第四章药物的含量测定方法与验证

1、第四章 药物的含量测定方法与验证1、药物的含量：指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要标准。2、可供药物含量测定的分析方法：（1）容量分析法优点：操作简便，结果准确，方法耐用性高。缺点：方法缺乏专属性。适用：适用于对结果准确度与精密度要求较高的样品的测定。（2）光谱分析法优点：简便，快速，灵敏度高，并具有一定的准确度。缺点：方法专属性稍差。适用：适用于对灵敏度要求较高、样本量较大的分析项目。（3）色谱分析法优点：高灵敏度与高专属性，并具有一定的准确度。缺点：结果计算需要对照品。适用：适用于对方法的专属性与灵敏度要求较高的复杂样品的含量测定。3、为确保分析结果的可靠性，要求分析方法应准确、

2、稳定、耐用。4、验证内容包括：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。§4-1 定量分析方法的分类与特点一、容量分析法容量分析法：也称滴定法。是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。当滴定液与被测药物完全作用时，反应达到化学计量点。在进行容量分析时，当反应达到化学计量点时应停止滴定，并准确获取滴定液被消耗的体积。但在滴定过程中反应体系常常无外观现象的变化，必须借助适当的方法指示化学计量点的到达。其中，最常用的方法是借

3、助指示剂的颜色或电子设备的电流或电压变化来判断化学计量点。指示剂的颜色或检测设备的电信号的突变点通常被称为滴定终点。但滴定终点与滴定反应的化学计量点不一定恰好符合，二者之差被称为滴定误差。滴定误差是容量分析法中系统误差的重要来源之一，为了减少滴定误差，要选用合适的指示剂或指示方法（如在非水溶液中常见用电位滴定法），使滴定终点尽可能的接近滴定反应的化学计量点。（一）容量分析法的特点与适用范围1、容量分析法的特点（1）方法简便易行：本法所用仪器廉价易得，操作简便、快速。（2）方法耐用性高：影响本法测定的试验条件与环境因素较少。（3）测定结果准确：通常情况下本法的相对误差在0.2%以下，适用于对准确

4、度要求较高的试样的分析。（4）方法专属性差2、容量分析法的适用范围由于容量分析法具有以上特点，被广泛应用于化学原料药物的含量测定，而较少应用于药物制剂的含量测定。（二）容量分析法的有关计算1、滴定度：指每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量。 中国药典用毫克（mg）表示。2、滴定度的计算被测物质分子（A）与滴定剂（B）进行反应当反应完全时，被测药物的量（wA）与滴定剂的量（wB） 滴定度T：单位体积（VB=1ml）的滴定液相当于被测药物的量。 不同药物的摩尔质量以及与滴定剂反应的摩尔比不同，同一滴定液对不同被测药物的滴定度是不同的。例1用溴酸钾法测定异烟肼M(C6H7N3O)=137.

5、14的含量时，溴酸钾滴定液的摩尔浓度为0.01667mol/L（以溴酸钾为单元），化学反应式如下则滴定度3、含量的计算（1）直接滴定法：实际的滴定度（T）=滴定度（T）×浓度校正因数（F）实际的体积（V）=滴定体积（V）×浓度校正因数（F）(2)间接滴定法生成物滴定法：指被测药物与化合物A作用，定量生成化合物B，再用滴定液滴定化合物B。该法的百分含量计算方法与直接滴定法相同，只是在计算滴定度时需考虑被测药物与化合物B以及化合物B与滴定剂三者之间的化学计量关系（摩尔比）。例2葡萄糖酸锑钠的含量测定：取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml，盐酸15ml与碘化

6、钾试液10ml，密塞，振摇后在暗处放置10分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试液校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）相当于6.088mg的锑（Sb）。反应式：1mol锑与1mol碘化钾作用生成1mol碘单质，而1mol碘单质消耗2mol硫代硫酸钠。所以，硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）对葡萄糖酸锑钠（以Sb=121.76计算）的滴定度剩余量滴定法：亦称回滴定法。先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物定量反应，待反应完全后，再用另一滴定液B回滴定反应后剩余的滴定液A。在计算含量时，要考虑滴定过程

