抗抑郁药理试验方法

1、抗抑郁药理实验方法实验方法和模型一、药物之间相互作用模型许多早期模型涉及到抗抑郁药与其它药理学类型药物之间的相互作用，这些模型曾不严格地被认为模拟了抑郁，然而从抑郁模型的三方面标准一一表面上的相似性（facevalidity）、预测的有效性（predictivevalidity）及思路的合理性（constructvalidity）来考虑，这些早期模型实际上只起着筛选具有专一神经化学作用的抗抑郁药的作用，只能作为抗抑郁药初筛的一种手段，从严格上说不应称为抑郁动物模型。（一）利J血平拮抗（reserpinereversal）1 .概述利血乎是一种囊泡再摄取抑制剂，它使递质留在囊泡外，易被单胺氧化酶

2、降解，从而使儿荼酚胺（NE、E、DA和5HT）耗竭，引起行为和生理上的变化。对利血平引起的行为和生理变化的拮抗是最早发展的抑郁动物模型。经利血平处理的动物出现上眼脸下垂、体温下降及强直症状，预先用三环抗抑郁药及单胺氧化酶抑制别处理，能拮抗上眼睑下垂及体温下降的症状。然而此实验不能检测许多结构上不同于三环抗抑郁药及单胺氧化酶抑制剂的新抗郁药.却对于很大范围的非抗抑郁药有效，如兴奋剂、多巴、。a一肾上腺素能激动剂、B肾上腺素能阻断剂及抗组胺药。事实上此实验包含三方面独立的生物学检测，因为利血平引起的上眼脸下垂、体温下降及强直分别被a一肾上腺素能或5-HT能激动剂、B肾上腺素能激动剂及DA激动剂所拮

3、抗。2 .实验方法及观测指标选用1823g雄性小鼠1）上睑下垂（ptosis）的观测静注2mg/kg利血平，同时腹腔注射或口服药物或生理盐水（对照），1hr后将动物放于支架上观察15s,比较给药组和对照组中限盼至少关闭一半的动物的个数。2）运动不能（akinesia）的观察静注2.5mg/kg利血平，同时口服药物或生理盐水（对照），lh后将动物放于直径7.5cm的圆形白纸的中央观察15s或更长时间，比较给药组和对照组中仍然呆在圈内的动物的个数。3）体温下降（hypothermia）的观察腹腔注射5mg/kg利血平，同时口服药物或生理盐水(对照),4h后将探头插入动物肛门内1.5至2cm处测量肛

4、温，比较给药组及对照组中肛温的差异。3 .注意事项进行动物体温测量实验时，环境温度应保持恒定，最好在20度左右。4 .应用常用于具有一定药理作用的抗抑郁药的初筛。(二)高齐1J量阿扑吗啡的拮抗(antagonismofhighdoseofapomorphine)1 .概述Schelkunov1968年首先提出将阿扑吗啡引起小鼠体温下降作为筛选抗抑郁药的一种实验方法。以后的研究表明，药物对高剂量阿扑吗啡(16mg/kg)引起小鼠体温下降的拮抗是通过中枢去甲肾上腺素能机制，该实验反映了药物对去甲肾上腺素重摄取及/或去甲肾上腺素传递的作用，而不反映其抗抑郁性质、多巴胺拮抗或其对5-HT受体的作用。2

5、 .实验方法及观测指标环境温度保持20-22Co体重2025g的雄性小鼠，测量肛温后腹腔注射受试药物或生理盐水，30min后皮下注射阿扑吗啡(16mg/kg),30min后再次测量肛温。比较生理盐水对照组和受试组肛温变化的差异。3 .注意事项进行动物体温测量实验时，环境温度保持恒定。4,应用用于筛选抑制NA重摄取或能激活a1和B一肾上腺京能受体的药物。(三)5-HTP诱导的甩头行为(5HTPinducedhead-twitches)1 .概述该模型最早由Corne等在1963年提出。5HT受体兴奋引起的甩头综合征可能通过5HT2受体介导。小鼠中由5HTPB导的甩头行为对于具有不同作用机制的抗抑

