实验-两对半的检测

1、 ELISAELISA检测检测“乙肝二对半乙肝二对半” (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA) 酶酶免免疫疫技技术术分分类类 酶免疫组化酶免疫组化 酶免疫测定酶免疫测定 固固相相酶酶免免疫疫测测定定 液液相相酶酶免免疫疫测测定定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定ELISAELISA的概念的概念酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assayenzyme-linked immunosorbent assay，ELISAELISA）酶联酶联：抗原或抗体的酶标记。：抗原或抗体的

2、酶标记。免疫免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。：以抗原抗体特异性反应为基础。吸附吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。：抗原或抗体包被于固相载体表面。 在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。抗原或抗体的量直接相关。ELISAELISA技术特点技术特点 具有良好的具有良好的灵敏度灵敏度和和特异性特异性，能满足临床，能满足临床需要，应用广泛。需要，应用广泛。 操作操作简

3、单简单、无需昂贵的仪器投入，价格、无需昂贵的仪器投入，价格便便宜宜。 对环境几乎对环境几乎没有污染没有污染。ELISAELISA技术的应用技术的应用 检测抗原抗原的方法： 双抗体夹心法 竞争法 检测抗体抗体的方法： 双抗原夹心法 间接法 竞争法 捕获法实验目的实验目的 掌握掌握ELISAELISA法检测法检测“乙肝二对半乙肝二对半” 的的原理、原理、操作步骤及注意事项。操作步骤及注意事项。 掌握检测掌握检测“乙肝乙肝二对半二对半”的临床意义。的临床意义。 什么是什么是“乙肝二对半乙肝二对半”？“乙肝两对半乙肝两对半”是指：是指：表面抗原（表面抗原（HBsAgHBsAg）、）、表面抗体（表面抗体

4、（HBsAbHBsAb）、）、e e抗原（抗原（ HBeAg HBeAg ）、）、e e抗体抗体（HBeAbHBeAb）、核心抗体（）、核心抗体（HBcAbHBcAb） HBsAgHBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性本身不具有传染性，只具有抗原性 保护性抗体：保护性抗体： HBsAbHBsAb 传染性指标：传染性指标： HBeAg HBeAg ， HBcAgHBcAg HBeAbHBeAb， HBcAbHBcAb不是保护性抗体，而是反映不是保护性抗体，而是反映曾被曾被HBVHBV感染的重要指标。感染的重要指标。为什么不检测核心抗原（HBcAg） HBcAgHBcAg主要位于病毒颗粒中，只有

5、少数游离。主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 机体免疫系统对机体免疫系统对HBcAgHBcAg很敏感，易产生高滴度的很敏感，易产生高滴度的HBcAb,HBcAb,与与HBcAgHBcAg 形成免疫复合物。形成免疫复合物。 血清中，血清中， HBcAgHBcAg可丢失部分氨基酸。可丢失部分氨基酸。“乙肝二对半乙肝二对半”的检测原理的检测原理 HBsAgHBsAg：双抗体夹心法双抗体夹心法 HBsAbHBsAb：双抗原夹心法双抗原夹心法 HBeAgHBeAg：双抗体夹心法双抗体夹心法 HBeAbHBeAb：中和竞争法中和竞争法（血清中的（血清中的e e抗体与固相抗体与固相e e抗体竞争结合抗体竞争

6、结合e e抗原）抗原） HBcAbHBcAb：竞争抑制法竞争抑制法双抗原（体）夹心法测抗体（原）包被抗原包被抗原酶标抗原酶标抗原待测抗体待测抗体包被抗体包被抗体酶标抗体酶标抗体待测抗原待测抗原Anti-HIV, Anti-HBs双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争抑制法测抗体 包被抗原包被抗原待测抗体待测抗体*酶标酶标抗体抗体 Anti-HBcAnti-HBe中和竞争法测抗体包被抗体包被抗体中和抗

