临用前配制）；（临用前配制）； 3,3-3

46、,3-二氨基联苯胺盐酸盐（二氨基联苯胺盐酸盐（DABDAB）溶液溶液:DAB 20mg,TBS 2.5ml, H2O 50ml, 3% H:DAB 20mg,TBS 2.5ml, H2O 50ml, 3% H2 2O O 18l 18l 混合而成（混合而成（临用前现配临用前现配) ) TBSTBS缓冲液可用缓冲液可用PBSPBS缓冲液替代缓冲液替代Western blot实验步骤1.SDS-PAGE电泳2.电转移 蛋白质从凝胶原位转印至膜有两种方法：蛋白质从凝胶原位转印至膜有两种方法： 半干法和湿转法转移是两种不同的转移装置下半干法和湿转法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜、胶、滤纸整

47、个组合完全浸的转移系统，将膜、胶、滤纸整个组合完全浸入有铂丝电极的转移缓冲液中的蛋白原位电转入有铂丝电极的转移缓冲液中的蛋白原位电转移体系，叫移体系，叫湿转法，也叫湿转法，也叫湿转印法、槽式转移湿转印法、槽式转移印迹法印迹法； 将因吸收转移将因吸收转移bufferbuffer而湿润的凝胶而湿润的凝胶- -膜放在吸膜放在吸有转移有转移bufferbuffer的吸水滤纸之间，即滤纸的吸水滤纸之间，即滤纸- -凝胶凝胶- -膜膜- -滤纸夹层组合置于滤纸夹层组合置于2 2个平板电极之间，进行个平板电极之间，进行蛋白原位电转移的体系叫蛋白原位电转移的体系叫半干转印法半干转印法。这两种转印的装置均有商品

48、化，效果均很这两种转印的装置均有商品化，效果均很好，但不同的实验室偏爱其中一种。好，但不同的实验室偏爱其中一种。法半干式转移系统由于两个电极之间的距法半干式转移系统由于两个电极之间的距离十分靠近，所形成的高电场，加快了离十分靠近，所形成的高电场，加快了转移的速度，对缓冲液的需要量少，缺转移的速度，对缓冲液的需要量少，缺点是难以冷却点是难以冷却。槽式转移印迹系统比较适用于槽式转移印迹系统比较适用于100kD100kD的大的大蛋白或疏水蛋白等的较长时间的转移，蛋白或疏水蛋白等的较长时间的转移，缺点是缓冲液用量大，转印时间长。缺点是缓冲液用量大，转印时间长。 湿转法：湿转法：1.1.电泳结束后，取下

49、凝胶，切除浓缩胶，用蒸馏水稍作电泳结束后，取下凝胶，切除浓缩胶，用蒸馏水稍作淋洗凝胶后置于转移缓冲液中泡淋洗凝胶后置于转移缓冲液中泡1010分钟。分钟。2.2.取与凝胶相同大小的取与凝胶相同大小的NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜和膜和2 2张张WhatmanWhatman滤纸，滤纸，置于转移缓冲液中浸湿置于转移缓冲液中浸湿5 5分钟；分钟；3.3.打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，将凝胶平的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将放在阴极侧滤纸上，最后将NCNC膜平放在

50、凝胶上，用玻膜平放在凝胶上，用玻棒滚动除去气泡，再依次放一转印液浸透的滤纸、海棒滚动除去气泡，再依次放一转印液浸透的滤纸、海面垫，夹好电转印夹。面垫，夹好电转印夹。 4. 4. 电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰中（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好入冰中（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的电极，接通电流，转印夹的NCNC膜应对电泳槽的正极，膜应对电泳槽的正极，凝胶接负极，电流强度为凝胶接负极，电流强度为0.65 mA/cm0.65 mA/cm2 2 滤膜，电泳滤膜，电泳45min-1.5 h45min-

51、1.5 h。湿转移示意图湿转移示意图 凝胶硝酸纤维膜滤纸海绵(+)(-) 半干式电转移半干式电转移1.1.电泳后取出凝胶，取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分电泳后取出凝胶，取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部割弃，开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部割弃，取一取一10ml10ml注射器吸满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶注射器吸满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开之间注水，使水的压力将两者自然分开, ,边推边进边推边进, ,反反复多次注水复多次注水, ,直至凝胶从玻璃板上滑落下来直至凝胶从玻璃板上滑落下来, ,放入转移放入转移缓冲液

52、中湿润缓冲液中湿润10-20min 10-20min 。 2. 2. 将将NCNC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润中湿润5-10min.5-10min. 3. 3. 按照下图顺序放置滤纸，凝胶和按照下图顺序放置滤纸，凝胶和NCNC膜放置到半干盒膜放置到半干盒中。中。 4. 4. 每层之间的气泡要全部去除。可以用玻璃棒轻轻在每层之间的气泡要全部去除。可以用玻璃棒轻轻在上面滚动去除气泡，胶四周平板电极上的缓冲液转印上面滚动去除气泡，胶四周平板电极上的缓冲液转印擦干，防止电流直接从没有凝胶处通过造成短路，盖擦干，防止电流直接从没有凝胶处通过造成短