6、郁药均比较敏感，如西猷普兰、氟伏沙明等5-HT重摄抑制剂，去甲丙咪嗪、麦普替林、诺米芬辛等NA重摄抑制剂及混合作用于5-HT和NA系统的丙咪嗪。2 .方法步骤及指标选用2024g雄性小鼠。首先在测试前3h腹腔注射100mg/kg帕吉林。之后腹腔注射受试药或生理盐水，30min后再注射5HTP(5mg/kg,ip).10min后开始观察，记录6min内小鼠甩头次数。比较实验组和生理盐水对照组甩头次数的差异。3 .应用常用于研究筛选作用于中枢5-HT或NA系统的抗抑郁药。(四)小鼠育亨宾增强模型(yohimbinepotentiationmodelinmice)1 .概述Gershon及其同事观察

7、到，临床上有效的抗抑郁药包括单胺氧化酶抑制剂、三环抗抑郁药及非典型抗抑郁药IprindoLe均能增强a2受体拮抗剂育亨宾在狗上的毒性。基于这些发现，他们建立了狗育亨宾模型。尽管在有限的受检药物范围内该模型的临床预测性比较好，但该模型耗时耗费，因而它的使用受到了限制。1963年,Quinton观察到丙咪嗪及几种其它类型的抗抑郁药均能显著增强育亨宾在小鼠中的毒性。与狗育亨宾增强模型相反，小鼠模型对于抗抑郁药并不专一，其它药物如抗精神分裂症药物，抗胆碱能药物也能增强育亨宾在小鼠中的毒性，但由于该模型操作上简便快速，出而得到广泛使用。2 .实验方法及观测指标选用1824g的雄性小鼠，口服受试药物或生理

8、热水，皮下注射育亨宾30mg/kg。观察比较注射育亨宾18h后受试组相对照组中小鼠死亡率。3 .注意事项育亨宾的用量应当采用使对照组小鼠没有致死作用时的最大剂量。4 .应用观察药物对NE能神经传递的作用。二、应激模型(一)“行为绝望”及其衍生(behaviouraldespairandderivatives)1 .概述尽管70年代已出现了一些较好的抑郁动物模型，如获得性无助模型、分离模型，仅由于花费或可行性问题，这些模型尚未用于常规的药物韧筛。药物初筛迫切需要一些简单、快速、敏感的动物模型。在此背景下，Porsolt等977年分别发展了大鼠和小鼠强迫游泳模型。在强迫游泳模型中，大鼠和小鼠被迫在

9、一局限的空间游泳，它们首先挣扎试图逃跑，随后处于一种不动的状态，这种状您被弥为“行为绝望”。除了一些5-HT重摄取抑制剂之外，多数抗抑郁药在此模型中均能减少动物的不动时间，且其药效与临床上药效显著相关。而在亚活性剂量锂盐辅助下，5-HT重摄取抑制剂类抗抑郁药在此模型中也往往有效。继强迫游泳模型之后，陆续衍生出了其它一些模型，在这些进展中最突出的是小鼠悬尾模型。悬尾小鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现可断性水动，显示“失望”状态。有效药物包括三环抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂及非典型抗抑郁药（包括5-HT重摄抑制剂）。2 .大鼠强迫游泳实验ratforcedswimmingtes

10、t）1）实验方法选体重160180g雄性大鼠放人水深15cm的量筒（40cm高,18cm直径），水温25Co预试15min后在32c下烤干；24h后，动物重新放人上述环境中，测定给药组和对照组在5min内保持漂浮不功的时间。2）注意事项（1）实验中水的深度是关键，应使动物后爪刚可触及水底，但又不能支撑身体。能增加活动性的药物可能出“假”阳性结果，故在进行强迫游泳实验的同时还应检测该药对活动性的影响。3 .小鼠强迫游泳实验（mouseforcedswimmingtest）选20-24g雄性小鼠放入水深10cm的量筒（20cm高14cm直径）,水温25度，观察6min,比较给药组和对照组小鼠在后4