7、原中和抗原待测抗体待测抗体酶标抗体酶标抗体Anti-HBe试剂盒组成 包被反应板：固相的抗原或抗体包被反应板：固相的抗原或抗体 酶结合物：酶标记的抗原或抗体酶结合物：酶标记的抗原或抗体 显色剂：分显色剂：分A A、B B二瓶二瓶 终止液终止液 对照：阳性对照，阴性对照对照：阳性对照，阴性对照 浓缩浓缩洗涤液洗涤液 中和试剂（中和试剂（只有检测只有检测HBeAbHBeAb的试剂盒才有的试剂盒才有）实验准备 配制洗涤液：用蒸馏水按配制洗涤液：用蒸馏水按1 1：2020稀释浓缩洗稀释浓缩洗涤液。涤液。 为节省试验时间，除检测为节省试验时间，除检测核心抗体（核心抗体（HBcAbHBcAb）组外，其余组

8、可在加样后的温育时间中才配组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。制洗涤液。实验操作实验操作1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照照50ul50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul50ul（检检测测HBcAb HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1 1：3030稀稀释释）。）。2 2、加中和试剂（、加中和试剂（只有检测只有检测HBeAbHBeAb时才需要时才需要）：每孔）：每孔50ul50ul3 3、加酶结合物：每孔、加酶结合物：每孔50u

9、l50ul4 4、温育：封板、温育：封板充分混匀后置充分混匀后置3737C C水浴水浴3030分钟分钟5 5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡或振荡1 1分钟，弃去拍干分钟，弃去拍干反复反复5 5次（次（注意：最后一次一注意：最后一次一定要拍干定要拍干）6 6、显色：每孔先加显色剂、显色：每孔先加显色剂A 50ulA 50ul，再加显色剂，再加显色剂B 50ulB 50ul，混，混匀后置匀后置3737C C水浴水浴1010分钟分钟7 7、中止显色：每孔加入中止液、中止显色：每孔加入中止液50ul50ul8 8、判断结果：、

10、判断结果：目测法目测法：反应孔反应孔颜色颜色结果结果阴性对照阴性对照透明无色透明无色阴性阴性阳性对照阳性对照黄色黄色阳性阳性样品样品黄色黄色？样品样品浅黄色浅黄色？样品样品透明无色透明无色？HBsAg， HBsAb， HBeAg HBeAb ， HBcAb反应孔反应孔颜色颜色结果结果阴性对照阴性对照黄色黄色阴性阴性阳性对照阳性对照透明无色透明无色阳性阳性样品样品黄色黄色？样品样品浅黄色浅黄色？样品样品透明无色透明无色？比色法：波长比色法：波长450nm450nm读取各孔读取各孔ODOD值值HBsAgHBsAg， HBsAbHBsAb， HBeAg HBeAg 样品样品ODOD值值/ /阴性对照

11、阴性对照ODOD值值2.1 2.1 HBeAb HBeAb ， HBcAbHBcAb阴性对照阴性对照ODOD值值/ /样品样品ODOD值值2.12.1（建议建议双波长双波长比色比色（450/630nm450/630nm）；）；临界值的确定请参考实验指临界值的确定请参考实验指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同）阳性阳性阳性阳性ELISA的注意事项标本标本：内源性（：内源性（RFRF、补体、嗜异性抗体等）、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN

12、NaN3 3等）（等）（P229P229）试剂试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（3737度度C C3030分钟）、摇匀分钟）、摇匀加样加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。温育温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）洗板洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。显色显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生

13、气泡，及时终止。：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。比色比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。结果判定结果判定：反应终止后：反应终止后1010分钟内分钟内质量控制：质量控制：内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识）内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识）表面抗原阳性结果表面抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见模式灰区标本、矛盾结果或少见模式均须复查均须复查生物安全：生物安全：试剂盒应视为有试剂盒应视为有传染性物质传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理，请按传染病实验室检查规程处理。常见的检测模式（临床意义（临床意义2）模式模式 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临床意义临床意义 1+-+-+急肝、慢肝活动期、有传染性急肝、慢肝活动期、有传染性2+-+急肝、慢性急肝、慢性HBsAg携带者携带者 3+-+急性急性HBV感染趋向恢复、感染趋向恢复、 慢性慢性HBsAg携带者、传染性弱携带者、传染性弱 4-+既往感染、急性既往感染、急性HBV