实验十二 血清肌酸激酶测定与应用

1、实验十二实验十二 血清肌酸激酶测定与应用血清肌酸激酶测定与应用1 1 实验目的实验目的 了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。 掌握其测定的应用与意义。掌握其测定的应用与意义。2 2 实验原理实验原理肌酸激酶（肌酸激酶（Creatine phosphokinaseCreatine phosphokinase，简称，简称CKCK）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，肝脏和红广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，肝脏和红细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富，占全身细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富，占全身总量的总量的96%96%之多。之多。肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要，它催化下

2、列肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要，它催化下列反应：反应：上述反应保证肌肉收缩时的能量供应和运动后上述反应保证肌肉收缩时的能量供应和运动后ATPATP和肌酸磷和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌细胞透过细胞膜进入血液的结果，其活力很小。正常心肌细胞透过细胞膜进入血液的结果，其活力很小。正常值每升血液中值每升血液中100100活力单位以下。活力单位以下。运动训练能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般认为运动训练能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般认为运动时缺氧运动时缺氧, , 代谢产物积累，供能相对不足等原因，引起代谢产

3、物积累，供能相对不足等原因，引起肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤，促使肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤，促使CKCK从细从细胞内释放增加，进入血液循环，其中以肌肉牵拉的机械性胞内释放增加，进入血液循环，其中以肌肉牵拉的机械性损伤或产生血肿等原因最为重要。损伤或产生血肿等原因最为重要。 滑雪运动和马拉松赛跑后，血清滑雪运动和马拉松赛跑后，血清CKCK的活性较高，特别是大的活性较高，特别是大强度的马拉松赛跑最高。在运动后强度的马拉松赛跑最高。在运动后4 4小时升高，小时升高，8-168-16小时小时达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动，冲击性运动，达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动，

4、冲击性运动，也易引起也易引起CKCK活性升高。大运动量的训练和活性升高。大运动量的训练和100m100m、200m200m跑比跑比赛后，血清中赛后，血清中CKCK活性都显著升高，尤其是在比赛时，升高活性都显著升高，尤其是在比赛时，升高更为显著。更为显著。应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时，一般认为应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时，一般认为2-32-3天取血天取血测定一次测定一次, , 在负荷后经常处于在负荷后经常处于100-200100-200国际活力单位国际活力单位/L/L。如果超过如果超过200200IU/LIU/L，就是运动量过大，身体尚未恢复，此，就是运动量过大，身体尚未恢复，此时应调整运动

5、量。时应调整运动量。3 3 实验器材与试剂实验器材与试剂 器材器材 器材器材 试管、分光光度计、分析天平、采血试管、分光光度计、分析天平、采血装置（注射器）、水浴箱、离心机装置（注射器）、水浴箱、离心机 试剂试剂 混合底物混合底物pH 7.4 pH 7.4 三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷- -盐酸缓冲液：称取三羟甲基氨基盐酸缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（甲烷（TrisTris）2.4g2.4g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100 ml100 ml，再加入，再加入0.2 N0.2 N盐酸盐酸88.8 ml88.8 ml及无水硫酸镁及无水硫酸镁0.34g0.34g，调节，调节pHpH至至7.47.4。

6、此液在室温下。此液在室温下可保存数月。可保存数月。0.012 M0.012 M磷酸肌酸溶液：称取磷酸肌酸钠（磷酸肌酸溶液：称取磷酸肌酸钠（C C4 4H H8 8O O5 5- -O O4 4PNaPNa3 36H6H2 2O O）4 436 mg36 mg，加蒸馏水至，加蒸馏水至100 ml100 ml，调节，调节PHPH至至7.47.4，保存于保存于-25-25或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。0.001 M ADP0.001 M ADP溶液：称取溶液：称取ADPADP钠盐钠盐0.233g0.233g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100 ml100 ml

7、，调节调节PHPH至至7.47.4，保存于，保存于-25-25或冰箱上层冰盒中，可用一个月或冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。左右。临用前，取上述（临用前，取上述（1 1）（）（2 2）（）（3 3）试剂各）试剂各10 ml10 ml混合。混合。在此混合底物液在此混合底物液30 ml30 ml中，加入盐酸半胱氨酸中，加入盐酸半胱氨酸0.105g0.105g，调节，调节PHPH至至7.47.4。此试剂最好新鲜配制，也可以保存于冰盒中。一般可放。此试剂最好新鲜配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-75-7天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产

