多粘芽抱杆菌铜绿假单胞菌的培养及菌体浓度测定

1、多粘芽抱杆菌铜绿假单胞菌的培养及菌体浓度测定R多粘芽砲杆菌、铜绿假单胞菌均购自武汉大学菌种保藏中心.液体培养基成分：牛園膏30g,蛋白豚5,0g,氛化钠5.0g,蒸馆水lOOOmbpH7.0a固体培养基成分：牛肉膏3.0g,蛋白陈5.0g氯化钠5.0g,琼脂20.0帥蒸tS水IOOOml,pH7.0.32配制液体培养基和固体培养基的方法取一定容量的烧杯盛入宦量无繭水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解.难溶的物质例如蛋白牒.牛肉膏等可加热促进番解，待全部溶解后，加水补足加热蒸发的水量.配制固体培养基时，需在80V90V时加热融化琼脂，融化过程中烫不断搅拌，避免琼脂嘴底烧焦.33菌种

2、培养实验仪器：净化工作台，生化培养箱，培养皿.试管.移液管。实验药品；牛肉肯.蛋白味，氯化钠，琼脂.实验过程与方法：配置液体培养基.并将pH值调至7,0,将装有60ml液体培养基的200ml三角轧装有iOOmt蒸18水的璇璃杯及tml務液管一并放入压力慕汽消秦器内在121贮下灭20min*在净化工作台中，用无菌蒸懾水溶解菌体粉耒，并用移液管移入三角瓶中.三角瓶放置于双层空气恒温撮荡器（摇床）中培养三天.摇床转®A120r/min,培养温度为32C.3.4菌体浓度测定的方法平板菌落计数法平板菌落计数法的基本原理当一定浓度的茵液稀释到足够大的倍数时，溶液中的茵种以单个游离状态存在。将菌种

3、以单个游离状态存在的菌液在曙养基培养长出葡落，可以认为每一个菌落是由一个菌种生长而成，因此计策固体培养基中的菌落数便是蔺种数平板菌落计数法的实验方法（1）稀释水样将1瓶90ml和8试管9ml无菌水排列好，按10“、10*10*10*、10101010IO"9依次编号.在无葡操作条件下，用10ml无菌移液管吸取10ml菌种培养液，置于90ml无菌水中，手摇lOmin将样品混匀.这就是IO'1浓度的样品.用1ml无菌移液管吸双lml10*'浓度的样品于一试管9ml无菌水中，将移液管吸吹三次，摇匀，得IO"浓度样品.同样方法，依次稀释到10*（2）计数在无菌条件下

4、，用无菌移液管吸取三个适宜浓度的稀释液lml加入无菌培养皿（每个浓度取三个样）.倾入约15ml已灭菌并冷却到约45*0的营养琼脂培养基（未凝固的固体培养基），平放于桌面迅速轻轻摇动培养皿，使样品与培养基充分混匀.冷凝后成平板.平板倒置于37C恒温培养箱内培养24h,计算菌落数卩叽（3）凿落计数及报吿方法用肉眼观察，计算平板上的菊落数，也可用放大镜和菌落计数器计数.记下同一浓度的三个平板的菌落总数，计算平均值.然后乘以稀释倍数.即得lml水样中的微生物总数.各种不同情况的计算方法如下：（一）首先选择平均菌落数在30300之间进厅计算，当只有一个稀释度的平均茵落符合此范围时，则平均该条件下菌落数，

5、并乘以其稀释倍数.（例I）表31稀释度选择及菌落总数报吿例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落之比葡落总数报告方式10110*210-111365164201640016000或l6Xl(/227602951561.892950030000或3.0X10432890271604.518710087000或8.7XI044无法计算165051351300051000或5.1XI04527115270270或2.7XI026无法计算305123050031000或31“0°（二）若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，且两者菌落总数之比大于2,则取两者之平均数，若小亍2,则取其中

6、较少的菌落总数。（例2和例3）（三）若所有稀释度的平均数均大于300,则取稀释度量髙的平均菌落数乘以稀释倍数为报吿结果。（例4）（四）若所有稀释度的平均菌落数均少于30,则取稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数为报告结果.（例5）（五）若所有稀释度的平均数都不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以廉释倍数为报告结果。（例6）（六）在求相同稀释度的平均菌落数时，若其中一个平板上有极大片菌落生长时，则不宜采用，而应以无线状菌落生长的平板计算该稀释度的平均菌落数.若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则按该半边平板上的菌落数计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。（

