细胞培养相关技术

1、细胞培养相关技术细胞培养相关技术梁洁2006.8.26所需仪器 生物安全柜（无菌操作台） CO2培养箱 CO2气瓶，减压阀 数显水浴锅 液氮罐 常用冰箱，超低温冰箱 显微镜 移液器 灭菌锅 烘箱基础篇基础篇- -无菌操作基本技术无菌操作基本技术 1.1. 实验前，无菌操作台以实验前，无菌操作台以紫外灯紫外灯照射照射30-60 30-60 分分钟灭菌，以钟灭菌，以70%70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启酒精擦拭无菌操作台面，并开启风扇运转风扇运转10 10 分钟后，才开始实验操作。分钟后，才开始实验操作。 2. 2. 无菌操作工作区域应无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞保持清洁及宽敞，实验，实验用

2、品以用品以70 % 70 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。酒精擦拭后才带入无菌操作台内。 3. 3. 小心取用无菌之实验物品，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染避免造成污染。生物安全柜 4.4. 工作人员应工作人员应注意自身之安全注意自身之安全。 5. 5. 定期检测下列项目：定期检测下列项目： 5.1. 5.1. COCO2 2 钢瓶钢瓶之之CO2 CO2 压力压力 5.2. 5.2. COCO2 2 培养箱培养箱之之CO2 CO2 浓度、温度、及水盘是否浓度、温度、及水盘是否有污染有污染( (水盘的水使用无菌水，每周更换水盘的水使用无菌水，每周更换) )。 5.3. 5.3. 无菌操作

3、台无菌操作台内之压力表，定期更换紫外线灯内之压力表，定期更换紫外线灯管及过滤膜，预滤网。管及过滤膜，预滤网。 5.45.4液氮的补充液氮的补充 6. 6. 水浴锅可添加水浴锅可添加消毒剂消毒剂，定期更换水槽的水。，定期更换水槽的水。 7.7.定期定期打扫消毒打扫消毒细胞间（包括缓冲间）细胞间（包括缓冲间）培养细胞需要哪些材料？培养细胞需要哪些材料？基础篇基础篇- -实验用品实验用品 1. 种类种类 1.1. 细胞培养实验用品均为严格无菌1.2. 塑料培养皿和培养瓶表面均有包被高分子物质（多聚赖氨酸，胶原蛋白）以让细胞吸附。 1.3. 移液管: 1ml,1.5 ml,5 ml, 10 ml, 2

4、5 ml 1.4. 塑料离心管:1.5ml, 15 ml, 50 ml 1.5. 塑料培养皿:直径35,60,100 mm1.6. 玻璃培养瓶：25，50，75，100 ml1.7玻璃血清瓶：100，250，500 ml 2.2. 清洗清洗 2.1. 新购玻璃器皿（培养瓶，移液管，血清瓶）先以0.1 N HCl 浸泡数小时，强酸洗液浸泡过夜，自来水清洗20遍后，用双蒸水冲3遍，晾干。2.2. 用过之玻璃器皿去掉残液，清水浸泡，同上清洗。 3. 灭菌灭菌 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121, 20 分钟，置于烘箱中烘干。 3.2. 实验用枪头和离心管装入铝盒，同上灭菌

5、。 3.3. 移液管尾部塞好棉花，装入金属筒，同上灭菌3.4移液枪等固体样品可紫外线照射基础篇基础篇- -培养基培养基 1. 储存储存：液体培养基贮存于4 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 水槽中温热。液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解。 2. 培养基配制培养基配制(DMEM或RPMI1640粉末，以1 升为例)：2.1. 材料材料： 纯水，粉末培养基 ，NaHCO3 ，1L烧杯，1L量筒，电磁搅拌器, 无菌血清瓶 ，无菌过滤器及0.22 mm无菌过滤膜 ，pH 计，真空泵，灭活胎牛血清（56温浴30min),抗生素（青霉素和链霉素） 2.2配置步骤配置

6、步骤： 2.2.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，充分搅拌1-2小时使其溶解。 2.2.2. 称取适量之NaHCO3 粉末于培养液中，继续搅拌 2.2.3.测搅拌后好的培养液的pH值，pH值应为7.2-7.4，可略加酸碱调节 2.2.4. 以0.22 mm 无菌过滤膜过滤除菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。(灭活后血清和抗生素亦可加入培养基中一起过滤) 2.2.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 基础篇基础篇- -抗生素抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 1

7、.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma（支原体），则培养基内不可添加gentamicin（庆大霉素），因gentamicin 会抑制mycoplasma 生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin

8、250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, myco

9、plasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基础篇基础篇- -血清血清 1. 储存储存：血清必须贮存于20 ，若存放于4，请勿超过一个月。 2. 过滤过滤：一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 解冻解冻：瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分

10、装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 4. 热灭活热灭活：是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。 5. 血清之凝絮物血清之凝絮物 5.1. ：血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。 5.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在

11、显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 如何培养细胞？如何培养细胞？基础篇基础篇- -细胞传代培养细胞传代培养 1. 材料材料： 1.1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS 7.4,无Ca2+,Mg2+) 1.2. 胰酶-EDTA 消化液(0.05% trypsin+0.53mM EDTA-4Na)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于20，使用前放在37 水槽回温。 1.3. 新鲜培养基 1.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 2. 步骤步骤：2.1贴壁细胞贴壁细胞：倾去瓶内培

12、养基，用PBS洗涤1-2次，加胰酶消化液适量，以刚好覆盖细胞为准，消化1-10min，使细胞变圆脱壁，用吸管吸掉消化液，加入少量新鲜培养液，用吹打贴壁细胞打散细胞团块，制成悬液，接种至2-3瓶新培养瓶中。2.2. 悬浮型细胞悬浮型细胞(suspension cell) 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 2.3. 融合瘤融合瘤(hybridoma) 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换

13、培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。 基础篇基础篇- -细胞冷冻保存细胞冷冻保存 （一）（一） 1. 材料材料： 1.1. 生长良好之培养细胞 1.2. 新鲜培养基 1.3. DMSO (Sigma D-2650) 1.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 1.5. 血球计数盘与盖玻片 1.6. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 、冰箱或液氮罐基础篇基础篇- -细胞冷冻保存细胞冷冻保存 （二）（二） 1. 细胞状态细胞状态：欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80 90 致密度，浓度为1

14、6 x 106 cells/ml 。 2. 注意冷冻保护剂冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色，以510 ml 小体积分装，4避光保存。甘油以高压蒸汽灭菌后避光保存。 3. 冷冻保存溶液冷冻保存溶液： 保护剂：血清（或培养液）1：9 4. 冷冻步骤冷冻步骤： 冷冻前一日前更换培养基，观察细胞生长状态 配制冷冻保存溶液收集培养之细胞，计数细胞浓度离心，去除上清液加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial。 5.冻存方法冻存方法: 4 10 分钟- -20 30 分钟- -80 16 - 18

15、 小时(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 长期储存。 程序降温：利用等速降温机以1 -3/分钟之速度由室温降至120，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞、干细胞与hybridoma 之保存。基础篇-细胞冷冻保存 （三）基础篇基础篇- -冷冻细胞复苏（一）冷冻细胞复苏（一） 1. 冷冻细胞之活化原则为冷冻细胞之活化原则为快速解冻快速解冻，以避免冰晶重新结晶，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2. 细胞活化细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢

16、复正常。或特性表现才会恢复正常。 3. 材料材料 37 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管离心管/ 培养瓶，培养瓶，液氮或干冰容器液氮或干冰容器 冷冻细胞复苏（二）冷冻细胞复苏（二） 4.步骤步骤：事先将水浴锅水温调至37-40 - 将冻存管从液氮中取出，注意检查旋口，旋紧或加一层封口膜- 迅速放入温水，用镊子夹住冻存管不断摇晃，观察冻存液是否解冻- 大约2-3分钟后全部融解，取出冻存管- 用75%乙醇清洁管口- 转移至1.5ml 离心管中，1000g, 5min离心去上清收集细胞- 用含血清的培养基洗2次- 加入适量新鲜培养基，于培养皿中培养- 每日观察细胞的

17、生长情况，若死细胞较多，次日应换液。基础篇基础篇- -收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 ( (一一) ) 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2.细胞株冷冻管按细胞复苏方法培养，取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入培养基， 混合均匀，放入37 C，5 % CO2 培养箱培养。 3. 收到培养瓶细胞时，处理方式为 将原封细胞培养瓶静置于37 C， 5 % CO2培养箱中- 隔天后，于无菌操作箱内取出培养瓶中培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基- 依一般培养方式再将细

18、胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。基础篇基础篇- - 细胞计数细胞计数( (一一) ) 将细胞消化收集离心后去上清，根据细胞量多少加新鲜适量培养基制成细胞悬液，稀释n倍后滴加在血球计数板上，数4个含有16个小格子的大格子中细胞总数A,计算： 细胞浓度A/4n104（个/ml）.附附- -存活测试（一）存活测试（一） 利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypantrypan blue blue 染料。染料。 范例范例培养瓶中细胞制