11、min内不动的时间。4 .小鼠悬尾实验（tailsuspensiontest）选体重2024g雄性小鼠，将其尾端2cm的部位贴在一水平木棍上，使动物成倒挂状态，其头部离台面约5cm,悬挂两侧用板隔开动物视线。比较给药组及对照组在6min内的不动时间。5 .应用常用于抗抑郁药的初筛。（二）获得件无助（learnedhelplessness）1 .概述“获得性无助”现象最初是在1967年被Seligman和Maier用来描述狗的，随后扩展到其它种属（大鼠、猫、小鼠和人）。近些年来的大多数实验多采用大鼠作为研究对象。“获得性无助”即当机体受到无法逃避的应激刺激如电击时，将随后产生操作欠缺，而在同等的

12、可以逃避的应激刺激下则不产生操作欠缺。“获得性无助”动物产生的操作欠缺可在亚长期（3-7d）使用各种抗抑郁药包括三环抗抑郁药、单胺氧化两抑制剂、非典型抗抑郁药及电惊厥电击下所逆转,而长期使用兴奋剂、镇静剂、抗焦虑药及神经松弛剂则无效。“无助”动物除了在令其厌恶的条件刺激下表现出操作欠缺外，还可出现其它一些行为变化，如活动性降低、攻击性减少及食欲和体重下降。脑中NE5-HT、DA能、GABAfg神经元活性下降及中枢胆碱能神经元活性过高均与无可回避电击后的行为抑制有关。很难确定具体哪类神经递质系统与哪种行为变化相关联，因为行为变化本身不是单一的。如穿梭箱逃避学习包含活动性、注意过程、协调过程、恐惧

13、、疼痛等，其中的任何一项变化均能改变逃避行为。因而各种神经化学的变化均可反映在逃避行为上.无可回避的电击后出现的行为欠缺的中枢机制与多种神经递质系统有关。2 .操作方法及观测指标1）“无助”的诱发通过有盖的20X10X10CR3笼子内的不锈钢栅（1.5cm间隔）传送60次随机的无法逃避的足部电击（0.8mA,持续15s,每1min15s给一次电击），对照大鼠（200220g雄性大鼠）放于相同笼中1h.但不给予电击。“无助”的诱发可在第1天上午进行。2）条件回避训练在无可逃避的电击之后48h（第3d）开始进行回避训练，以便于评价逃避和回避行为。实验时，使用60X21X30CR3的穿梭箱，其底面由

14、不锈纲栅构成（1.0cm问隔），穿梭箱被一块带有7X7cm2小门的不锈钢板隔成两个相同的箱子。将动物单个地放人穿棱箱的一端，使其适应测试环境5min（只在第一期训练时进行），然后进行30次回避训练（每次之间间隔30s）o每次训练的最初3s出现一个光信号，允许动物在此期间到达另一端的箱中以回避电击。若此间无回避反应发生，则光信号再持续出现3R,同时还出现一个0.8mA勺足部电击（持续3s）。若此间无逃避反应发生，则电击和光信号立即自动停止，同时将此记作一次逃避失败。在第3、4、5d亡午均进行一期回避训练，每只大鼠均记录其逃避失败次数。预先经受了无可逃避电击的大鼠.在第3、4、5d的测试中逃避失败

15、次数均显著高于预先未经受无可逃避电击的大鼠，而在连续使用抗抑郁药之后，预先经受了无可逃避电击的大鼠在第3、4、5d的测试小逃避失败次数显著下降，尤其是在第4、5d中。3.应用获得性无助模型对抗抑郁药高度敏感，不仅可用于这些药物的次筛，也日益用于研究这些药物的作用机制及抑郁病的神经生物学(三)未预知的长期应激刺激(chronicunpredictablestress)1 .概述此模型最初是在1981年由Roth和Katz描述的：大鼠长期受到各种应激刺激后，其在敞箱测试中的急性白噪声刺激下将显示出活动性的减少。随后又有研究者们观察到慢性未预知的应激刺激还能导致动物在强迫游泳实验中活动时间缩短及在穿

