生化方法学及仪器应用

1、生化检测方法及仪器应用两点法：测定酶反响开始后某一时间内 t1 到 t2 产物或底物浓度的总变化量以求取酶反响初速度的方法。 终点法：通过测定酶反响开始到反响到达平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。 速率法：是指连续测定 每 15秒1 分钟监测一次 酶反响过程中某一反响产物或底物的浓度随时间的变化来求出 酶反响的初速度的方法，即连续监测法。一、常用生化检测工程分析方法举例1终点法检测 常用的有总胆红素氧化法或重氮法 、结合胆红素氧化法或重氮法 、血清总蛋白双缩脲 法、血清白蛋白溴甲酚氯法 、总胆汁酸酶法 、葡萄糖葡萄糖氧化酶法 、尿酸尿酸酶法 、总胆固醇胆固醇氧化酶法

2、、甘油三酯磷酸甘油氧化酶酶法、高密度脂蛋白胆固醇 直接测定法、钙偶氮砷川法、 磷紫外法 、镁二甲苯胺蓝法等。以上工程中，除钙、磷和镁根本上还使用单试剂方式分析因而采用一点 终点法外，其它测定工程都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。 2固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。 两点法 3连续监测法 速率法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法， 如丙氨酸氨基转移酶、 天冬氨酸氨基转移酶、 乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、丫谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的工程如己糖激酶 法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。4透射比浊法 透射比浊

3、法可用于测定产生浊度反响的工程， 多数属免疫比浊法， 载脂蛋白、 免疫球蛋白、 补体、 抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。二、分析参数设置 分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定工程的分析参数an alysis paramete大局部也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测工程的空白通道，由用户自 己设定分析参数。因此必须理解各参数确实切意义。一、分析参数介绍一必选分析参

4、数 这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。1 试验名称 试验名称test code是指测定工程的标示符，常以工程的英文缩写来表示。2 方法类型也称反响模式方法类型assay有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反响类型。3.反响温度 一般有30C、37C可供选择，通常固定为37C。4主波长 主波长 primary wavelength 是指定一个与被测物质反响产物的光吸收有关的波长。5.次波长次波长secondary wavelength丨是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的 波长。6反响方向 反响方向 response

5、 direction 有正向反响和负向反响两种，吸光度增加为正向反响，吸光度下降 为负向反响。7. 样品量 样品量sampling volum一般是2卩l35卩卩卩l。可设置常量、减量和增量。8. 第一试剂量 第一试剂量first regengt volum一般是20300卩I,以1卩l步进。9. 第二试剂量 第二试剂量seco nd rege ngt volum丨一般也是 20300卩l，以1卩l步进。10. 总反响容量 总反响容量total reacting volum在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180350 l,个别仪器能减少至120卩l。总反响容量太少无法进行吸光度测定。

6、11孵育时间 孵育时间 incubate time 在终点法是样品与试剂混匀开始至反响终点为止的时间,在两点法是第 一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。12. 延迟时间 延迟时间delay time丨在连续监测法中样品与反响试剂第二试剂混匀开始至连续监测期第一 个吸光度选择点之间的时间。13. 连续监测时间 连续监测时间continuous monitoring time丨在延迟时间之后即开始，一般为 60120s,不少 于 4 个吸光度检测点 3 个吸光度变化值 。14校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液 calibrator ；线性好但不通过坐

7、 标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个适宜 的浓度。15校准 K 值或理论 K 值 通过校准得到的 K 值为校准 K 值 calibrate coefficient 或由计算得出的 K 值为理论 K 值。16线性范围 即方法的线性范围 linearity range ，超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。17小数点位数 检测结果的小数点位数 decimal point digit 。二备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但假设样品 中待测物浓度太

8、高等，检测结果可能不准确。1样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。 2底物耗尽值 底物耗尽值 substrate exhaust limit 在负反响的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸 光度下降限。假设低于此限时底物已太少，缺乏以维持零级反响而导致检测结果不准确。3 前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差异4A丨设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。4 .试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。5 试剂空白速率连续监测法中使用

9、，是试剂本身在监测过程中没有化学反响时的变化速率。6 方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。7 参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。三某些参数的特殊意义1 最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样 品量是2卩卩I的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参 数，从而使分析仪检测范围与线性范围不同的上限得以扩大。2 最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测工程，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10卩I，试剂量4ml，这样

10、试剂量/样品量比例R/S为200,线性上限那么为 60g/L。此法移植到分析仪上 后， R/S 却很难到达 200，致使线性上限变低。因此对这类检测工程最大试剂量非常重要。3 弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反响时，有些仪器具有弹性速率flexrate功能，能自动选择反响曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围 得以扩大。女口 AST可从1000U/L扩展至4000U/L ,从而减少稀释及重测次数、降低本钱。4 试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长 505n

