组定稿的学位和答辩博士

1、Britton Chance Center for Biomedical Photonics - -分泌酶活性及其二聚化的动分泌酶活性及其二聚化的动态光学成像研究态光学成像研究 学位申请人：学位申请人： 陆陆 锦锦 玲玲学学 科科 专专 业：业：生物医学工程指指 导导 教教 师：师： 曾绍群 教 授2007911博士学位论文答辩Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴定 n活细胞内活

2、细胞内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET技术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴定 n活细胞内活细胞内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET技

3、术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics阿尔茨海默症阿尔茨海默症 (AD)(AD)n阿尔茨海默症阿尔茨海默症（AlzheimerAlzheimers Disease, ADs Disease, AD）是）是一种常一种常见中枢神经系统退行性疾病，是老年痴呆的一个主要见中枢神经系统退行性疾病，是老年痴呆的一个主要类型；类型；n临床表现为记忆丧失、性格改变、认知障碍和功能损临床表现为记忆丧失、性格改变、认知障碍和功能损害等，后期甚至呈严重

4、痴呆以至植物人状态；害等，后期甚至呈严重痴呆以至植物人状态；n患病率随年龄增长而指数上升，患病率随年龄增长而指数上升，6565岁以上发病率为岁以上发病率为2%-2%-10%10%，而，而8585岁以上就上升到岁以上就上升到20%-50%20%-50%； n19061906年，年，德国精神病学家德国精神病学家Alois AlzheimerAlois Alzheimer首次描述了首次描述了该病；该病；n19661966年，发现两个显著病理特征年，发现两个显著病理特征: :神经纤维缠结和淀粉神经纤维缠结和淀粉样斑块沉积。样斑块沉积。Briton Chance Center for Biomedica

5、l Photonics C ADAD最显著的病理特征：最显著的病理特征：（1 1）淀粉样斑块沉积，俗称老年斑）淀粉样斑块沉积，俗称老年斑( (senile plaques, SP) 1985 1985年发现，主要成分：年发现，主要成分：-淀粉样蛋白（淀粉样蛋白（AA），淀粉样前体），淀粉样前体 蛋白（蛋白（APPAPP）的水解产物）的水解产物（2 2）神经纤维缠结）神经纤维缠结(neuroflibrillary tangles，NFT ) 1985 1985年发现，主要成分：异常高度磷酸化的微管年发现，主要成分：异常高度磷酸化的微管tautau蛋白，形蛋白，形 成双股螺旋微丝成双股螺旋微丝(P

6、HF)(PHF)结构结构Westmeyer G. G, Ph.D thesis, 2006 ）Briton Chance Center for Biomedical Photonics老年斑与神经纤维缠结的关系老年斑与神经纤维缠结的关系 n淀粉样蛋白是淀粉样蛋白是AD的发生必要条件，的发生必要条件，AD中中的神经纤维缠结是神经元对淀粉样蛋白的神经纤维缠结是神经元对淀粉样蛋白(A)逐逐渐积累的一种细胞反应，是淀粉样级联病理变渐积累的一种细胞反应，是淀粉样级联病理变化的一个结果化的一个结果;n已有多种证据证明已有多种证据证明A的产生积累产生细胞毒性，的产生积累产生细胞毒性，导致导致Tau蛋白磷酸化

7、蛋白磷酸化;n因此，因此，A在在AD的发病机理中起着十分关键的的发病机理中起着十分关键的作用，了解作用，了解A的产生以及其在的产生以及其在AD的发生发展的发生发展中的作用及机制具有重要的意义。中的作用及机制具有重要的意义。Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsAA的产生及淀粉样蛋白假说的产生及淀粉样蛋白假说nAA是由其前体蛋白是由其前体蛋白淀粉样前体蛋白淀粉样前体蛋白(amyloid (amyloid precursor protein, APP)precursor protein, APP)经两种蛋白酶经两种蛋白酶(-(-分泌酶和分泌酶和-

8、分泌酶分泌酶) )依次酶切水解而产生依次酶切水解而产生; ;n淀粉样蛋白假说（淀粉样蛋白假说（Amyloid hypothesis） Schenk D., Nature reviews, 2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics淀粉样前体蛋白（淀粉样前体蛋白（APPAPP）及其水解）及其水解 n主要有三种分泌酶参与主要有三种分泌酶参与APPAPP的水解过程，分别的水解过程，分别称为称为、和和分泌酶分泌酶 n分泌酶是一个锌依分泌酶是一个锌依赖的金属蛋白酶。赖的金属蛋白酶。n-分泌酶是一个蛋白分泌酶是一个蛋白复合物，其中早老素复合物，其中早