16、梭箱实验中逃避行为欠缺。在慢性应激刺激朗间每日给予抗抑郁药物治疗，将明显改善动物的行为欠缺。慢生应激大鼠出现的行为欠缺可能与去甲肾素能系统的改变有关。2 .实验方法和指标选用280350g的大鼠，每笼4只，食水不限(除非持指)。1)敞箱买验(1)慢性应激刺激大鼠在21d中受到的应激刺激包括：三次1h电击(平均1mA只续ll0s,平均每min一次电击)；两次40h禁食，三次4c冷水中游泳5min,两次40h禁水，两次40c环境中5min,两次高速水平方向摇晃30min,两次昼夜循环颠倒。每2或3d给予一次刺激，以半随机方式给予。(2)给药方式每日一次，持续21do(3)活动性测试在最后一次慢性应

17、激刺激的48-72h后，将大鼠置于95dB的白噪声中达lh。然后立即将大鼠放入1.22m2x45cm高的敞箱(4X4方格)中测试6min。记录大鼠在前3min内方格间的穿行次数以及整个6min内的排粪次数。2)穿按箱实验1慢性应激刺激大鼠在14d中受到的应激刺激包括：两次30加n足部电击(1mA持续1s,平均每min一次)，一次24h禁食，两次4c冷水中游泳5min,两次24h禁水，两次lh水平方向高速摇晃，两次24h转移至另一屋中的新笼中，一次1min夹尾，一次24h孤养。每日随机给予一种刺激。(2)给药方式每次应激刺激前1h腹腔注射受试药或生理盐水一次，共持续14do(3)逃避行为测试第1

18、5d,将动物放入空梭箱的一端，使之先适应测试环境3min。然后进行30回避试验：每次试验的前4s均出现噪声信号，若此期间无回避反应发生，大鼠将受到0.8mA足部电击；若此间无逃避反应发生，则电击和噪声信号将终止。记录动物在整个实验中逃避失败的次数，即电击出现期间动物未到达另一端箱子的次数。3.应用可用于抗抑郁药物的筛选及抑郁症病理生理机制的研究（四）未预知的长期温和应激刺激（chronicunpredictablemildstress）1 .概述未预知的长期温和应激刺激模型是Willner等受Katz等描述的未预知长期应激刺激模型的启发而在1987年提出的。Willner将其中的应激刺激程度减

19、轻，利用长期的温和应激刺激，使之更现实地模拟了人们日常生活中遭遇的“困难”。在经过长期温和应激刺激之后蔗糖水饮用量的减少反映了内源性抑郁症的中心症状即快感缺乏（anhedonia）。在新的模型中，抗抑郁药治疗的时间进程及在正常非应激动物中的无效，准确地模拟了临床治疗的情形。抗抑郁药在慢性应激刺激模型中的作用可能通过增加突触后DA受体敏感性来介导。DA受体拮杭剂Pimozide、SCH-23390和sulpiride急性给药能拮抗三环抗抑郁药在此模型中的疗效，D2受体拮抗剂raclopride能选择性地拮抗fluoxetine（氟西汀）和maprotiline（麦普替林）在此模型中的疗效。2 .

