分子课件 第九章遗传重组

1、第九章第九章 遗传重组遗传重组概述概述第一节第一节 同源重组同源重组第二节第二节 位点专一性重组位点专一性重组第三节第三节 细菌中的转座成分细菌中的转座成分第四节第四节 真核生物中的转座成分真核生物中的转座成分概述：概述： 只要有只要有DNA，就会发生重组，就会发生重组减数分裂减数分裂高等高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体温和噬菌体转座子转座转座子转座 生存生存变异变异突变，重组突变，重组 损伤修复、适应环境、加速进化损伤修复、适应环境、加速进化 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程 重组可分为

2、四类（重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）序列、蛋白质因子） 狭义遗传重组：涉及到狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂分子内断裂-复合的基因交流复合的基因交流 遗传重组与重组遗传重组与重组DNA技术技术 异常异常第一节第一节 同源重组同源重组1、 同源重组（同源重组（homologous recombination）: 发生在同源发生在同源DNA序列之间序列之间一、特征一、特征2、 特征：特征： 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大 涉及涉及DNA分子在特定的交换位点发生分子在特定的交换位点发生断裂和错接断裂和错接的生化过程的生化过程 异源双

3、链区的生成异源双链区的生成 存在重组热点存在重组热点 需要重组酶需要重组酶 单链单链DNA分子或单链分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号末端是交换发生的重要信号细线期细线期合线期合线期粗线期粗线期双线期双线期终变期终变期 e.g.e.g. EukEuk. .减数分裂时减数分裂时 的染色单体之间的染色单体之间 的交换的交换 细菌的转化，细菌的转化， 转转 导，接合，噬菌体导，接合，噬菌体 重组重组双倍体染色体交换双倍体染色体交换二、同源重组的机制二、同源重组的机制1、 断裂复合及断裂复合及Holliday中间体的形成中间体的形成 Holliday结构结构 同源重组中连接两个同源重组中连接两个

4、DNA双链的交换中间物含有双链的交换中间物含有4股股DNA链，链， 在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为 Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）结构形成的分子机制（断裂复合起始机制） 有双链侵入模型、有双链侵入模型、单链侵入模型单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种、双链断裂修复模型等多种 同源重组都涉及到同源重组都涉及到DNA分子内的断裂分子内的断裂复合复合3553Meselson-Radding模型模型单链入侵模型（链转移模型）单链入侵模型（链转移模型）置换置换侵入侵入Loop切除切除同化同化 异构化异构化 分支迁移分支迁移5切

5、割切割55（1）（2）其中其中 所有模型和所有模型和 假说都包括假说都包括 切断、链置切断、链置 换、连接等换、连接等 过程过程 双链侵入模型双链侵入模型 P143双链断裂修复模型双链断裂修复模型 P1452、 分枝迁移和分枝迁移和Holliday结构的拆分结构的拆分 分枝迁移（分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散Holliday的异构化的异构化产生重组体的拆分产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可结构一经生成即可不断地处于异构化不断地处于异构化异源双链异源双链 heteroduplex DNA重组结

6、果取决于拆分时重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置配对链上的切口位置（1）（2）（1）（2） Holliday结构的拆分结构的拆分产生含异源双链产生含异源双链的亲本的亲本DNA分子分子产生重组体产生重组体“亲本链亲本链”“重组体重组体”三、原核同源重组（三、原核同源重组（E.coli） 发生在双方发生在双方DNA的同源区域的同源区域 部分复制的染色体部分复制的染色体DNA之间或染色体之间或染色体DNA与外源与外源DNA之间之间 细菌的转化、结合和转导细菌的转化、结合和转导 1、RecBCD（外切核酸酶（外切核酸酶）和）和 Chi 位点位点 具有解旋酶（再旋）活性、具有解旋酶（再旋）活性、AT

7、Pase活性、活性、核酸外切酶活性、核酸外切酶活性、 序列特异性的单链内切酶活性序列特异性的单链内切酶活性 单链内切酶活性和解旋酶活性使单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点的作用位点 RecBCD有固定切割位点有固定切割位点3 RecBCD的识别和切割位点的识别和切割位点a、 RecBCD结合在结合在DNA的平的平 头末端（产生机制不清楚）头末端（产生机制不清楚）b、 外切、外切、解链、移动解链、移动 （ATP）c、 兔耳状兔耳状 loop 结构产生结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、 RecBCD