7、中是否进行空白试验校正。当不进行空白试验校正时：当进行空白试验校正时：例3司可巴比妥钠的含量测定：取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1分钟，在暗处放置15分钟后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。已知：M=260.27；司可巴比妥钠与溴反应比为1:1；W=0.1022g；F（Na2S2O3）=1.038；供试品滴定消耗硫代硫酸钠滴定液15.7

8、3ml；空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液23.21ml。计算：溴滴定液的滴定度T（Br2）及司可巴比妥含量。二、光谱分析法光谱：当物质吸收辐射能（或热能）后，其内部发生能级跃迁。记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得到的图谱。光谱分析法：利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法。（一）紫外-可见风光光度法紫外光区：波长为200-400nm；可见光区：波长为400-760nm1、朗伯-比耳定律单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层厚度（光路长度）成正比。E通常采用百分吸收系数（E1%1cm）表示，其物理意义为：当待测溶液浓度为每100ml中还有

9、待测药物1g（1%，g/ml），该液层厚度为1cm时的吸光度值。计算出供试品含量：2、方法特点与适用范围（1）简便易行：本法使用的仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。（2）灵敏度高：本法灵敏度可达10-710-4g/mL，适用于低浓度试样分析。（3）准确度较高：本法的相对误差约为2%5%。（4）专属性较差：由于紫外-可见分光光度法具有以上特点，故本法较少应用于原料药的含量测定，可用于药物制剂的含量测定，但更多应用于药物制剂的定量检查，如片剂的溶出度或含量均匀度检查。3、仪器校正和检定（1）波长仪器波长的允许误差为：紫外光区±1nm，500nm处±2nm。（2）吸光度的准确度

10、可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。（3）杂散光的检查（4）对溶剂的要求含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试品之前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求。（5）测定法对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：原料药百分量的计算公式如下： 固体制剂含量相当

11、于标示量的百分数计算公式： 吸收系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量：当测定液体含量时 当测定固体（片剂）含量时 计算分光光度法比色法（二）荧光分析法（详见药物分析P151）1、方法特点与适用范围（1）高灵敏度（2）荧光自熄灭（3）易受干扰2、干扰的排除（1）溶剂（2）溶液（3）玻璃量器（4）温度3、测定法与含量计算三、色谱分析法色谱分析法：是根据混合物中各组分的色谱行为差异（如在吸附剂上的吸附能力的不同或在两相中的分配系数不同），将各组分从混合物中分离后再（在线或离线）选择性对待测组分进行分析的方法。色谱分析法是一种分离

12、分析方法，是分析混合物的最有力的手段。1、色谱分析发的特点与适用范围（1）高灵敏度：最低检出浓度可达10-1510-12g/mL。（2）高专属性：可实现对待测组分的选择性检测。（3）高效能与高速度广泛应用于药物制剂的含量测定，尤其是复方制剂含量测定的首选方法。2、色谱分析法的分类（1）依据分离原理吸附色谱法；分配色谱法；离子交换色谱法；分子排阻色谱法（2）依据分离方式纸色谱；薄层色谱；柱色谱；高效液相色谱；气相色谱（一）高效液相色谱法采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。1、对仪器的一般要求（1）色谱柱（2）检测器（3）流动相2、系统适用

13、性试验（1）色谱柱的理论板数（n）：用于评价色谱柱的分离效能。（2）色谱峰的分离度（R）：衡量色谱系统效能的关键指标。（3）色谱系统的重复性（4）色谱峰的拖尾因子（T）：用于评价色谱峰的对称性。3、测定法（1）内标法采用内标法，可避免因样品前处理及进样体积误差对结果的影响。（2）外标法外标法简便，但要求进样量准确及操作条件稳定。（二）气相色谱法采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。1、对仪器的一般要求（1）载气：氮气、氦气、氢气（2）色谱柱：填充柱、毛细管柱（3）检测器（4）进样：溶液直接进样、顶空进样2、系统适用性试验3、测定法或：§4-2 样品分析

