G试验-侵袭性真菌病的辅助诊断方法

1、1唐丽娟容目录 一、真菌感染概一、真菌感染概 湛江安度斯生物有限公司是查尔斯河公司设在中国的子公司，是中国细菌内毒素检测试剂的最大供应商，也是中国细菌内毒素检测领域的技术领导者和创新先锋； 世界著名的美洲鲎试剂（LAL）生产企业美国CR恩度斯弗公司（Charles River Endosafe, Inc.），也是查尔斯河实验室公司的子公司湛江安度斯的简介Charles River Laboratories 作为全球最大的实验动物公司，Charles River Laboratories一直是全球实验动物商业化繁育和市场供应的领导者，拥有分布在北美、欧洲和日本的15个分

2、设施和遍布全球的销售网络；已成为一个生物医学前临床产品和服务的主要供应商。库珀博士 C R Endosafe（恩度斯弗） 公司是美国著名三大鲎试剂企业之一,有国际知名权威学者詹母斯 弗.库珀博士(Dr. Jammes F.Cooper)创建。库珀博士是细菌内毒素检查研究领域的先驱。1971年他与Lein 及 Banger等人提出以鲎实验法检查热源，并率先证明了鲎实验法作为注射药品热源检查的敏感方法的价值。1972年他协助美国(The parentral Drug Association) 的鲎试剂.他一直主持着美国非经肠道药物协会(The parenteral Drug Associatoin

3、)的鲎实验应用促进工作,以及每年一届的美国南卡罗纳州查尔顿的鲎实验学术会议。 库珀博士创建的 Endosafe 公司现以成为美国鲎试剂(LAL)市场最大的供应商.该公司的鲎试剂以其良好的稳定性,广泛的适用性以及优越的抗干扰性能享誉国际医药工业界.一、真菌感染概述一、真菌感染概述真菌感染 ：真菌感染在通常情况下我们最常见的是表皮的感染，例如头癣、体癣、甲癣等，由于侵犯的部位大都表浅，不会导致严重问题，因而叫浅部真菌感染；深部真菌感染则是真菌突破人体天然屏障导致组织脏器的感染。7美国死于感染性疾病的十大原因美国死于感染性疾病的十大原因820820围产期围产期828828真菌真菌1010105310

4、53胃肠道胃肠道13051305围产期围产期9 912591259结核结核12771277肝胆管肝胆管8 823702370真菌真菌13771377胃肠道胃肠道7 745964596肝胆管肝胆管14021402细菌性脑膜炎细菌性脑膜炎6 655775577心脏心脏23332333肺结核肺结核5 513, 41313, 413肾脏肾脏/ /泌尿道泌尿道24862486心脏心脏4 416, 52416, 524HIV/AIDSHIV/AIDS80068006肾脏肾脏/ /泌尿道泌尿道3 322, 39622, 396败血症败血症94389438败血症败血症2 287,18187,181呼吸道呼吸道

5、56, 96656, 966呼吸道呼吸道1 1死亡人数死亡人数感染类型感染类型死亡人数死亡人数感染类型感染类型1997199719801980真菌感染的死亡率上升了真菌感染的死亡率上升了3.43.4倍倍 （死亡率：（死亡率：0.72.4 /100,0000.72.4 /100,000）8 EORTC/MSG原称侵袭性真菌感染（IFI），修订后改称IFD； 是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的疾病。 是真菌感染致死的重要原因侵袭性真菌病侵袭性真菌病(Invasive Fungal (Invasive Fungal Disease ,IFD)Disease

6、,IFD)9侵袭性真菌病已变得越来越常见侵袭性真菌病已变得越来越常见10侵袭性真菌感染的诊断标准侵袭性真菌感染的诊断标准G试验可作为拟诊病例的微生物学标志11主要可引发侵袭性真菌病的疾病主要可引发侵袭性真菌病的疾病肿瘤类：肿瘤类：胃癌，肝癌，肝内胆管癌，胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤血病，恶性淋巴瘤12二、真菌与葡聚糖2022-3-24131. 某些真菌的细胞壁结构2. 细胞壁含有葡聚糖组分的真菌：（1）是导致侵袭性真菌病(IFD)的常见真菌。（2）细胞壁有葡聚糖组分2022-3-2414这类真菌有：念珠菌曲霉菌耶氏肺孢菌镰刀酶隐球菌 接合