9、老素（presenilinspresenilins，PSPS）为主要的催化组分为主要的催化组分Selkoe D，Phy.Rev.2001 Esler W. P., Science , 2001nAPPAPP是一个是一个I I型跨膜蛋白。型跨膜蛋白。主要有三个亚型主要有三个亚型APP695APP695、APP751APP751、APP770APP770；nAPPAPP基因有基因有1616种点突变种点突变n早发性家族早发性家族ADAD（FADFAD）Briton Chance Center for Biomedical Photonics分泌酶（分泌酶（BACEBACE）n19991999年年,

10、-, -分泌酶的基因被鉴定出来分泌酶的基因被鉴定出来n命名为命名为beta-site APP cleaving enzyme beta-site APP cleaving enzyme （BACEBACE） Fischer F.，J. Neurochemistry, 2002Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsADAD的诊断与治疗的诊断与治疗 nADAD主要通过临床症状观察和记忆、智力测试等方法进主要通过临床症状观察和记忆、智力测试等方法进行诊断；确诊行诊断；确诊ADAD的依据是神经纤维缠结及老年斑的病的依据是神经纤维缠结及老年斑的病理学活

11、检或尸检；理学活检或尸检；nADAD治疗的药物：（治疗的药物：（1 1）乙酰胆碱脂酶抑制剂；（）乙酰胆碱脂酶抑制剂；（2 2）脑）脑代谢类药；（代谢类药；（3 3）防治）防治ADAD的中药天然活性成分；的中药天然活性成分；nADAD治疗的新方向：开发针对治疗的新方向：开发针对AA的各种药物，包括的各种药物，包括AA疫苗、针对产生疫苗、针对产生AA的两个水解酶（的两个水解酶（-分泌酶和分泌酶和-分分泌酶）的抑制剂、阻止泌酶）的抑制剂、阻止AA聚集的药物等；聚集的药物等；n除了除了APPAPP外，调节胚胎发育的外，调节胚胎发育的NotchNotch蛋白也是蛋白也是-分泌酶分泌酶的作用底物；的作用底

12、物；n因此，因此，BACEBACE成为了首选的成为了首选的ADAD药物治疗靶标。药物治疗靶标。Briton Chance Center for Biomedical Photonics本文研究对象：本文研究对象：-分泌酶（分泌酶（BACEBACE）Mudher A., Lovestone S. Trends in neurosciences, 2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics研究手段：荧光能量共振转移（研究手段：荧光能量共振转移（FRETFRET）Bastiaens P. I., Trends in cell biology,

13、1999荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）是指两个携带不同荧光基团的分子在相互间距离足够近时(1-10 nm)发生的能量非放射性地由一个荧光基团向另一个荧光基团转移的现象。FRETFRET原理原理FRETFRET荧光对荧光对Yang.F.,et al.,1996Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsFRETFRET的生物学应用的生物学应用Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., (1999)（1）蛋白质的相互作用（2）检测蛋白

14、酶活性Zhang J. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol (2002)（3）钙离子浓度检测Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.,2002（4）蛋白质的构象变化Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.,2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴定 n活细胞内活细胞

15、内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET技术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n分泌酶在阿尔茨海默症（分泌酶在阿尔茨海默症（ADAD）的发生、发展中起）的发生、发展中起着重要的作用，是着重要的作用，是ADAD药物治疗的重要靶点；药物治疗的重要靶点；n发展检测发展检测分泌酶活性的技术和对分泌酶活性的技术和对分泌酶结构分泌酶

16、结构的了解对于药物的开发和筛选都具有重要意义；的了解对于药物的开发和筛选都具有重要意义；n然而传统的生化方法难以实现在活细胞生理条件下对然而传统的生化方法难以实现在活细胞生理条件下对BACEBACE的酶活性和结构的实时动态研究；的酶活性和结构的实时动态研究；n本文利用荧光能量共振转移（本文利用荧光能量共振转移（FRETFRET）光学成像技术，）光学成像技术，结合基因工程技术合成的结合基因工程技术合成的FRETFRET探针和荧光标记蛋白，探针和荧光标记蛋白，在活细胞水平检测了在活细胞水平检测了BACEBACE的活性及其二聚化结构。的活性及其二聚化结构。Briton Chance Center f