14、的前处理方法样品前处理：分析前采用一定方法使待测药物或元素转化为适宜的状态满足分析方法对试样的要求1、含卤素元素（1）卤素与脂肪链的碳原子相连结不牢固，经碱溶液直接回流即可解离。（2）卤素与芳环相连结合牢固，需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉），回流，使C-X键断裂，转化为无机卤化物后测定。2、含金属元素（1）含金属的有机化合物：金属离子不直接与碳原子相连，为有机酸或酚的金属盐或配位化合物。（2）有机金属药物：金属离子直接与碳原子以共价键相连，结合状态比较牢固，在溶液中不能直接离解出金属离子（少见）。一、不经有机破坏的前处理方法（一）水解法1、酸水解法常用于水难溶的含金属的有机药物将它们与适当的无

15、机酸（如盐酸）共热，可将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐。2、碱水解法适用于卤素原子结合不牢固的含卤素有机药物，如卤素与脂肪碳链相连者。（二）还原法含碘有机药物，当碘原子直接与芳环连接时，碘的结合较牢固，采用碱性溶液回流时难以使碳碘键断裂，但可在碱性溶液中加还原剂锌粉回流，使其碳碘键断裂而转化为无机碘化物。（三）直接测定法1、配位滴定法2、氧化还原滴定法二、经有机破坏的前处理方法待测原子与碳原子结合牢固者，用有机破坏的方法将药物分子中有机结构部分完全破坏，使有机结合形式的待测原子转变为可测定的无机离子（或氧化物、无机酸等）后方可采用适当的分析方法。（一）湿法破坏本法适用于含氮有机药物分析的前处

16、理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理。本法亦用于生物样品中金属元素测定时的生物基质的去除。凯氏定氮法以基于硫酸硫酸盐有机破坏法的含氮有机药物定量分析方法。（1）原理：将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被氧化分解（亦称消解或消化）成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氨，并与过量的硫酸结合为碳酸氢铵，经氢氧化钠碱化后释放出氨气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。（2）仪器：凯氏烧瓶（半微量法3050mL；常量法500mL）、安全瓶、圆底烧瓶、连有氮气球的蒸馏器、漏斗、直形冷凝管、锥形瓶、橡皮管夹（3）

17、方法常量法：取供试品的量应约相当于含氮量2530mg，精密称定，加供试品为固体或半固体，可用滤纸称取，并连同滤纸置干燥的500ml凯氏烧瓶中；然后依次加入硫酸钾（或无水硫酸钠）10g和硫酸铜粉末0.5g，再沿瓶壁缓缓加硫酸20ml；在凯氏烧瓶口放一小漏斗，并使凯氏烧瓶成45度斜置，用直火缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸停止，强热至沸腾，待溶液呈澄明的绿色后，除另有规定外，继续加热30分钟，放冷，沿瓶壁缓缓加水250ml,振摇使混合，放冷后，加40%氢氧化钠溶液75ml，注意使沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，加锌粉数粒（以防暴沸），用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接；另取2%硼酸溶液50ml

18、，置500ml锥形瓶中，加甲基红溴甲酚绿混合指示剂10滴；将冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下，轻轻摆动凯氏烧瓶，使溶液混合均匀，加热蒸馏，至接收液的总体积约为250ml时，将冷凝管尖端提出液面，使蒸气冲洗约1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏；馏出液用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相当于1.401mg的氮（）。半微量法取供试品的量应约相当于含氮量1.02.0mg，精密称定，使用3050ml的凯氏烧瓶；消解剂用量相应减少，加硫酸钾（或无水硫酸钠）0.3g与30%硫酸铜溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0m

19、l，消解操作与常量法基本相同。蒸馏与滴定操作如下：取2%硼酸溶液10ml，置100ml锥形瓶中，加甲基红溴甲酚绿混合指示液5滴，将冷凝管的下端插入液面下。然后将凯氏烧瓶中内容物经由D漏斗转入蒸馏瓶C中，用水少量淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次，再加入40%氢氧化钠溶液10ml，用水少量再洗漏斗数次，关G夹，加热A瓶，进行水蒸气蒸馏，至硼酸溶液开始由酒红色变为蓝绿色时起，继续蒸馏约10分钟后，将冷凝管尖端提出液面，使蒸气继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏。馏出液用硫酸滴定液（0.005mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验（空白和供试品所得馏出液容积应基本相同，为7075