8、生，即不能再用。 0.3 N 0.3 N 氢氧化钡溶液氢氧化钡溶液 称取氢氧化钡（称取氢氧化钡（Ba(OH)Ba(OH)2 28H8H2 2O O）4.73g4.73g，加蒸馏水使之溶解，加蒸馏水使之溶解（可加热助溶），并稀释到（可加热助溶），并稀释到100 ml100 ml。 5% 5% 硫酸锌溶液硫酸锌溶液称取硫酸锌（称取硫酸锌（ZnSOZnSO4 47H7H2 2O O）8.82g8.82g，加蒸馏水溶解，并稀释到，加蒸馏水溶解，并稀释到100 100 mlml。上述上述2 2、3 3两种溶液配好后，需进行滴定，即吸取两种溶液配好后，需进行滴定，即吸取5%5%硫酸锌溶液硫酸锌溶液5 5

9、mlml，放入，放入50 ml50 ml三角烧瓶中，加入酚酞指示剂三角烧瓶中，加入酚酞指示剂2 2滴，用滴，用0.3 N 0.3 N Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液滴定至出现粉红色溶液滴定至出现粉红色3030秒钟不褪色为止。秒钟不褪色为止。 Ba(OH)Ba(OH)2 2用量用量与与ZnSOZnSO4 4相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。标准肌酸溶液（标准肌酸溶液（1.71.7MM/ml/ml） 准确称取无水肌酸准确称取无水肌酸22.3mg22.3mg，置于，置于100ml100ml容量瓶中，加蒸容量瓶中，加蒸馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保存，可用

10、数日。馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保存，可用数日。双乙酰液双乙酰液 先配成先配成1%1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。临用时用蒸馏溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。临用时用蒸馏水稀释水稀释2020倍。倍。贮存碱溶液贮存碱溶液 称取称取30g 30g NaOHNaOH，无水碳酸钠（，无水碳酸钠（Na2CO3Na2CO3）64g64g，加蒸馏水，加蒸馏水使溶解并稀释至使溶解并稀释至500 ml500 ml，室温低时可析出沉淀，此时应放，室温低时可析出沉淀，此时应放于于3737水浴中待沉淀溶解后再使用。水浴中待沉淀溶解后再使用。-萘酚溶液萘酚溶液 称取称取-萘酚萘酚1g1g，用上述贮存碱液使溶解，并

11、稀释到，用上述贮存碱液使溶解，并稀释到100 ml100 ml，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。4 4 实验方法与步骤实验方法与步骤肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法。肌酸磷酸激酶显色法。测定测定CKCK活性原理：利用上述反应所生成的肌酸与活性原理：利用上述反应所生成的肌酸与-萘酚萘酚和双乙酸反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色深和双乙酸反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌酸含量成正比，与同样处理的肌酸标准液比色，求浅与肌酸含量成正比，与同样处理的肌酸标准液比色，求得酶的活力。得酶的活力。加入物（加入

12、物（mlml）空白管空白管标准管标准管测定管测定管混合底物混合底物0.750.750.750.750.750.75血清血清0.10.1标准肌酸标准肌酸（1.7M/ml1.7M/ml）0.10.1蒸馏水蒸馏水0.10.1 置置3737水浴保温水浴保温30 min 30 min Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液溶液0.50.50.50.50.50.5ZnSOZnSO4 4溶液溶液0.50.50.50.50.50.5蒸馏水蒸馏水0.50.50.50.50.50.5 混匀，离心混匀，离心5-10 min 5-10 min 测定操作步骤（如下表测定操作步骤（如下表3-143-14）：）： 表表3-14

13、 3-14 单位：单位： mlml上清液上清液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5-萘酚溶液萘酚溶液1.1.1 11.1.1 11.1.1 1双乙酰液双乙酰液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5置置3737水浴保温水浴保温15 min 15 min 蒸馏水蒸馏水1.1.3 31.1.3 31.1.3 3离心离心35min35min， 520nm520nm波长处进行比色波长处进行比色 读取各管的光密度读取各管的光密度 计算： 肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：肌酸磷酸激酶检测试剂盒法： 原理原理ATP+ATP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+

