显微镜基础知识

1、目 录1. 显微镜基础知识11.1 显微镜成像原理11.21.31.41.51.6显微镜总放大率1显微镜的有效放大率1显微镜鉴别率1显微镜的景深2光学系统的成象缺陷(象差)2zzzzzzz球差2彗差3象散3场曲4畸变4位置色差4放大色差52. 显微镜主要部件52.1 物镜52.2 目镜92.3 双目(或叁)目镜筒102.4 支架组112.5 粗微调焦装置122.6 机械工作台122.7 照明系统123. 显微镜的使用143.1 对工作环境的要求143.2 操作步骤143.3 光学系统的清洁153.4 图像欠佳分析17几种特殊的观察法184.暗场观察法18相衬观察法20偏光观察法23微分相衬观察

2、法27荧光观察法28调制对比观察法34介绍36BME36DME39DMLS434.14.24.34.44.54.65.5.15.25.32显微镜基础知识显微镜成像原理显微镜的光学成象系统由两部分组成,靠近物体部分的透镜组称为物镜;靠近眼睛的透镜组称为目镜。物镜组把物体成象在目镜前焦面上,形成一个放大倒立的实象,它称之为中间象,然后由目镜组再次放大供目视观察。图中：1. 物体4. 目镜2. 物镜5. 眼睛3. 中间像显微镜总放大率：M=×式中：M：显微镜总放大率：物镜放大率：目镜放大率即,显微镜总放大率=物镜放大率×目镜放大率显微镜鉴别率显微镜鉴别率是指刚能=0.61/A式中

3、：物平面两点的最小距离,则： 光波波长 （通常=0.00055mm）A ：物镜数值孔径 NA可见 ,鉴别率取决于物镜的数值孔径。显微镜的有效放大率M 有效500AM 有效1000A满足此式的放大率就称有效放大率。若总放大率 M<500A,说明显微镜的鉴别率没有充分利用。物镜虽能分辨物体的细节,但人眼仍无法看清.反之,M>1000A,说明无效放大,原来看不清的细节,过分放大后。还是看不清。1物镜4/0.1010/0.2540/0.65100/1.25鉴别率3.361.340.520.27显微镜的景深 DF景深表示,象平面上清晰的象所对应物平面的前后空间的深度。DF1/7AM +/2A

4、2式中：DF ：景深A : 数值孔径 NA M ：总放大率:光波波长,:mm例: 用 10×目镜观察:mm光学系统的成象缺陷(象差)1. 球差位于正透镜的光轴上一点发出一根与光轴成最大角度 Um 的光线,经正透镜汇聚后与光轴交于 M 点,仍由此点发出一根与光轴无限接近的光线,经正透镜汇聚后与光轴并不交于 M 点,而交于 O 点。O 点到 M 点的距离 LAm 称为边光球差。仍由同一点发出一根于光轴成 Uz 角的光线,经正透镜汇聚后交于 Z 点,O 点到 Z 点的距离LAz 称为带光球差。由计算知,单个正透镜产生的球差恒为正,即 LA>0。反之单个负透镜产生的球差恒为负。所以,单

5、独一个透镜不可能校正球差,至少由正,负透镜组合起来才有校正球差的可能性。若在 O 点处置一屏,则在屏上得到一个弥散斑,当屏沿着光轴移动在 M,Z 之间,将得到最小弥散斑,但始终不能成为一个几何象点。因此,象平面上的图形是由无数个弥散斑组成,象就变得模糊不清,故任何光学系统必须要校正好球差。2物镜4x/0.110x/0.2540x/0.65100x/1.25景深 DF0.0630.01010.00120.000292. 彗差位于光轴外一点发出三条光线,最边缘的两根光线的交点,并不位于中心光线上。使光束失去对称性。从光能传输的观点来说,中间中心光线处的能量最集中,亮度最亮。边缘光线处 能量扩散,相

6、对地较暗,形成彗星状的弥散斑,使物体细节不能看清,破坏了轴外视场清晰度。3. 象散若只考虑中心光线附近的无限细光束,这样彗差就不存在了。但是,如此细的光束还存在另 外两种象差:象散和场曲。当轴外点中心光线经有象散的光学系统时,在象空间用一屏沿着光轴移动,在位置 1,成象光束截面为上下扁的椭圆；移到位置 2 时,为一水平短线；在位置 3 时,又成为上下扁的椭圆；在位置 4 时,形成一个园斑；在位置 5 时,形成左右扁的椭圆；在位置 6 时,形成一垂直的短线；在位置 7 时,又扩散成左右扁的椭圆.这就是象散现象.位置 2 到位置 6 的距离为象散值。假想物体图案为十字线,则在位置 2 和位置 6