19、成培养瓶中细胞制成10ml 10ml 细胞悬浮液，取细胞悬浮液，取0.1 ml 0.1 ml 溶液与溶液与0.1ml trypan0.1ml trypan blue blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。 活细胞数活细胞数/ /方格：方格：55 ,62, 49, 59 55 ,62, 49, 59 死细胞数死细胞数/ /方格：方格：5, 3, 4, 6 5, 3, 4, 6 细胞总数细胞总数= 243 = 243 平均细胞数平均细胞数/4= 60.75 /4= 60.75 稀释倍

20、数稀释倍数= 2 = 2 细胞数细胞数/ml/ml：60.75 x 1060.75 x 104 4 x 2 = 1.22 x 10 x 2 = 1.22 x 106 6 总细胞数：总细胞数： 1.22 x 101.22 x 106 6 x 10ml = 12.2 x 10 x 10ml = 12.2 x 106 6 存活率：存活率：225/243225/24392.6 %92.6 %如何进行细胞实验？如何进行细胞实验？细胞瞬间转染培养皿 接种细胞数 ddH2O（l） DNA（g） 2Hepes(l) 2.5MCaCl2(l) 10cm plate 1-5106 332 8 390 48 6cm

21、 plate 0.5-2106 161 41952424 well 1-6104 100.5121.535mm plate1-2105 552658 磷酸钙转染细胞试剂用量磷酸钙转染细胞试剂用量转染步骤（以3.5 cm plate 为例）： (1) 染前24小时消化细胞接种至新的培养皿中。 (2) 染前1小时换液，先用PBS洗一遍，加入1.5ml 10FBS+DEME, 放回细 胞培养箱。 (3) 取5ml EP管，加入55l ddH2O，加入2l质粒（qiagen纯化后或CsCl纯化），轻弹40次混合均匀。 (4) 加入65l 2Hepes，尽可能缓慢。静置约1min,然后反复从管底吸上再混

22、匀8次。 (5) 加入8l 2.5M CaCl2 溶液，更轻柔！可看到明显的“丝状”折光变化，约2min，反复缓慢吹吸10次。于超净工作台放置15min。 (6) 取出35mm平皿，做好标记；将磷酸钙和质粒混合物滴加入平皿中，轻轻摇晃使其混匀。 (7) 置于37细胞培养箱，收拾残局。 (8) 6-9小时后换液，2448小时后可以收获细胞。 磷酸钙甘油休克法瞬时转染磷酸钙甘油休克法瞬时转染(9) 把磷酸钙DNA沉淀物加入细胞，培养26小时。(10) 即时配制30甘油（in PBS），融化2Hepes溶液，然后按1：1混合成15甘油。(11) PBS洗35mm平皿中细胞一次，加入0.7ml 15%

23、甘油，等待1min。(12) 完全吸出15甘油，用PBS洗一次。(13) 加入2ml 10%FBS+DMEM，置于37细胞培养箱。溶液配方溶液配方2Hepes: 140mM NaCl 1.5M Na2HPO42H2O 50mM Hepes 调节pH 7.05, 0.22m滤器过滤，分装 成1.0ml/tube，-20保存。30%甘油甘油： 甘油 15ml PBS 35ml 混匀，4保存LipofectamineTM 2000脂质体转染脂质体转染(1)转染前一天，把0.52105细胞接种于24孔板孔上，让细胞在转染时长到90-95；(2) 转染前1小时换液，加0.5ml不含血清和双抗的培养液,放

24、细胞培养箱继续培养；(3) 转染步骤如下：a. 溶解DNA（0.5g）于50l 不含血清的培养液轻弹10次混匀；b. 使用LipofectamineTM 2000前先混匀，然后取2l溶解于50l不含血清的培养液，室温放置5min；c. 5min后，将含DNA的培养液和含LipofectamineTM 2000的培养液混合，总体积100l，充分轻柔混匀，室温放置20min；(4) 把24孔板从培养箱中拿出，把100l混合物加入培养液中，前后轻轻摇荡混匀；(5) 将24孔板放回培养箱，培养46小时后可以换液，1848小时后检查蛋白表达绿色荧光融合蛋白基因转染HeLa 细胞细胞免疫染色（一）(1)

25、消化收集细胞，以2-10103 cell/coverslip 接种细胞于24孔板中，滴加细胞悬液50-100l，2小时后补加10%FBS+DMEM500l；(2) 37细胞培养箱中培养48小时后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量较佳的爬片做染色；(3) 去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加3.7-4% 甲醛0.5ml（in PBS）室温固定10min；(4) PBS洗两次，加穿膜液0.5ml（0.1Triton X-100+0.1M Glycine）冰上30min；(5) PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.3ml室温封闭1小时；(6) PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗（