8、在在 loop 单链区的单链区的 chi 位点位点3方方46NT处切处切 断单链（单链内切酶）断单链（单链内切酶） chi位点：位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点目前发现的重组热点 E.coli 含含 1000 个、个、Euk.e、 RecBCD 切割产生切割产生3单链末端单链末端 2、RecA 蛋白蛋白 （1） 活性活性a、 RecA 有单、有单、双链双链 DNA 结合活性结合活性 b、 RecA 有有 NTPase 活性（底物差异活性）活性（底物差异活性） 与单链与单链 DNA 结合时活性最大结合时活性最大-依赖于依赖于 DNAc、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分

9、子有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源的能力，即联会同源 DNA （但其靶（但其靶 DNA 必须有缺口结合必须有缺口结合DNA）RecA入侵单链入侵单链被置换连被置换连RecA引发链侵入模型引发链侵入模型RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA启动的单链入侵启动的单链入侵RecA引起的链交换和引起的链交换和Holliday结构的生成结构的生成 （2

10、）RecA 蛋白催化双链和单链蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段的反应阶段a、 联会前阶段（缓慢）联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合与单链结合b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）侵入）c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，反应结束时，RecA 结合到双链上结合到双链上 其中其中单链同化有固定的方向单链同化有固定的方向 入侵单链为入侵单链为53 双链双链 DNA 的互补链是的互补链是35 RecBCD 和和 Re

11、cA 的共同作用的共同作用 3、原核同源重组的其它蛋白、原核同源重组的其它蛋白 需要需要 E.coli 中三个基因中三个基因 ruvA,ruvB 和和 ruvC 的产物的产物 a、 RuvA 识别识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s） c、 RuvC 核酸内切酶核酸内切酶-专一性识别专一性识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体体外切段连接点以拆分重组体 E.coli 重组的各阶段重组的各阶段 （损伤修复）（损伤修复）损伤损伤DNADNA复复制产生缺口制产生缺口

12、RecARecA链交换链交换第二次链交换第二次链交换DNApolDNApol通过通过DNADNA合成填满缺口合成填满缺口RuvA,BRuvA,B分枝迁移分枝迁移RuvCRuvC切割切割HollidayHolliday连接点连接点第二节第二节 位点专一性重组位点专一性重组一、位点专一性重组（一、位点专一性重组（ site-specific recombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间分子间 的重组的重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：、特征： 在特定的结

13、合序列部位，有专一的酶催化断裂重接在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的产生精确的DNA重排重排 都具有整合作用的两个基本特征都具有整合作用的两个基本特征a、 典型的保守性重组典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的交换是相互的和保存原先的DNAb、 发生在噬菌体和细菌发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上短同源序列的专一性核苷酸上Euk. 中专一性抗体基因的构建中专一性抗体基因的构建二、二、phagephage的整合与切除的整合与切除1、实现机制：、实现机制：均是通过均是通过-细菌细菌DNADNA和和DNADNA上特定位点之间的重组上特定位点之间的重组2、特

14、定位点、特定位点-附着位点（附着位点（attachment site att） E.coli attB 含含BOB三序列三序列 23bp phage attP 含含 POP三序列三序列 240bp 核心序列核心序列 “ “O”完全一致完全一致 （同源部分）（同源部分） -位点特异性重组发生的地方位点特异性重组发生的地方 B,B,P,P-臂臂3、整合过程、整合过程 整合后的附着位点为整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB） 整合位点整合位点-attB、attP 切除位点切除位点-attL、attR 整合过程需要整合过程需要整合酶整合酶 （integrase Int）（）（编码编

15、码） 和和寄主的整合宿主因子寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用共同作用溶源性细菌溶源性细菌(lysogen)溶菌周期溶菌周期（lysis）原噬菌体原噬菌体4、整合分子机制、整合分子机制 核心序列核心序列O全长全长15bp，富含，富含A-T 发生在发生在O内的重组交换位点相距内的重组交换位点相距 7bp 整合酶的结合位点：整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同两者的作用不同) attP位点的负超螺旋为重组所必须位点的负超螺旋为重组所必须-加强了加强了Int和和IHF的亲和的亲和力力 -高剂量的蛋白维持单链重组