7、的图像如下：位置 2位置 6位置 2 时,垂直线模糊；位置 6 时,水平线模糊。3象散将一个物体形成二个象面,在各个象面上不同方向的线条清晰度不同。象散严重时,轴外点得不到清晰的象。4. 场曲轴外物点成象存在象散。这个数值随着轴外点远离光轴,象散值也随着增加,而轴上点无象散。所以一个平面物体必然形成二个象面,而且二个象面是曲面同时相切于轴上点,这就是场曲现象。光学系统存在着严重场曲面时,就不能使一个较大的平面物体上各点同时清晰成象。当把中心调焦清晰,边缘四周就变得模糊； 反之,边缘四周调焦清晰,则中心变模糊。5. 畸变轴外点宽光束存在彗差,细光束存在象散和场曲,但即使只有一根中心光线,由于各个

8、轴外点的放大倍数均不相同,于是产生了畸变,畸变不会影响成象的清晰度,但使象变形。如一个网格板,经有畸变的光学系统成象后,将得到枕形或桶形畸形。6. 位置色差显微镜往往使用白光观察,而白光是由不同波长的色光组成,光学玻璃对不同波长的色光折射率也不同,波长越短折射率越高。因此,不同色光有不同的焦距和像距。蓝光(F)折射率最高,透镜会聚能力越强,所以像距最短,反之对红光(C)透镜会聚能力最弱,像距最长。蓝光象距与红光象距之差称为位置色差。由于位置色差使轴上物点不能成为一白光点而4成为彩色的弥散斑,使象模糊。当光学系统校正了二种色光,如 F, C的色差,即两象点相重合时称为消色差光学统。但白光由许多的

9、色光组成,仅校正二种色光后,第三种色光如黄绿光 e 的象点与 F,C象点仍有位置差异,这种差异称为二级光谱。若光学系统对三种色光的象点校正在一起,这种系统称为复消色差系统。此时,其余波长的色差将会降低到无害的程度。7. 放大色差与位置色差同样原因。对于轴外点,由于多色光的放大率不等,不同色光的象有不同的高度。这种现象称为放大色差。如左图,象的最高点会呈现蓝色镶边。放大色差严重时, 物体的象有彩色边缘,破坏轴外点的清晰度。F：蓝色光e ：黄绿色光C: 红色光显 微 镜 主 要 部 件l 物镜按象差校正程度分类： 1消色差物镜它校正了球差,彗差和二种色光的位置色差。此类物镜存在严重的轴外象差,特别

10、是场曲。对18mm 中间象而言(以下同),成象的清晰范围约 50%,即视场中心调节清晰后,边缘象模糊不清,反之,边缘象调节清晰后,视场中心象模糊不清。物镜外壳无特殊标记。徕卡的 BME 及 DME显微镜的物镜就属此种类型中间清晰,边缘模糊2平视场消色差物镜中间模糊,边缘清晰5它在消色差物镜基础上,还校正了象散和场曲,象面平坦。清晰范围不低于 90%。物镜外壳刻有 PL 或 PLAN 字样。的目录中,N PLAN 物镜就属于此类物镜。3平视场复消色差物镜它在平视场消色差物镜的基础上,还对第三种色光校正了位置色差,这种物镜成象质量最佳,其数值孔径也较同倍率物镜大。因此,鉴别率也最高。物镜外壳刻有

11、Planapo 字样,录中 PLAPO 就是此类物镜。目4半平视场消色差物镜这类物镜的清晰范围介于消色差物镜与平视场消色差物镜之间,但明显优于消色差物镜。接近平视场消色差物镜。其外壳常刻有 SP(Semi.plan)字样。高倍物镜属于此类。的目录中 C PLAN 的中,6目前的趋势似乎很多厂商不认可这种分类。把他们并入消色差物镜中,作为新颖的或优化的消色差物镜如：CME 中, AchroE2 就是此类物镜。5.平视场半复消色差物镜色差的校正程度介于平视场消色差物镜与平视场复消色差物镜之间。但较近于平视场复消色差物镜。目录中的 PL Fluotar 就是这类物镜。按筒长分类1筒长有限远物镜的共轭

12、距离(物到象的距离)为 195mm,物镜的机械筒长(物镜螺纹端面到目镜支承面)为160mm。中 BME,CME 采用此类物镜。2筒长无限远7物镜把物体成象于无限远, 因此, 必须要有镜筒透镜将无限远的光线聚焦到目镜焦面上才能观察。中 DME,DMLS,DMLB 等均采用此类物镜。此类物镜的突出优点是,在物镜与镜筒透镜之间可方便地置的变化。各种附件,而引起成象位物镜外壳的标记40/0.65160/0.1740： 有限远物镜,放大率为 40 倍0.65：数值孔径 NA160： 机械筒长 160mm0.17：盖厚度N PLAN 40x/0.65/0.17N PLAN：平视场消色差40x：0.65:

13、0.17:无限远物镜,放大率为 40 倍数值孔径 NA筒长无限远竖厚度C PLAN 63x/0.75/0.17C PLAN: 半平视场消色差物镜63 x:无限远物镜,放大率为 63 倍N PLAN5x/0.12/N PLAN: 平视场消色差物镜5 x:0.12:无限远物镜,放大率为 5 倍数值孔径 NA对有无盖玻片无要求PLAPO/0100x/0.95PLAPO: 100x:0.95:O:平视场复消色差物镜无限远物镜,放大率为 100 倍数值孔径 NA无盖盖厚度对成象质量的影响8放大率1 1.251.622.5 3.24 56.3810 12.51620253240506380100,125,

14、160颜色黑灰棕红橙黄淡绿深绿淡蓝深蓝白当物镜的数值孔径大于 0.65 时,盖厚度误差对于物镜的成象质量影响十分明显。设计时,盖厚度采用标准值 0.17mm。用高倍率物镜观察时,盖片厚度误差最好在+/-0.01mm 之内。下图为普通带有片的物镜在两种情况下观察的结果有盖玻片时的图像无盖玻片时的图像l 目镜按放大色差校正状况可分为消放大色差目镜和补偿目镜。补偿目镜放大色差为 11.5%。以补偿物镜残留的放大色差。通常,补偿目镜的视场光阑四周带特有的黄色。对于筒长有限远的物镜,常与补偿目镜配合使用，如：BME 等。对于筒长无限远的物镜,若镜筒透镜具有补偿放大色差功能的,则与普通目镜配合使用，如：

15、DMLS,DMLB。若镜筒透镜无补偿色差功能的。则必须与补偿目镜配合使用，如：DME。按目镜视场数可分为：非广角目镜, 广角目镜,超广角目镜等。对于 10 X 目镜而言,视场数<18，常称为非广角目镜。视场数18,常称为广角目镜。 视场数>20, 常称为超广角目镜。目镜外壳标记10X/2010： 放大率20: 视场数9各类目镜l 双目(或叁)目镜筒按机械结构可分为滑板式双目镜筒和铰链式双目镜筒。1 滑板式双目镜筒优点: 用偏光观察时,改变瞳距暗的变化。产生光线或明或缺点: 改变瞳距时,左,右目镜管的刻度值必须与瞳距值相等,否则会破坏显微镜的齐焦。采用此类镜筒。的 BME,CME10

16、铰链式双目镜筒优点: 改变瞳距时,显微镜的齐焦性能不变缺点: 若用于偏光观察,分光膜必须具有消偏振性能。按目镜的倾斜角可分为 30°,45°及符合人机工程学倾斜角可变的双目镜筒。倾角 30°的双目镜筒DME,DMLS,DMLB 等采用此类镜筒。无论哪一种双目镜筒都必须满足下列要求 由两个目镜射出的光轴必须平行。通常认为,发散度<60会聚度<30上下差<20倾角 0°35°可变的双目镜筒但的远远小于上述数值。明显的颜色差。 明显的亮度差。明显的象偏转。左右视场不左右视场不左右视场不左右两系统放大率差2%。叁目镜筒仅仅用转向分光镜

17、代替转向棱镜,以便引出一条光路连接照相及 CCD 等附件11z支架组支架组由支架,粗微调焦,机械工作台,转换器及照明系统,见下图：支架是整个显微镜的基座,所有组件都要安装其中,它必须有足够的刚性,不致因组件定量的扭力矩象。,出现时松时紧不良现过多而引起变形。支架精度必须严格保证,确保各组件间相互关系满足预定的要求。的所有显微镜,无论低档,中档还是l 照明系统位于工作台下方的透镜组称为聚光镜,位于灯泡附近的透镜组称为集光镜。由聚光镜,高档显微镜,支架是其与众不同的特点,体现了先进的设计思想和高精度的机械完美结合。反光镜及集光镜等1聚光镜:了显微镜照明系统。聚光镜的作用是将光源发出的光线形成一束与

18、物镜数值孔径相适应的光束,均匀地照明标本片。由于各个物镜的数值孔径不同,要求照明光束的孔径角也相应的变化,因此,聚光镜中必定有一个能连续改变照明孔径角的可变光阑,此光阑称为可变孔径光阑。可变孔径光阑的功能及正确使用：可变孔径光阑的大小除了会改变图像的亮度外,还直接影响到图像的鉴别率,对比度和景深.其结果为下图所示.l 粗微调焦装置粗微调采用行星式结构,再配上硬度,光洁度出众的三角等轨和滑板,使调焦具有较高的灵敏度且有永不下滑的自锁功能。l 机械工作台工作台台面平面性好,利用同轴手轮可作X,Y 向移动,传动平稳舒适。手轮的长短充分考虑的人机工程的需要。凡是传动手轮应有12孔径光阑完全打开图像整个