7、菌 .2022-3-2415隐球菌病、接合菌病占真菌病比例不高16 当人体深部受这类真菌感染时，真菌在代谢过程会不断释放出葡聚糖。检查患者的血液（血浆或血清），会发现葡聚糖含量明显高于非感染者。因此，葡聚糖可作为具有这种细胞结构的真菌感染标识物。2022-3-2417三、鲎试验与G试验1. 鲎（Hu，后）试验2022-3-2418 鲎是地球上最古老的海洋生物之一，已有三亿多年的历史，人们称它为“活化石”。雌雄2022-3-2419 研究发现，鲎的循环细胞（阿米巴细胞）中含有一种特殊的凝固酶原。这种凝固酶原可以被自然界广泛存在的两种物质激活为凝固酶，从而导致一系列的生化反应。这两种物质就是脂多糖

8、(Lipopolysaccharide, LPS)和(1-3)-D葡聚糖。2022-3-2420 人们利用鲎的阿米巴细胞溶胞物制人们利用鲎的阿米巴细胞溶胞物制备成了鲎试剂（备成了鲎试剂（LALLAL或或TALTAL）。通常称）。通常称使用鲎试剂检测脂多糖（使用鲎试剂检测脂多糖（LPSLPS）或）或 - -葡葡聚糖（聚糖（ -G-G）的试验为鲎试验（）的试验为鲎试验（LAL LAL Test or TALTest or TAL TestTest）。）。2022-3-24212. 2. 鲎试验反应机理鲎试验反应机理223. 鲎试验的应用应用I：细菌内毒素检查(Bacterial Endotoxin

9、 Test, BET)2022-3-2423 研究发现，革兰氏阴性细菌的细胞壁都含有一种叫内毒素(Endotoxin)的组分。2022-3-2424 内毒素是能够引起哺乳动物原反应的主要热原物质。 革兰氏阴性细菌在新陈代谢过程不断地向环境释放内毒素，污染药品和医疗器械。因此注射药品和医疗器械都要求必须作细菌内毒素检查（BET）。2022-3-2425应用应用IIII：革兰氏阴性菌脂多糖检测革兰氏阴性菌脂多糖检测2022-3-2426 细菌内毒素的化学成分是脂多糖。当人体深部感染革兰氏阴性菌时，细菌会在体内不断释放内毒素（脂多糖）。检查患者的血液（血浆）、腹水、尿液及脑脊液，会发现脂多糖明显高于

10、非感染者。 脂多糖检测对败血症、严重器官衰竭的快速辅助诊断有临床价值。2022-3-2427应用应用IIIIII：真菌真菌(1-3)-(1-3)- -D-D葡聚糖葡聚糖检测检测2022-3-2428 医学上通常把用于检测真菌葡聚糖的鲎试验称为G试验。这是取葡聚糖的英文名称Glucan的首字母来命名该试验。2022-3-2429 需要指出的是，隐球菌的细胞壁虽然有葡聚糖组分，在隐球菌感染患者的血液中却检测不出葡聚糖异常。这可能与隐球菌具有特殊的细胞被膜有关。因此G试验不适合对隐球菌感染的检测。2022-3-2430四、四、G G试验试验临床意义临床意义31G G试验的临床意义试验的临床意义32G

11、 G试验的临床意义试验的临床意义333435G G试验应用科室试验应用科室36373839404142434445464748495051侵袭性真菌感染的临床检测方法对比侵袭性真菌感染的临床检测方法对比52产品特点产品特点53七、七、“生物探针生物探针”的临床比对的临床比对J厂家的-G试剂、LPS试剂均无特异性54最低检测限最低浓度重复性厂商安度斯最低检测限10pg/ml编号检测结果(pg/ml)阴性(pg/ml) 检测日期110.3 1.3 3.6210.1 311.049.859.8610.8710.1810.099.61010.3 CV=6.85%1110.0129.81310.7149