26、用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25l于封口膜上，将爬片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时；细胞免疫染色（二）(7) 一抗孵育完后PBS洗两次，加二抗（羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25l于封口膜上，将爬片放在湿盒中室温黑暗中与二抗孵育1-3小时；(8) 同上PBS洗两次，同上操作，将玻片与10l DAPI室温孵育15min；(9) PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记（时间，细胞名称，实验内容，号码）；(10) 待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察完后将玻片放20保存；(11) 若只观察转染了EYFP的

27、荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可直接用DAPI (KPL, 71-03-00) 染核后封片；(12）以BSA (5mg/ml) 代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行2组以上。细胞免疫染色（三）盖玻片的处理盖玻片的处理酸洗，用医用酒精浸泡过夜，晾干；多聚赖氨酸包被盖玻片，晾干；用蒸馏水稀释多聚赖氨酸1：10稀释液可反复浸泡，一般每瓶多聚赖氨酸可够100200张玻片使用，稀释液保存于4，三个月内仍可使用。细胞免疫染色范例裂解细胞（一）裂解细胞（一） (1) 转染细胞2448小时或未转染生长至90汇合度细胞拿出培养箱，去掉培养基，用巴氏吸管加入预冷的PBS洗

28、两次，完全去掉PBS,加入2SDS上样缓冲液，在冰上用细胞刮刮下细胞，收集在1.5mlEP 管中，煮沸5min，离心12000g, 2min,取上清上样跑电泳，Western Blot； (2)也可先将细胞消化收集在1.5ml EP管中，加三倍于细胞体积的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，直接在离心管中裂解，冰上裂解2030min，最后4,14800rpm离心15min。裂解液若暂时不用，可放80保存。裂解细胞（二）裂解细胞（二） 溶液配方：溶液配方： 细胞裂解缓冲液：细胞裂解缓冲液：50mM HEPES-NaOH（pH 7.5）, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, 2.5 mM E

29、DTA, 10% glycerol, 1 mM DTT 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂：1 mM PMSF, Aprotinin 1g/ml, Leupeptin 5g/ml, pepestatin 1g/ml, AEBSF 50g/ml, Bestatin 10g/ml, E-64 1g/ml升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养1 1 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否

30、应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不

31、同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养2 2 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 都是指胎牛血清。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 7 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

32、 8附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。溶解后过滤除菌，应立即少量分装于无菌试管中， 保存于20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。 9悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 升级篇升级篇- -细胞培养细

33、胞培养3 3 10 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300 xg (约1000rpm)，5-10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 11 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 12 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接

34、加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。 升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养4 4 13 应如何避免细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 14 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。 15 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 16支原体污染会对细胞培养有何影响

35、？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 17 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 18 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养5 5 19 为何培养基保存于4 C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol

36、red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 20购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。 21 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加

37、以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80 C 太久。 22 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养6 6 23 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、R

38、PMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 24 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 25 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。

39、为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 26 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 培养液培养液pH pH 值变化太快值变化太快原因：原因：CO2 CO2 张力不对。培养瓶盖拧得太紧。张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3 NaHCO3 缓冲系缓冲系统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。

40、细菌、酵母或真统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污染。菌污染。解决：（解决：（1 1）按培养液中）按培养液中NaHCO3 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内浓度增加或减少培养箱内CO2 CO2 浓度，浓度，2.0g/L 2.0g/L 到到3.7g/L 3.7g/L 浓度浓度NaHCO3 NaHCO3 对应对应CO2 CO2 浓度浓度为为5 5 到到1010。（。（2 2）改用不依赖）改用不依赖CO2 CO2 培养液。培养液。 松开瓶盖松开瓶盖1/4 1/4 圈。圈。 加加HEPES HEPES 缓冲液至缓冲液至10 10 到到25mM 25mM 终浓度。终浓度。 在在CO2

41、 CO2 培养环境中改用基于培养环境中改用基于EarleEarles 盐配制的培养液，在盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。盐配制的培养液。 丢弃被污染的培养物或用抗生素除菌。丢弃被污染的培养物或用抗生素除菌。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养7 7 培养液出现沉淀，但培养液出现沉淀，但pHpH值不变值不变 原因：用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。原因：用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻保存培养液。冰冻保存培养液。 解决：用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。解决：用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。 将培养液加热到将培养液加热到3737，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢，摇动使其溶解如沉