11、m 有较高光吸收,而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变,因而在肌酐反响过程中胆红素 的光吸收呈下降趋势。假设在参加第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率,因为此段中苦味酸尚未与肌酐反响, 而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变,因而以第二试剂参加后的速率变化, 减去试剂空白速率变化,便可消除胆红素的负干扰,见图 7-8。二、单波长和双波长方式一概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长 (mono-wavelength) 方式。当反响液中含有一种组分,或 在混合反响液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时,可以选用。在吸光度检测中,使用一个主 波长和一个次波长的称双波

12、长方式。当反响液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时,采用双波 长方式更好。二双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是消除噪音干扰；减少杂散光影响：减少样品本身光吸收的干扰。从光源， 到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中,均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号,即噪音,而双波长 检测是同时进行的,两种波长检测产生的噪音根本上相同,因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反响的干扰 物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测 定可以局部消除这类干扰，提高检测的准确性。三次波长确实定方法 当被测物的主波长

13、确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物 在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波 长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。四双波长的具体应用对于某些反响速度快且无法设置为两点终点法的分析工程， 尤其是单试剂分析中， 可以利用双波长的方式来部 分消除样品本身的光吸收干扰。 目前用单试剂法测定的工程应用双波长的为血清总蛋白 双缩脲法 主波长 500nm， 次波长576nm；血清白蛋白溴甲酚氯法主、次波长分别为600和700nm ;钙偶氮砷川法主、次波长分别为660、 770n

14、m ;磷紫外比色法主、次波长为340、405nm,镁二甲苯胺蓝法主、次波长为505和600nm。三、单试剂和双试剂方式反响过程中只加一次试剂称单试剂方式, 加两次试剂便为双试剂方式。 目前的生化分析仪大多可用双试剂方式 分析，其优点是：可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；能设置两点终 点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；在某些工程检测时能消除非特异性化学反响的干扰。如血清ALT测定,血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶乳酸脱氢酶起反响,使结果偏高。假设先参加缺 乏a -酮戊二酸的第一试剂， 使其它酮酸与指示酶反响之后再参加含有a-酮戊二酸的第二试

15、剂， 启动真正的ALT酶促反响生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反响消耗的NAD +能真正反映 ALT的活性，从而消除以上副反响的影响。四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能,以便在没有人"监督 "化学反响的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。1试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围,试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用 Trinder反响为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、丫-谷氨酰转移酶、 淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情

16、况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基 转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反响检测工程,其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH 自行氧化为 NAD+而下降等。 试剂空白的测定方法有两种：每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种 方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。 每个样品测定前均检测试剂空白吸光度, 适用于先加试剂后取样品的分 析仪。2试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反响温度下不稳定,其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化,这种变化的 主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关, 且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。 这种变化会影响测定结果的准确 性, 一般使结果偏高。 如果设置此项监测

17、, 分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。 在以监测 NADP H 减少为指示反响的酶活性测定中,空白速率可监测并消除由NADH 自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中, 空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用,已如前述。3样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反响的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光 谱吸收特性,用双波长或多波长检测其性质和程度,一般是测定样品在600nm570nm、 700nm/660nm 和505nm/480nm 吸光度比值的大小来分别判断样品溶血

18、、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这局部干扰, 这将有利于提高分析结果的可靠性。4结果可靠性监测 1终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光 点,比拟这两点吸光度的差异来判断反响是否到达终点。 2线性期监测：连续监测法选择时间吸光度反响曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度,因此仪器要确 定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据 方差值的大小来判断是否呈线性； 取连续监测期开始假设干点的变化速率与连续监测期最后假设干点的变化速率 进行比拟,来判断是否为线性期。5底物消耗的监测

19、 在连续监测法测定酶活性时,如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值,那么说明该 样品酶活性非常高,底物将被耗尽,监测期的吸光度将偏离线性,使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果 同时也打印出底物耗尽提示， 该样品应稀释一定的倍数重新测定。 此监测对于采用负反响分析酶活性的方法甚为重 要。见图 7-96方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果假设超过此范围，分析仪将显 示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。一、分析方法分类 一终点法被测物质在反响过程中完全被转变为产物，即到达反响终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度

20、，称为终 点法end essay实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物到达一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡 法更为恰当。从时间 -吸光度曲线来看，到达反响终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反响终点附 近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反响是否到达反响终点。终点 法参数设置简单，反响时间一般较长，精密度较好。终点时间确实定：根据时间-吸光度曲线来确定，如 Trinder反响测定尿酸，反响曲线上35min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反响终点。根据被测物反响终点，结合干扰物的反响情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白

21、蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反响，之后a球蛋白和B球蛋白与溴甲酚绿发生慢反响，使反响曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用1030s，而不应选择 10min 。1一点终点法 ：在反响到达终点，即在时间 -吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称 为一点终点法one point end essay其反响曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度 CU=待测吸光 度AU 试剂空白吸光度 ABx K。K为校准系数，详见第五节二操作方法。2两点终点法 ：在被测物反响或指示反响尚未开始时，选择第一个吸光度，在反响到达终点或平衡时选择第