20、方法步骤选用体重300350g的雄性大白鼠，孤养。1）所有动物首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48h内将蔗糖水故人笼中以代替自来水，接着禁食禁水20h,通过称饮水瓶重量连续测量5次动物在lh内蔗糖水的饮用量。此后每间隔一周均进行一次20h禁食禁水及1h饮蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验.2）根据最后的基线测试中大白鼠蔗糖水的饮用量，将动物均匀分成两组。其中一组作为对照组，只在测试前禁食和禁水20h,其它时间食水不限。另一组接受长期应激刺激，包括：两次20h的禁食和水，其中一次在测试之前.另一次在禁食和水后给予2h进食时间（将45g食物分散在笼内）；16h禁水；两次通宵照明；两次（7和17h）4

21、5C倾斜笼子；一次17h的配对饲养；一次17h潮湿笼中饲养（将200m1水加到有锯末的笼底）；两次（3、5h）周期性的噪声（85d;三次（7、9和17h）低强度的闪烁照明（每min闪300次）。两组动物在互相隔离的环境饲养。3）在经过4周的应激刺激之后，根据测试结果，每组动物又可均匀分成受试药组和生理盐水组。在继续进行应激刺激的同时，进行长期给药（如每日一次，共进行5周用药）。3 .指标比较各组动物蔗糖水饮用量的差异。经过长期温和的应激刺激之后，动物蔗糖水的饮用量将明显减少，而给予抗抑郁药治疗的动物蔗糖水的饮用量将恢复正常。4 .应用该模型对于研究抗抑郁药的临床作用机制及抑郁病的病理生理机制具

22、有一定价值。三、脑损伤模型嗅球切除模型（olfactorybulbectomymodel）（一）概述自从1971年Cairncross和King首次报道阿米替林能改善嗅球切除大鼠回避学习能力以来，陆续有许多文献报道切嗅球大鼠的许多行为变化包括自主活动性增加和被动回避反应能力欠缺等均能被抗抑郁药逆转。嗅球切除动物行为欠缺的神经生化机制尚不十分清楚，人们认为至少部分上嗅球切除后通过改变不同脑区5-HT能系统功能引起行为欠缺。例如，增加5-HT传递的药物能改善切嗅球引起的被动回避欠缺，而将5HT拮抗剂metergoline全身给药或注入内侧杏仁核，能阻断抗抑郁药在嗅球切除大鼠中的药效；嗅球内注射5,

23、7一双羟色氨酸以破坏其中的5-HT末梢能产生与嗅球切除后相似的被动回避欠缺，而破坏儿茶酚胺能神经元则不能。由于作为5-HT投射到边缘及前脑区的起源点缝核背侧具有投射到嗅球的纤维，因而切除嗅球后这些联系遭到破坏可能导致缝核及与之联系的其它脑区5-HT能传递改变。（二）手术方法1J.选取体重300350g雄性大鼠，经过至少34d每日数次的抚摸之后，用三澳乙醇（250mg/kg,ip）或水合氯醛（375mg/kg,ip）等麻醉大鼠。5 .从大鼠前因前1cm至前凶后1cm正中线处纵切头皮，暴露颅骨。6 .在距离前因前面8mm正中线两侧2mmy1分别钻通颅骨，使出现两个2mms径的小孔。7 .用连在水泵

24、上的钝的皮下注射针，借助负压将嗅球吸出。8 .用止血海绵填充小孔，四环素粉末洒在伤口上，缝合皮肤9 .大鼠经过14d左右的恢复期后可以进行实验。在恢复过活程中，每日仍需抚摸动物。假切除大鼠处理方式基本同上.只是嗅球不吸除。（三）测试方法1 .被动回避实验1）跳台（step-down）被动回避在电击箱内放一个木制平台，平台高出电击箱底大约5cm左右。将大鼠先置于电击箱（不予电击）中使之熟悉环境1min。然后将大鼠放于平台上，只要其4个爪全部接触到电击箱底部就给予一次2s0.6mA左右的电击，直到它在平台上连续呆上3min或遭受l0次电击为止。记录此时大鼠遭电击的总次数。大鼠嗅球切除后遭受电击次数