17、or Biomedical Photonics第一章： 绪 论第二章：构建用于检测-分泌酶活性的FRET探针及其鉴定第五章：总结及展望第三章：活细胞内-分泌酶活性的FRET成像研究第四章：利用受体漂白FRET技术研究活细胞内-分泌酶的二聚化论文结构论文结构Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴定 n活细胞内活细胞内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受体

18、漂白利用受体漂白FRETFRET技术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言nBACEBACE是是AA产生的关键酶，被认为是产生的关键酶，被认为是ADAD药物治疗的重要药物治疗的重要靶标；靶标； n为了筛选为了筛选BACEBACE的抑制剂，已发展了一些化学合成探针；的抑制剂，已发展了一些化学合成探针；n但是，这些化学合成的探针无法实现在体研究；但是，这些化学合成的探针无法实现在体研究；n通过基因工程技术，构建基于通过基因工程技

19、术，构建基于GFPGFP的可遗传编码的的可遗传编码的FRETFRET探针；探针；n利用荧光光谱扫描和利用荧光光谱扫描和SDSSDSPAGEPAGE对对FRETFRET探针的荧光特性探针的荧光特性和酶切效果进行体外分析，为利用和酶切效果进行体外分析，为利用FRETFRET探针在活细胞探针在活细胞水平检测水平检测BACEBACE活性提供依据。活性提供依据。 Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsNLDAFRETNLDA515nmBACE cleavingBSSFRETFRET探针检测探针检测 分泌酶的工作原理分泌酶的工作原理Briton Chan

20、ce Center for Biomedical Photonics技术流程技术流程探针的构建探针的构建质粒的鉴定质粒的鉴定表达和纯化表达和纯化光谱特性分析光谱特性分析实时检测实时检测BACE活性活性将YFPlinkerCFP构建到带His纯化标签的原核表达载体pET28a（）中所构建质粒通过酶切和测序鉴定将构建质粒转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导探针表达，纯化利用荧光光谱仪分析探针的荧光特性利用荧光光谱仪及SDSPAGE检测体外BACE对探针的酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics探针的构建探针的构建YcC：对照探针YCwt：野生

21、型BSSYCSweS：瑞典突变的短链BSSYCSweL：瑞典突变的长链BSSYCNFEV：NFEV突变的BSSBSS：BACE substrate site Briton Chance Center for Biomedical Photonics质粒鉴定质粒鉴定1234Briton Chance Center for Biomedical Photonics探针的表达和纯化探针的表达和纯化ABCYcCYCwtYCSweSYCSweLYCNFEVBriton Chance Center for Biomedical Photonics光谱特性分析光谱特性分析BACE酶切20 min后的FRET

22、探针的荧光比率值（527/477 nm）变化 FRET探针的荧光光谱，433nm激发 Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用Y Y C CNFEVNFEV实时检测实时检测BACEBACE的活性的活性 SDS-PAGE电泳分析BACE 对YCNFEV的酶切反应 利用荧光光谱仪检测BACE对YCNFEV的酶切反应。（A）YCNFEV的荧光光谱随酶切时间的变化；（B）YCNFEV和YcC的归一化荧光强度比率(527 nm/477 nm)随反应时间的变化 Briton Chance Center for Biomedical Photonic

23、s利用利用Y Y C CSweLSweL实时检测实时检测BACEBACE的活性的活性 利用荧光光谱仪和SDSPAGE电泳检测YCSweL被BACE的酶切过程 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小节本章小节n通过基因工程技术构建了五个基于通过基因工程技术构建了五个基于GFPGFP的可遗的可遗传编码的传编码的FRETFRET探针，包括对照探针探针，包括对照探针YcCYcC和和BACEBACE的的FRETFRET探针探针Y Y C Cwtwt、Y Y C CSweSSweS、Y Y C CSweLSweL、Y Y C CNFEVNFEV；n

24、利用荧光光谱扫描和利用荧光光谱扫描和SDSSDSPAGEPAGE凝胶电泳分析凝胶电泳分析比较了五种探针的体外荧光特性和酶切效果；比较了五种探针的体外荧光特性和酶切效果；n选择选择Y Y C CSweLSweL用于在活细胞水平下检测用于在活细胞水平下检测BACEBACE活性。活性。 Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴定 n活细胞内活细胞内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成

