色谱柱的维护

1、色谱柱的维护 1.如何进行色谱柱的维护？ 首先避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。 建议检测前样品和流动相进行过滤。 建议每天做完样品后及时进行清洗。 常规检测：测试完后直接把色谱柱反向连接采用90%有机相冲洗45min，后保存在纯甲醇或纯乙腈中。 使用缓冲盐条件： a等度条件：使用缓冲盐之前和之后都用过渡流动相以1ml/min流速冲洗45min。 b梯度条件：使用缓冲盐之前与初始流动相组成相同的过渡流动相以1ml/min流速冲洗45m

2、in。 注意： 过渡流动相是指有机相和水相比例与分析流动相相同比例，只是不含有缓冲盐。 c缓冲盐冲洗干净后，采用90%有机相反向冲洗60min， 后保存在纯有机溶剂中。 注意： 如果使用缓冲液不能存留色谱柱中过夜。 2.网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以。反冲后是正者用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等好都有解释。 答:一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是

3、:正向使用，反向冲洗。 3.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。可能柱超载，减少进样量。 4.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法是什么？ 样品量不足，解决办法为增加样品量。 样品未从柱子中流出，可根据样品的化学性质改变流动相或柱子。样品与检测器不匹配，根据样品化学性质调整波长或改换检测器。检测器衰减太多，调整衰减即可。检测器时间常数太大，解决办法为降低时间参数。检测器池窗污染，解决办法为清洗池窗。检测池中有气泡，解决办法为排气。记录仪测压范围不当，

4、调整电压范围即可。流动相流量不合适，调整流速即可。检测器与记录仪超出校正曲线，解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 5.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？ 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理。 比例阀失效，更换比例阀即可。泵密封垫损坏，更换密封垫即可。溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法。系统检漏，找出漏点，密封即可。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。 6.HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？ 柱压过高是HPLC柱用户 常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因： 拆去保护预柱，

5、看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查。把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查。只用于使用过的柱子。更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。 7.为何出现峰展宽？ 样品体积过大：用流动相配样，总的样品体积小于 一峰的15%。 在进样阀中造成峰

6、扩展:进样前后排出气泡以降低扩散。数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点。流动相粘度过高:增加柱温，采用低粘度流动相。检测池体积过大:用小体积池，卸下热交换器。保留时间过长:等度洗脱时增加强溶剂含量，也可用梯度洗脱。柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至 小。样品过载:进小浓度小体积样品。 8.流动相出现气泡的原因有哪些？ 流动相溶液中往往因溶解有氧气或空气而形成气泡。 液路阻力比较大，吸液时出现了真空气泡。系统开始工作时未能将流路中的空气排除干净。在注入样品时混入了空气。 9.常用的实验室脱气方式还有哪些？ 加热回流脱气，脱气效果 佳，但无法保持。 氦脱气，此方法脱气效果佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多。 真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失。 超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中 常用。目前还是尽量争取用在线脱气，方便且效果好。 10.氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？ 答：用5-10倍