20、ml）校正。每1ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相当于0.1401mg的氮（N）。（4）注意在硫酸中加入硫酸钾（或无水硫酸钠）的目的？提高硫酸沸点，从而提高消解温度。加入催化剂硫酸铜的作用是什么？硫酸铜的优点？加快消解速度，以缩短消解时间。硫酸铜低毒、价廉、无挥发性。消解过程中为什么常需加入辅助氧化剂？高氯酸用量有什么要求？使分解完全并缩短消解时间。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。若使用量过大，可能生成高氯酸铵而分解或将氮元素氧化生成氮气而损失，而且高氯酸在高温加热时易发生爆炸。消解注意问题a.凯氏瓶放小漏斗，瓶内放玻璃珠或沸石。b.消解液无色或绿色。（一般为绿色，继续加热30分钟）c.

21、毒气橱中进行，初小火，泡沸停止后大火。半微量法测定时的蒸馏装置在使用之前应清洗，操作方法？连接蒸馏装置，A瓶中加水适量与甲基红指示液数滴，加稀硫酸使成酸性，加玻璃珠或沸石数粒，从D漏斗加水约50ml，关闭G夹，开放冷凝水，煮沸A瓶中的水，当蒸气从冷凝管尖端冷凝而出时，移去火源，关H夹，使C瓶中的水反抽至B瓶，开G夹，放出B瓶中的水，关B瓶及G夹，将冷凝管尖端插入约50ml水中，使水自冷凝管尖端反抽至C瓶，再抽至B瓶，如上法放去。如此将仪器内部洗涤23次。（二）干法破坏本法主要适用于含卤素、硫、磷等有机药物定量分析的前处理。1、高温灼烧法本法将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而

22、待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐的前处理方法。本法主要适用于含卤素药物的鉴别，亦用于含磷药物的含量测定。根据分析对象与目的不同，常加无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。2、氧瓶燃烧法（1）原理：将分子中含有待测元素的有机药物在充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为二氧化碳和水，而待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在），以供待测元素的检查或定量测定用。（2）优点：本法是快速分解有机结构的最简单方法。它不需要复杂的设备，在极短的时间内即可使有机结合的待测元素定量转化为无机形式。（3）仪器：燃烧瓶为

23、500ml、1000ml或2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空心，底部熔封铂丝一根（直径为1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3。（4）方法在燃烧瓶内按个品种项下的规定加入吸收液，并将瓶口用水湿润；小心急速通氧气约1分钟（通气管口应接近液面，使瓶内空气排尽），立即用表面皿覆盖瓶口，备用；点燃包有供试品的滤纸包或纸袋尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，用水少量封闭瓶口，待燃烧完全（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15分钟，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液。用同法另作空白试验。然后按各品种项下规定的方法进行检查或测定。（5）特点快

24、速、简便、破坏完全。仪器简单。适用于含卤素、硫、磷、硒等。样品用量少（1020mg）。§4-3 药品质量标准分析方法验证1、需验证的分析项目 2、验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性一、准确度准确度：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。（一）含量测定方法的准确度1、原料药的含量测定（1）用已知纯度的对照品或供试品进行测定。（2）用本法所得的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。 2、制剂的含量测定（1）已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定。（2）向制剂中加入已知量的被测物进行测定。（3）用本

25、法所得的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。 （二）杂质定量测定方法的准确度杂质定量测定方法多采用色谱法，其准确度可通过向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测试。（三）数据要求在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。二、精密度精密度：指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用标准偏差（s或SD）或相对标准偏差表示（RSD）。（一）验证内容1、重复性：同一实验室，同一人，多次测定。2、中间精密度：同一实验室，不同人，不同仪器。3、重现性：不同实验室，不同人。（二）数据要求 精密度验证中所测数据均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。三、专

26、属性专属性：指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。（一）鉴别反应应能与可能共存的物质或结果相似化合物区分，不含被测成分的供试品，以及结果相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。（二）含量测定和杂质测定1、杂质可获得：对于含量测定，试样中科加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质之间能否得到分离。2、杂质或降解产物不能获得：可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的方法或药典方法比较结果；用强光照射、高温、高湿、酸碱水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物及其降解途径。含量测定方法应比对二法的结果，杂质检查应比对检出的杂质个数。四、检测限检测限：指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，它反映方法是否具有灵