25、像研究成像研究 n利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET技术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言n虽然化学虽然化学FRET探针已经被广泛用于体外检测探针已经被广泛用于体外检测BACE的活性，但是这些化学合成的探针均不的活性，但是这些化学合成的探针均不能用于活细胞检测；能用于活细胞检测； n虽然已经清楚虽然已经清楚APP水解会产生水解会产生A，但是对于，但是对于A产生的亚细胞区域还不是很清楚；产生的亚细胞区域还不是很清楚；

26、n以前以前BACEBACE切割的证据通过免疫化学等传统生化切割的证据通过免疫化学等传统生化方法得到的，无法提供活细胞证据。方法得到的，无法提供活细胞证据。 Briton Chance Center for Biomedical Photonics实验流程实验流程真核表达探针真核表达探针的构建的构建探针在动物细探针在动物细胞中的表达胞中的表达活细胞水平检活细胞水平检测测BACE酶切酶切检测检测BACE在分在分泌途径的酶切泌途径的酶切将探针构建到真核表达载体pDisplay中，使其能进入分泌途径并表达在细胞膜上。dYC,displayed YC; dYcC,displayed YcC将质粒转染动物

27、细胞，用共聚焦荧光显微镜观察探针在细胞中的表达将探针质粒与BACE共转染HeLa细胞，利用三通道、光谱扫描、受体漂白FRET方法及Western blot方法检测BACE酶切利用受体漂白FRET方法检测BACE在内质网和高尔基体中的酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics真核表达真核表达FRETFRET探针的构建探针的构建Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsFRETFRET探针在动物细胞中的表达探针在动物细胞中的表达 共聚焦成像pDisplay载体中目标蛋白的表达 探针表达到细胞表面 B

28、riton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用FRETFRET探针检测活细胞中探针检测活细胞中BACEBACE的活性的活性 Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET和和Western blottingWestern blotting检测检测BACEBACE酶切酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用FRETFRET探针检测探针检测BACEBACE在分泌途径的酶切在分泌途径的酶切 利用受体漂白检测

29、内质网中BACE的活性 利用受体漂白检测高尔基体中BACE的活性 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小结本章小结n为了检测活细胞中的为了检测活细胞中的BACEBACE活性，构建了一个遗活性，构建了一个遗传编码的真核表达传编码的真核表达FRETFRET探针探针dYCdYC和对照探针和对照探针dYcCdYcC。该探针能够进入分泌途径，并展示在细。该探针能够进入分泌途径，并展示在细胞膜。胞膜。ndYdY C C可在活细胞中被可在活细胞中被BACEBACE有效酶切，可用于动有效酶切，可用于动态检测活细胞内的态检测活细胞内的BACEBACE活性

30、，为活性，为BACEBACE抑制剂的抑制剂的开发提供了一个活细胞筛选的平台。开发提供了一个活细胞筛选的平台。n利用该探针分析了利用该探针分析了BACEBACE在分泌途径中具备酶活在分泌途径中具备酶活性的起始位点，证实性的起始位点，证实BACEBACE早在内质网中就具有早在内质网中就具有酶活性，能够对其底物进行酶切。酶活性，能够对其底物进行酶切。Briton Chance Center for Biomedical Photonics提纲提纲n研究背景研究背景n研究目的、意义及主要内容研究目的、意义及主要内容n构建用于检测构建用于检测分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探针及探针及其鉴定其鉴

31、定 n活细胞内活细胞内分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受体漂白利用受体漂白FRETFRET技术研究活细胞内技术研究活细胞内分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n总结与展望总结与展望n主要创新点主要创新点n致谢致谢Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言nBACE的活性部位的活性部位,即截去跨膜序列的可溶性即截去跨膜序列的可溶性BACE (BACE-NT, 对应于氨基酸残基对应于氨基酸残基1-454), 已经被克隆和纯已经被克隆和纯化，广泛应用于体外化，广泛应用于体外-分泌酶抑制剂的筛选；分泌酶抑制剂的筛选；n在

32、基于可溶性在基于可溶性BACEBACE结构来设计抑制剂的过程中遇到了结构来设计抑制剂的过程中遇到了困难困难, , 因为其晶体结构中有一个异常的大缝隙；因为其晶体结构中有一个异常的大缝隙；n最近最近, Haass C., Haass C.小组利用非变性凝胶电泳和免疫共沉小组利用非变性凝胶电泳和免疫共沉淀的方法淀的方法, , 发现发现BACEBACE以同源二聚体的形式存在；以同源二聚体的形式存在；n本文利用本文利用FRETFRET技术在活细胞条件下无损伤地研究技术在活细胞条件下无损伤地研究BACEBACE的二聚化。的二聚化。 Briton Chance Center for Biomedical