53、路，盖好，通电流，小胶一般好，通电流，小胶一般10V,30min10V,30min或或15V,15min;15V,15min;大胶大胶25V,30min25V,30min或或15V,60min15V,60min。 半干转移仪半干转移仪 注意事项：注意事项：1 1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸= =膜膜= =胶。胶。2 2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。短路。3 3）因为）因为PFDVPFDV膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。膜必须随时保持湿润。浸湿。膜

54、必须随时保持湿润。4 4）转移时间可根据分子量大小调整转移时间和电流）转移时间可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。小分子的蛋白易转印，故在转移过程中会转印大小。小分子的蛋白易转印，故在转移过程中会转印到膜的反面去。所以大分子的转上去以后，有一部分到膜的反面去。所以大分子的转上去以后，有一部分小分子的就透过到膜的反面，小分子蛋白可使用小孔小分子的就透过到膜的反面，小分子蛋白可使用小孔径的径的NCNC膜（膜（0.20.2微米）；微米）； 5 5）重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，）重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，电阻越来越大，当然恒压时电流越来越小了。建议更电阻越来越大，当然

55、恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。 6 6）大分子的蛋白转移较慢，）大分子的蛋白转移较慢， 可延长转移时间可延长转移时间和电流，大分子一端就会好得多，但是小分子和电流，大分子一端就会好得多，但是小分子的就有可能会变淡。的就有可能会变淡。 7 7）胶四周平板电极上的缓冲液转印擦干，防）胶四周平板电极上的缓冲液转印擦干，防止电流短路，此时电流很大。止电流短路，此时电流很大。 8 8）电压一定时而电流过大，可能是转移缓冲）电压一定时而电流过大，可能是转移缓冲液不对，如液不对，如10X10X的转移缓冲液未稀释，也可能的转移缓冲液未稀释，

56、也可能是上述是上述7 7的原因。的原因。 印迹膜上总蛋白的染色印迹膜上总蛋白的染色 通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况白质的组成情况, ,并可确定蛋白质分子质量标记物的并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功；丽春红位置和确定转印成功；丽春红S S带负电荷带负电荷, , 可以与带可以与带正电荷的氨基酸残基结合正电荷的氨基酸残基结合, , 同时丽春红也可以与蛋白同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合的非极性区相结合, , 从而形成红色条带，从而形成红色条带， 丽春红丽春红S S与与蛋白质的结合是可逆的蛋白质的结合是可

57、逆的, , 红色染料易被洗脱。红色染料易被洗脱。 丽春红丽春红S S印迹膜染色法：印迹膜染色法： 转印结束后取出印迹膜至于丽春红转印结束后取出印迹膜至于丽春红S S应应用液中用液中, , 并在室温下摇动并在室温下摇动5-105-10分钟分钟 将膜放入将膜放入PBSPBS洗数次洗数次, , 每次每次1-21-2分钟分钟, , 更换更换PBSPBS 根据需要将转印部位和分子量标准位根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记置进行标记 至此膜可以用于封闭和加入抗体至此膜可以用于封闭和加入抗体 3 3）电转移后的硝酸纤维素膜漂于）电转移后的硝酸纤维素膜漂于TBSTTBST缓冲液，缓冲液，直至完全湿润、

58、浸泡，稍作淋洗直至完全湿润、浸泡，稍作淋洗; ;4 4）将膜浸于封闭液，）将膜浸于封闭液，44过夜，以封闭非特异过夜，以封闭非特异性蛋白结合位点性蛋白结合位点; ; 或室温缓慢摇动或室温缓慢摇动2-32-3小时；小时；膜的封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行膜的封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质，常用的有采用异源性蛋白质，常用的有1-3%BSA1-3%BSA，10%10%马血清马血清以及以及3-10% 3-10% 脱脂奶粉等，至于选择哪一类封闭液，脱脂奶粉等，至于选择哪一类封闭

59、液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A A（SPASPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背景浅，封闭液以次是尽可能使非特异着色背景浅，封闭液以5% 5% 脱脱脂奶粉效果较好，其次是脂奶粉效果较好，其次是3% BSA3% BSA。5 5）将膜浸入多克隆抗体或单克隆抗体）将膜浸入多克隆抗体或单克隆抗体( (即一抗即一抗) )的稀释液中（用封闭液适当倍数稀释），室温的稀释液中（用封闭液适当倍数稀释），室温下在水平摇床上缓慢水平摇动反应下在水平摇床上缓慢水平摇动反应1-2h;1-2

60、h;6 6） 用用TBSTTBST洗涤洗涤3-53-5次，每次约次，每次约3-5min3-5min；7 7）将膜转移至于）将膜转移至于1:100001:10000倍稀释的碱性磷酸酶标倍稀释的碱性磷酸酶标记抗兔或鼠记抗兔或鼠IgG(IgG(即酶标二抗即酶标二抗) )中，室温下轻轻中，室温下轻轻摇动反应摇动反应1-2hr1-2hr；8 8）洗膜：）洗膜：TBST TBST 洗膜洗膜 4-54-5次，次， 每次每次3-53-5分钟，洗分钟，洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要