14、ADP +ADP 为作用酶为作用酶葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+NADP+NADP+ + 6- 6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖+NADPH+H+NADPH+H+ + 为作用酶为作用酶 器材与试剂：试管、可见光分光光度计、电子分析天器材与试剂：试管、可见光分光光度计、电子分析天平、采血装置（注射器）、水浴锅、离心机、试剂盒测平、采血装置（注射器）、水浴锅、离心机、试剂盒测定法。定法。 如：采用中生北控生物科技股份有限公司生产的肌酸磷如：采用中生北控生物科技股份有限公司生产的肌酸磷酸激酶检测试剂盒，该试剂盒适用于全自动，半自动生酸激酶检测试剂盒，该试剂盒适用于全自动，半自动生化分析仪及分光光度计

15、测定人血清中化分析仪及分光光度计测定人血清中CKCK的酶活浓度。的酶活浓度。基本参数：波长：基本参数：波长：340 nm340 nm，温度：，温度：25,30,3725,30,37，比，比色杯光径：色杯光径：1cm1cm。试剂试剂主要成分主要成分实验浓度实验浓度R1 R1 己糖激酶己糖激酶(HK)(HK)3000 U/L3000 U/L葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶( G6PDH)( G6PDH)2000 U/L2000 U/LADPADP2 mmol/L2 mmol/LAMPAMP5 mmol/L5 mmol/LAp5AAp5A10 mol/L10 mol/LNADPNADP2

16、mmol/L2 mmol/LNACNAC20 mmol/L20 mmol/L磷酸肌酸磷酸肌酸30 mmol/L30 mmol/LR2R2咪唑缓冲液咪唑缓冲液(pH 6.7(pH 6.7，25)25)100mmol/L100mmol/L葡萄糖葡萄糖20mmol/L20mmol/L原装试剂杂原装试剂杂2-8避光保存，有效期避光保存，有效期12个月。复溶后在个月。复溶后在2-8可稳定可稳定7天，在天，在15-25可稳定可稳定12小时。小时。试剂盒主要成分与浓度，见表试剂盒主要成分与浓度，见表3-153-15： 表表3-15 3-15 肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度加

17、入物（加入物（mlml）空白管空白管样品管样品管工作液工作液2.502.500.500.50蒸馏水蒸馏水2.502.50样品样品0.500.50混合均匀，在混合均匀，在3737温育温育2 2分钟后，读取初始吸光度，然后在精分钟后，读取初始吸光度，然后在精确确1 1分钟，分钟，2 2分钟，分钟，3 3分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化吸光度变化A A。表表3-16 3-16 肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作 操作步骤：取一定量操作步骤：取一定量R2R2（参看（参看R1R1瓶签）复溶瓶签）复溶1 1瓶瓶R1R1，溶解后即为工作

18、液。工作液预先保温至测试温度。溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。 计算：计算： CKCK（U/LU/L）= =（A A样品样品/ /分分AA空白空白/ /分）分）F F F=(Vt/Vs F=(Vt/Vs消光系数消光系数) ) 1000=80951000=8095（3737） Vt=Vt=反应总体积反应总体积 Vs=Vs=样品体积样品体积 NADPHNADPH在在340 nm340 nm波长下毫克分子消光系数波长下毫克分子消光系数=6.3=6.3 参考值：男：参考值：男：24-195 U/L24-195 U/L；女：；女：24-170 U/L24-170 U/L 线性上限：线性上限：CKCK活力可达活力可达1500U/L1500U/L（3737） 注意事项：当注意事项：当A/A/分大于分大于0.03600.0360（F=4127F=4127），），0.01900.0190（F=8095F=8095）时，样品用生理盐水稀释后重新测定，）时，样品用生理盐水稀释后重新测定， 结果结果乘以稀释倍数；试剂空白吸光度大于乘以稀释倍数；试剂空白吸光度大于0.60.6时时, ,勿用；血清勿用；血清CKCK不稳定，样品收集后要尽快分析，在室温不稳定，样品收集后要尽快分析，在室温4