16、所必需的结构高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合结合 -核心序列的反向位点（切割位置）核心序列的反向位点（切割位置） -结合在结合在att臂上（臂与核心区靠近）臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis 整合体及其作用整合体及其作用 整合体（整合体（intasome）- Int和和IHF结合到结合到attP时的复合物时的复合物 整合体捕获整合体捕获attB 说明说明- a、attB和和attP的的最初识别靠最初识别靠Int 识别两序列的能力识别两序列的能力 b、两序列的同源性两序列的同源性在链交换时为在链交换时为 重要因素重要因素 Int蛋白能蛋白能切断切断DNA，并使它重新，并使它

17、重新连接连接，近而使，近而使holliday结构结构拆分拆分 重组时重组时attP和和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交5、整合与切除的控制、整合与切除的控制（1） 整合整合 C-促使阻遏蛋白促使阻遏蛋白C的产生的产生 -与与int gene 的的PI结合，转录产生结合，转录产生Int蛋白蛋白 -且且PI位于位于xis基因内，基因内，C与与PI结合导致结合导致xis gene失活失活（2） 切除切除 寄主寄主SOS反应时反应时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白大量产生，促使阻遏蛋白C的水解的水解 -把把OL和和OR从阻遏状态释放出来从阻遏状态释放

18、出来 -从从PL转录使转录使int和和xis表达表达四、四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换依赖于同源重组的位点特异性的序列代换 -酵母酵母MAT序列的转换序列的转换1、 酵母结合型的转变酵母结合型的转变-DNA序列的代换，而不是互换序列的代换，而不是互换 -依赖于序列的同源性依赖于序列的同源性 （被代换的序列命运是被降解调（被代换的序列命运是被降解调-突变试验）突变试验）2、 同源序列同源序列 匣子匣子 W X Y Z1 Z2 total HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 23

19、9 88 2369 HMRa 704 642 239 88 15853、 转换过程转换过程 内切酶内切酶(HO)识别、切割识别、切割-Y/Z1交界处交界处-起始起始MAT序列的转序列的转换换 (双链断裂双链断裂) HM匣子受匣子受Sir阻遏蛋白的保护阻遏蛋白的保护 Y区域被降解，直到区域被降解，直到Y和和Ya相同的部分或一直到相同的部分或一直到X区域区域 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对 以供体以供体DNA为模板复制为模板复制Y区域，区域，holliday结构形成结构形成 Holliday结构的拆分，产生新的结构的拆分，产生新的M

20、AT匣子和这次转换中的供体匣子匣子和这次转换中的供体匣子4、 特征特征-同源重组和位点特异性重组特征都具有同源重组和位点特异性重组特征都具有 需要大范围的同源序列需要大范围的同源序列 需要重组酶系（需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的基因产物、位点特异性的HO内切酶）内切酶）第三节第三节 细菌中的转座成分细菌中的转座成分一、转座成分概述一、转座成分概述1、转座子转座子(元元)或转座元件或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直片段，它们可以直

21、接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展、发现和发展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米果皮、糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 跳跃基因（跳跃基因（jumping gene） 1947 冷泉港实验室（美）冷泉港实验室（美） Barbara McClintock 基因转座现象的再次发现与证实基因转座现象

22、的再次发现与证实 在一个操纵子中，在一个操纵子中， 与操纵基因毗连的结构基因发生终止与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。 插入型极性突变的发现与机理插入型极性突变的发现与机理Operon & Polarity Mutation 极性突变的基本概念极性突变的基本概念A酶活性酶活性 O gene Z 基因终止突变位基因终止突变位 点离点离O基因的距离基因的距离 I p o Z Y Aa) 不依赖不依赖供体

23、序列供体序列与靶位点间序列的同源性与靶位点间序列的同源性b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制转座不是简单的转移，涉及转座子的复制HotspotsHotspots (热点热点)Regional preferenceRegional preference ( 在在3kb区域内的随机插入区域内的随机插入) d) 某些转座因子（某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）（免疫性）e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应

24、3、转座重组的特点、转座重组的特点c) 转座插入的靶位点并非完全随机转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）（插入专一型）二、二、Prok.转座子种类转座子种类 两种类型：两种类型： 简单转座子（简单转座子（simple transposon） （插入序列（插入序列 insertion sequence IS ） 复合转座子（复合转座子（composite transposon） 共同特征：共同特征： a）两端有）两端有2040bp的的IR b）具有编码转座酶（）具有编码转座酶（transposase）的基因）的基因1、插入序列、插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分最简