22、二个 吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法two point end essay，其反响曲线见图7-4。计算公式为CU=待测吸光度A2 待测吸光度 A1x K。该法能有效地消除溶血hemolysis黄疸icterus和脂浊lipo-turbid 等样品本身光吸收见图 7-5造成的干扰。在单试剂分析参加试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂参加之初， 假设指示反响吸光度尚未明显变化，那么可在此时选择第一个吸光度，在指示反响终点时选择第二个吸光度，从而设 置成两点终点法。 但指示反响初期吸光度无明显变化的化学反响较少，如单试剂方式测定总蛋白、 白蛋白、 钙、磷、镁等的终点法分析工程，及

23、双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析工程，因反响初期吸光度 已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加 入前，此时指示反响一般尚未开始，那么能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积 进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。二固定时间法指在时间 -吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反响初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法fixed-time essay反响曲线见图7-6。其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)x K。有

24、时也称此法为两点法。该分析方法有助于解决某些反响的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酐，反响的最初30s内，血清中快反响干扰物如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等能与碱性苦味酸反响；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反响，且此段时间-吸光度曲线的线性较好故也可用连续监测法测定肌酐；在80120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反响干扰物反响。这样选用反响的第二个30s为测定时间，既防止了快反响物质的干扰，也防止了慢反响物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。三连续监测法连续监测法continuous monitoring essay丨又称速率法rat

25、e essay，是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时， 连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值 A/min丨计算结果，见图7-7A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中3 1及3 5值偏小，而3 2=3 3=3 4,故A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反响，期间的厶A/min即为酶促反响的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算A/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。 连续监测法也可用于测定呈线性反响的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测

26、定的代谢物。酶活性U/L= A/mi n x理论或校准K值，代谢物浓度 CU= A/mi n x校准K值。关于理论 K 值和校准 K 值表达如下：1 理论 K 值 ：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性 (U/L)= A/min X，将此式中 以K来表示，此K值可通过对值即指示物质的毫摩 尔消光系数£、反响液总容量TV、样品容量SV和比色杯光径d计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。采用理论 K 值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精 确以及波长准确等。但事实上由于各型分

27、析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品 和试剂加量以及吸光度检测的偏差。 温度的影响有时也非常大， 由于反响盘是半暴露的， 因此随着较冷试剂的参加， 反响盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反响盘温度已升到37° C,但在某一工程测定过程的开始阶段，温度可能达不到 37° C ，甚至仅 35° C 左右，且反响过程中仍有可能上下波动，这对于酶学反响来说影响是很大的。如采用 37° C 时的理论 K 值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然，假设试剂在 参加反响杯前经试剂臂内加热装置预温，那么根本不影响反响

28、盘温度。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不 同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K 值称为实测 K 值。1NADH NADPH摩尔吸光系数的测定：NADH NADPH没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差， 不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反响途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶 (GD) 方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与 NADH 的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有 国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式

29、A= £ bC,比色杯光径 b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度 A后便可计算出NADH NADPH的摩尔吸光系数&为 卩L ,酶试剂参加量为 335卩L ,比色杯光径 为0.7cm，在340nm测得吸光度为 0.465，那么实测NADH摩尔吸光系数=6424，即在此台分析仪上 340nm波长 处测得NADH NADPH丨的摩尔吸光系数为 6424，而理论上 NADH NADPH的&为6220。2 "色素原 "酶促产物在 405nm 波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原 "底物,其本身无色,经酶作用

30、后释放出有色的反响产物,在 405nm 波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为 : ALP 测定以磷 酸对硝基苯酚(4-Nitrophenyl phosphate , 4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol , 4-NP),GGT测 定以丫 -L-谷氨酰对硝基苯胺(丫 -L-Glutamyl-p-nitroanilide)或丫 -L-谷氨酰-3-羟基-对硝 基苯胺(丫 -L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan) 为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺 (p-Nitroaniline ，4-NA) 或对硝基 -5-氨 基苯甲

31、酸(2-amino-nitrobenzoicacid , ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。试剂：4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。AMP缓冲液稀释而成)。底物缓冲液(l5mmol/L AMP-HCL 缓冲液中， 37 C ,pH 10.09 土 0.02)。测定方法：4-NP标准液参加量为5卩L,底物缓冲液参加量为350卩L,波长405nm ,光径0.7cm，温度37 C，测定得吸光度为A1 ;另用蒸馏水代替 4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2 , 4-NP标准液吸光度 A= A1- A2 ,假设测得厶A为0.460,那么 实测4-NP摩尔吸光系数=186622校准 K 值 酶活性校准品经校