33、Photonics实验流程实验流程FPs标记蛋白标记蛋白的构建的构建质粒的鉴定质粒的鉴定融合蛋白的表融合蛋白的表达和定位达和定位分别用CFP和YFP标记全长的BACE（BACEFL）和BACE的活性部分（BACENT）所构建的质粒经酶切和测序鉴定利用受体漂白FRET方法分别检测BACEFL和BACENT在活细胞中的存在形式二聚化检测二聚化检测利用共聚焦荧光显微镜分别检测BACEFL和BACENT在活细胞中的表达和定位Briton Chance Center for Biomedical Photonics质粒的构建质粒的构建PCR products of mCerulean or mCitri

34、ne Cleaved by XhoI and AgeILigated by T4 DNA ligaseBriton Chance Center for Biomedical Photonics质粒鉴定质粒鉴定1 2 3重组质粒的酶切鉴定电泳图谱。pBACE-FL/CFP的测序结果 Briton Chance Center for Biomedical Photonics荧光融合蛋白在荧光融合蛋白在HeLaHeLa细胞中的表达及定位细胞中的表达及定位 转染24小时后 BACE-FL和BACE-NT在HeLa细胞的表达。（A） pBACE-FL/CFP 和pEYFP-ER共转染的HeLa细胞；（B

35、） pBACE-NT/CFP和 pEYFP-ER共转染的HeLa细胞。 Briton Chance Center for Biomedical Photonics受体漂白受体漂白FRETFRET检测检测BACEBACE二聚化二聚化 利用apFRET检测BACEFL的二聚化 利用受体漂白检测BACE-NT/CFP和 BACE-NT/YFP之间的FRET效率 Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用公式EF= (I-I) 100 /I计算FRET效率（EF）(n16)。BACE-FL组与对照组存在显著差异（* *P0.05). Control，

36、单转染pBACE-FL/CFP的细胞；BACE-NT， pBACE-NT/CFP和 pBACE-NT/YFP共转染的细胞；BACEFL，pBACE-FL/CFP和 pBACE-FL/YFP共转染的细胞 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小结本章小结n基因工程技术分别构建了基因工程技术分别构建了CFPCFP和黄色荧光蛋白和黄色荧光蛋白YFPYFP标记标记的全长的全长BACEBACE（BACE-FLBACE-FL）和）和BACEBACE活性部分活性部分(BACE-NT)(BACE-NT)； n应用共聚焦荧光显微镜和受体漂白应用共聚焦荧光显

37、微镜和受体漂白FRETFRET技术研究了技术研究了BACE-FLBACE-FL和和BACE-NTBACE-NT在细胞中的表达和定位，以及它们在细胞中的表达和定位，以及它们在活细胞内的存在结构；在活细胞内的存在结构；nBACE-FLBACE-FL能够定位到高尔基体、质膜、内体等细胞器中，能够定位到高尔基体、质膜、内体等细胞器中，而而BACE-NTBACE-NT则被滞留在内质网里；则被滞留在内质网里；nBACE-NTBACE-NT是单体结构，而是单体结构，而BACE-FLBACE-FL在活细胞内则以二聚在活细胞内则以二聚体的形式存在；体的形式存在；n证明证明BACEBACE的跨膜序列和的跨膜序列和

38、C-C-末端对末端对BACEBACE的转运和定位具的转运和定位具有重要作用，其二聚体结构由这些序列决定，而不由有重要作用，其二聚体结构由这些序列决定，而不由酶的活性位点决定酶的活性位点决定 Briton Chance Center for Biomedical Photonics总结和展望总结和展望n构建了构建了5 5个荧光探针：个荧光探针：YcCYcC、Y Y C Cwtwt、Y Y C CSweSSweS、Y Y C CSweLSweL、Y Y C CNFEVNFEV，并在体外分析了其荧光特性和酶切效果；，并在体外分析了其荧光特性和酶切效果； n构建了能进入分泌途径的真核表达构建了能进入分泌途径的真核表达FRETFRET探针探针dYdY C C，dYdY C C可在活细胞中被可在活细胞中被BACEBACE有效酶切，可用于实时检测有效酶切，可用于实时检测活细胞中的活细胞中的BACEBACE活性，为活性，为BACEBACE抑制剂的开发提供了一抑制剂的开发提供了一个在体筛选的平台；个在体筛选的平台； n利用利用dYdY C C探针分析了探针分析了BACEBACE在分泌途径中的活性，证实在分泌途径中