12、.81512.41610.3179.7189.6199.4209.9219.6批内精密度批间精密度“生物探针生物探针”的临床比对的临床比对58八、八、G G试验的影响因素试验的影响因素2022-3-24591. 检测试剂的灵敏度1.1 葡聚糖的量值与标准品2022-3-24602022-3-2461 目前G试验中葡聚糖采用的单位为重量单位“pg”。pg是一个非常非常微量的单位。因此G试验是一项非常灵敏的生物检测。当然，越是灵敏精确的检测，越容易受到干扰。 目前葡聚糖没有公认的标准物质！ 没有国际标准品，没有国家标准品，也没有公认的行业标准品，只有企业的标准品（质控品）2022-3-2462 各

13、企业的葡聚糖标准品的来源不一。有的来自茯苓多糖，有的来自香菇多糖，有的来自海藻多糖。不同来源的葡聚糖对鲎试剂的活性不同。 各企业的葡聚糖标准品效价不一。你的1pg可能相当我的10pg。相互之间无可比性。2022-3-2463 无统一的标准品导致不同厂家试剂盒有不同的参考值。有的是10pg为阳性，有的是100pg为阳性。 对参考值的表示各厂家也有所不同。有的以全血含量来表示，有的以检测浓度来表示。2022-3-24641.2 试验器具对G试验有重要的影响！ 葡聚糖是自然界广泛存在的一种物质，极容易污染到试验器具。 葡聚糖是一种非常稳定的物质，通常的蒸煮高压、辐照等灭菌手段不能彻底破坏葡聚糖。很难

14、找到真正意义的无葡聚糖的器具。2022-3-2465 G试验使用到的实验器具： 采血针 采血管（瓶） 反应试管 移液器具（吸头）最主要的污染来自采血管！2022-3-2466重要建议 最好使用厂家供应的专用采血管（瓶） 其次是用经厂家检测合格的采血管 不能使用未经检测的实验器具2022-3-2467 尊重科学，为患者负责！ 无效试验是对患者最大的危害！2022-3-24682.试剂的生物特异性 如前所述，G试验的检测试验就是鲎试剂。鲎试剂可以对两种物质反应，用于不同的用途。如下图表示。 检测内毒素/脂多糖 用于革兰氏阴性菌检测鲎试剂 检测葡聚糖（G试验） 用于真菌检测 2022-3-2469

15、在检测试剂制备上，应根据试剂的用途制备生物特异性强的检测试剂，如： 用于检测细菌脂多糖的试剂，不能对葡聚糖产生反应。 用于检测真菌葡聚糖的试剂，不能对脂多糖产生反应。2022-3-2470 遗憾的是，由于技术的原因，并不是所有遗憾的是，由于技术的原因，并不是所有厂家的试剂都具有生物特异性。厂家的试剂都具有生物特异性。 有的试剂盒对LPS和-G都反应。 有的试剂盒对非检测对象低浓度时可能不反应，较高浓度时会反应。 无生物特异性的试剂盒不能区分细菌无生物特异性的试剂盒不能区分细菌感染和真菌感染，不具有临床检测价值！感染和真菌感染，不具有临床检测价值！2022-3-24712022-3-2472 鉴别试剂盒是否具有生物特鉴别试剂盒是否具有生物特异性的方法：异性的方法： 用该试剂盒与用该试剂盒与LPS/LPS/ -G-G的的标准品（质控品）反应。标准品（质控品）反应。3. 某些药物对G试验的影响3.1 临床应用发现，注射过香菇多糖注射液的供试者作G试验，其血液中葡聚糖含量会显著增高。因此需要作G试验的供试者应在24小时内避免使用香菇多糖注射液。2022-3-24733.2 临床应用发现，使用过脂肪乳的供试者作G试验（包括作LPS检测），反应曲线形态会发生异常，致使检测值非常高。因此需要作G试验的供试者应在24小时内避免使用脂肪