25、单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名：命名： IS编号（鉴定类型）编号（鉴定类型） 长度长度 7002000bp 特点：特点： a）两端）两端IR为转座酶的识别位点（突变）为转座酶的识别位点（突变） b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp） IS 可以正反方向插入到可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），（宿主、质粒或某些噬菌体）， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a)a) Tn / TnA Tn / TnA family family l 具有具有IR、转座酶基因、转

26、座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因调节基因（解离酶）、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶转座酶 regulator - 内酰胺酶内酰胺酶 2、复合转座子、复合转座子 两种类型两种类型 b）两端重复序列为两端重复序列为IS的复合转座子的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两

27、端，可能形成复合转座因子插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂臂 中心区中心区 臂臂transposition 当两个当两个IS组件相组件相同时，其中任一个都同时，其中任一个都可行使转座功能可行使转座功能 不同时，主要依不同时，主要依靠一个靠一个 两侧的两侧的IS既可以是既可以是IR，又可以是，又可以是DR状态状态（IR多）多）3 转座噬菌体转座噬菌体 MuMu phage phage （巨型转座子（巨型转座子 ） C repressor for A, Brepressor for A, BB 33 kd 与转座有关与转座有关A 70 kd 转座酶转座酶U

28、, S 毒性蛋白毒性蛋白attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶区倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位区倒位区 38kbPgin 以以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解） Mu的插入途径的插入途径a） 侵入的侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主在溶源化过程中任意插入寄主DNA （两侧各（两侧各5bp的靶位点序列重复）的靶位点序列重复）b） 进入进入裂解生长后，复制产生后代裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主几乎全部插入寄主 D

29、NA中，并可继续转座（形成寄主中，并可继续转座（形成寄主DNA和和Mu的共合体），噬的共合体），噬 菌体成熟时，切段共合体包装菌体成熟时，切段共合体包装三、转座子的转作机制及模式三、转座子的转作机制及模式 三种类型：复制型、非复制型和保守型三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式、复制型转座模式 实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝（供、受点）扩增了转座子的拷贝（供、受点） 需两种酶：需两种酶： 转作酶（作用于原拷贝两末端）转作酶（作用于原拷贝两末端） 解离酶（作用于复制后的拷贝）解离酶（作

30、用于复制后的拷贝） 模式：模式： 两大步两大步 a) 共合体形成共合体形成 切口连接复制切口连接复制 b) 拆分拆分 靶位点的靶位点的DR形成形成2、非复制型转座模式、非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有供体位点如不能被修复则有致致 死效应死效应3、保守型转座模式、保守型转座模式 另一种非复制型另一种非复制型 与与整合机制相似整合机制相似 其转座酶与其转座酶与整合酶家整合酶家 族有关族有关4、TnA转座模式转座模式 复制型转座复制型转座 转座酶转座酶(tnpA)、 解离酶解离酶(tnpR) 解离酶需要特异的内解离酶需要特异的内 部位点部位点

31、双重功能：解离功能双重功能：解离功能 tnpA及自身的阻遏物及自身的阻遏物 拆分位点拆分位点 res 共合体拆分位点共合体拆分位点 转座结果产生转座结果产生5bp 的正向重复序列的正向重复序列 四、转座子转座频率的调控四、转座子转座频率的调控 每个转座子控制自身转座的核心每个转座子控制自身转座的核心-控制转座酶的水平控制转座酶的水平 不到一个转座酶分子世代细胞不到一个转座酶分子世代细胞1、Tn10转座机制转座机制 Tn10为复合型转座子为复合型转座子 IS10R元件提供转座酶活性元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列合成转座酶的序列 自发转座频率自发转座频率-107 Tn10转座酶水平是控制转座的关键转座酶水平是控制转座的关键 有两种控制转座的方式有两种控制转座的方式 a） 通过反义通过反义RNA的翻译水平控制的翻译水平控制 IS10R外侧边缘两个启动子外侧边缘两个启动子 PIN控制控制IS10R的转录的转录 弱启动子弱启动子 POUT强启动子强启动子 右向转录宿主右向转录宿主DNA INRNA和和OUTRNA 有有36bp的重叠的重叠 稳定性：稳定性： OUTRNAINRNA 大量大量OUTRNA作为作为 INRNA的反义的反义RNA b） 甲基化作用控制转座酶合成及其与甲基化作