25、明显增多，反映了嗅球切除能引起被动回避反应欠缺。当给予抗抑郁药后，能减少遭电击的次数。2）避暗（stepthrough）被动回避实验箱由明暗两室组成，隔板底部有一通道供大鼠出入。暗室网栅与电休克仪相联。如大鼠进入暗室，则遭电击。将大鼠放人暗室，并给予一次电击，人鼠将逃至明室，当大鼠的4个爪又重新回到暗室时.将再次受到电击，此时记数为l,直至大鼠连续在另一端呆上2min或遭受电击达20次，记录此时大鼠遭受电击的总次数。3）舔水被动回避在连续4d的实验中，大鼠每日禁水23.5ho第1、2d将大鼠放人受试笼中进行l0min的舔水训练，第3、4d进行测试。测试时，每当大鼠舔水20次自动给予一次电击。记

26、录大鼠舔水次数及遭电击的次数。嗅球切除大鼠遭受电击次数将明显多于假切除大鼠，抗抑郁药能明显减少嗅球切除大鼠迢电击次数。2 .主动回避实验实验箱内没有条件刺激装置，即声光刺激，底部为不锈钢栅，与电击装置相连，给予非条件刺激（电击刺激）。实验箱两长侧壁的底部装备有红外光电管。实验包括60个试行周期，每个周期分为条件刺激期、非条件刺激期及间歇期。如果大鼠在条件刺激期移动并切断两端的光束，则可避免电击，记录为“回避反应（avoidanceresponse）。如在非条件刺激期切断光束，则电击立即中止，记录为“逃避反应”（escaperesponse）0如果切断光束发生于间歇期，则记录为“自发反应”。大鼠

27、嗅球切除后，回避反应次数明显增多，逃避失败次数显著降低，表明嗅球切除后主动回避反应能力增强。当给予抗抑郁药后，主动回避反应能力遭破坏。3 .敞箱活动性实验木制箱100x100x50cm3地板用笔划成25方格（20x20cm2）,将大鼠放于正中格中，其正上方45cm处放一白炽灯照明，观察大鼠在3min内的活动情况，包括方格间穿行次数（三爪以上跨入邻格的次数）、竖起次数（两前肢离地1cm以上的次数）、修饰次数及排粪次数。每次实验后均需将动物的排泄物清除干净。大鼠嗅球切除后方格间穿行次数明显增多，而在慢性给抗抑郁药后能使此行为恢复正常。（四）注意事项1 .术前术后的每日抚摸对于减少术后动物的易怒性及

28、测试时的行为差异很重要。2 .巴比妥类麻醉剂麻醉时间长，易挥发的麻醉刑具刺激效果而易导致并发症，因而使用作用较短暂的不挥发的非巴比妥类麻醉剂较好，有利于术后恢复。3 .吸除嗅球时应小心不损伤额叶皮层。测试结束时应检查动物手术是否正确。4 .术后应将动物置于20c左右环境中，以避免动物体温过低。（五）应用常用于抗抑郁药的次筛以及作用机制研究。四、72s低频率差式强化程序（differentialreinforcementoflowrate72-sschedule）（一）概述在低频率差式强化DRL）程序中，只有与上一次反应间隔一定时间或一定时间以上发生的另一次反应才被强化，否则不但没有强化，而且间

29、隔又要重新开始。1980年McGuire和Seiden首先观察比较了三环抗抑郁药丙咪嗪对大鼠在DRL9-s和皿DRL72-s程序中操作行为的影响，结果表明，在DRL9-s中丙咪嗪对强化数和反应数无明显影响，而在DRL72-s中丙咪嗪急性给药能显著增加强化数同时减少反应救，反应问时间问隔（IRT）分布移向较长的IRT。随后陆续又有报道表明，在DRL72-s中，其它的三环抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、电休克及一些非典型抗抑郁药如麦安舍林、曲唾酮、氟西汀、齐美利定也具有与内咪嗪相同的效应，各类非抗抑郁药如精神抑制剂、抗组胺药、抗胆碱能药、抗焦虑药、精神运动兴奋剂、酒精、麻醉止痛药测试结果则不同于抗抑郁药。因此DRL72-s成为抗抑郁药筛选及研究的一个模型。由于损毁前脑5-HT通路可以阻断抗抑郁药在此模型中的应用，非选择性5-HT受体拮抗剂能部分阻断三环抗抑