7、七）报告菌落计数结果时，菌落数在100以内按实际数报告，大于100时，取两位有效数字，而两位有效数字后的位数，以四舍五入法计算。为了缩短数字后面的零数，可用10为底数的指数来表示报告菌落数为“无法计算”时，应注明水样的稀释倍数卩叽平板菌落计算的实验结果P.多粘芽袍杆菌的平板菌.铜绿假单胞菌的平板菌落计算结果如表32、表33表32P.多粘芽抱杆菌的平板菌落计算结果不同稀释度的菌落数10-710*8io"卅平板无法计算373132冷平板无法计算29473#平板无法计算2694平均菌落数无法计算3128从表中可看出，P.多粘芽抱杆菌所有稀释度的平均数都不在30300之间，则应以最接近300

8、或30的平均菌落数乘以稀释倍数，所以此时P.多芽砲杆菌的菌体浓度为31200000000报吿方式为3.1X1O10个/ml。表33洞绿假单胞菌的平板歯落计算结果不同稀释度的菌落数10*7104109卅平板376127422#平板348103283#平板30511529平均菌落数34311533从表中可看出，铜绿假单胞苗有两个稀释度的平均葯数均在30300之间，且两者之比大于2,所以取二者之平均数.铜绿假单胞曲的菌体浓度为(115OOOOOOOO+33OOOOOOOOO)/2,报告方式为2.2X10'°。光电比浊计数法平板菌落计数法可粗略测算岀菌体浓度，但其过程太过繁顼，若每次

9、均用此法.则显然很浪费时间，可用光电比浊计数法来计算】.原理当光通过微生物菌悬液时，由于细胞的散射及吸收作用使光的透光率降低。在一定范围内，细胞数与光密度成正比，而光密度或透光率可以由分光光度计精确测定。因此，可用一系列己知细胞数的细胞悬浮液测定光密度，制作光密度一一细胞数标准曲线，然后，测得样品液的光密度，从标准曲线中读出对应的细胞数。制作标准曲线时，细胞计数采用平板菌落计数。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制，对于不同微生物细胞悬浮液进行光电比浊计数时，应采用相同菌株与培养条件得到的细胞制作标准曲线。光波波长通常选择在400800nm之间，不同的悬浮液其光波波长

10、的选择应不同阿。歯体浓度与菌体的吸光度并不是在任何波长下祁成严格的线性关系，因此需要找出最佳波长，在此波长下，菌体的吸光度与菌体浓度成严格的线性关系.3432实验方法与过程实验仪器：培养皿，721分光光度计.实验药品：牛肉膏，蛋白月东，氯化钠，琼脂。操作步骤：（分别以茵体浓度为2.2xlO,0个/ml,3.1xio,0个/ml的银绿假单胞菌，P.多粘芽抱杆菌制作光密度一细胞数标准曲线）編号：取无菌试管，标为1#、2第、3#、4#、5#、6#、7# 调整细胞悬浮液浓度：铜绿假单胞菌苗体浓度分别调整为l°个/ml,0.1x2.2x10“个/ml,0.34.2"屮个/ml,O.4

11、*2.2xlO,0b/rnl,0.6x2.2x10*°个/ml,0.8*2.2*10'°个/ml,2.2*1O10个/ml,P.多粘芽TS杆菌菌体浓度分别调整为10个10个/ml,】。个10个/ml,0Jx3.lxio10个,0个10个/ml然后注入已编号的无菌试管中. 测光密度值：将4ml无菌生理盐水注入比色皿中作为参照物，分别在波长为500nm,600nm,700nm,760nm时测定不同菌体浓度时铜绿假单胞菌，P.多粘芽他杆菌的吸光度. 分别作出500nm,600nm700nm,760nm时铜绿假单胞菌，P.多粘芽袍杆菌的吸光度菌体浓度曲线.实验结果不同波长下

12、铜绿假单胞茵、P多粘芽也杆菌的吸光度菌体浓度关系如图31、图3-2.500nm600nnI700rm1W1假单ffeiWBWMS10&I<760nm图3不同波长下铜绿假瑕胞菊的吸光度一菌体浓度图从图中可知.波长为500nm时，直线方程为y=1.0038x+0.0194相关系数2=0.9963波长为600nm时，直线方程为y=0.7494x+0.0074相关系数R2=0.9989波长为700nm时，直线方程为y=0.6145x0.007相关系数"=0.997波长为760nm时，直线方程为y=0.5517x-0.0094相关系数RZ.9948波长为600nm时，相关系数R?最大，因此此时直线相关性最好.选波长为600nm时的直线方程为严0.7494X+0.0074为铜绿假单胞菌的吸光度一一菌体浓度图（注：y一吸光度；x-菌体浓度）P.多牯些杆曲体朋度(xiixiO10)图32不同波长下P.多粘芽他杆菌的吸光度菌体浓度图从图中可知，波长为500nm时，直线方程为y-1.6429x+0.0748相关系数R2=0.9885波长为600nm时，宜线方程为y=1.2535x+0.064