19、对比度降低2/33/4图像对比度增加,鉴别率充分展现1/3景深增加,但由于衍射致使图像鉴别率受到影响如何正确调节孔径光阑大小?把标本像调节清晰后, 把可变孔径光阑关小,取出目镜,肉眼距目镜筒口约 100mm 处直接从目镜筒中观察物镜末端的通光孔,边观察边打开孔径光阑,直至孔径光阑象(多边形)为物镜通光孔的 2/33/4, 见图示:聚光镜分为干,湿两种。所谓“ 湿”即使用时需滴上浸液.这类聚光镜 NA,自 1.21.4。“干”使用时不需滴浸液,NA 常为 0.9。还备有干,湿两用的聚光镜，NA 0.9/NA 1.25。数值孔径为 0.9 的聚光镜与孔径为 1.25的 100 倍油漆配合使用,其鉴

20、别率会否降低？12由上所述,1.25*3/4=0.94,NA0.9 干聚光镜正好与之相适应,也免去操作者滴油及清洁的麻烦。对于特别追求鉴别率的场合,则应采用湿聚光镜,使用时,应在载玻片与聚光镜上表面滴上相应的浸液。临界照明是指灯丝成象在标本面上或其附近。这样，光能得以充分的利用。即使小功率的光源，也能给出足够的亮度。但其照明均匀性欠佳必须通过在照明光路中，才能满足使用的要求。磨砂库勒照明是一种较为完善的照明方式，严格的库勒照明必须符合下面三个条件： 照明均匀，灯丝像常在聚光镜的前焦面上，通过聚光镜以平行光束照明标本。 孔径光阑大小可任意改变，以适应不同倍率物镜的需要。 具有可变的视场光阑，以适

21、应不同倍率物镜的不同照明范围需要。视场光阑的功能及其正确使用：视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成象在 标本面上。所以在目镜中看清标本的同时也 能看到视场光阑多边形图像。可变视场光阑 的像应外切于目镜中的视场光阑,使光线只能照明需观察的标本，尽可能减少标本四周的散射光。的 BME 采用临界照明。DME 采用临界照明也可采用库勒照明。DMLS，DMLB 采用库勒照明。2集光镜集光镜的作用是把光源射向四周的光线聚焦，把灯丝象成到聚光镜中，使聚光镜能起到改变灯丝大小的作用。照明方式常见的照明方式，有临界照明和库勒照明两种.显微镜的 使 用对工作环境的要求： 室温：5

22、°30由于浸液的折射率会随着温度的变化而发生改变，使用油镜时，为了得到理想的象操作步骤：1. 接通电源，放置好标本。2. 先用 10×物镜，将标本象调焦清晰。3若目镜筒观察：质，室温最好在 22251）滑板式双目镜筒 湿度：相对湿度 4585 振动小。显微镜最好能安放在防震的工作台上，否则，用油镜观察时，图像常处于抖动状态。 环境清洁。a.推动连接目镜筒的滑板，调节双目镜筒瞳距，使左右视场的图像和而为一，并且取瞳距值。14b.转动左（或右）目镜筒视度圈，使其指示值与瞳距值相等。用此目镜筒观察，精确调焦使图像清晰。用另一眼睛及另一目镜筒观 察，转动此目镜筒视度圈使此眼也能同时

23、看清图。（注意：不能使用调焦机构调焦。）光镜调中螺钉，使可变视场光阑居 中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。C.拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦 面，调节可变孔径光阑，使可变孔径 光阑的大小为物镜通光孔的 2/33/4,目镜观察。注：转动转换器改变物镜倍率后，还应拔出目镜，调节可变孔径光阑大小。c.d.注：若瞳距值与某一目镜筒指示值不等，则会影响显微镜齐焦性能。若被观察的标本，本身对比度很低， 即使按上述步骤操作后，图像对比度仍很低。此时,可关小可变孔径光阑,用牺牲鉴别率来提高图像对比度。反之,被观察的标本对比度很高,为追求鉴别率,可适当开大可变孔径光阑(改为物镜通光孔的 90100

24、)。2） 铰链式双目镜筒a. 用固定目镜筒观察，调焦，使图像清晰。b. 扳动铰链，使左，右视场的图像合二为一。c. 转动另一目镜筒视度圈，使另一眼睛同时能看到清晰的图像。4. 若用库勒照明：a. 关小可变视场光阑b. 上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中。可见，调节聚光学系统的清洁清洁剂用 7080%乙醚+3020% 清洁工具配成混合剂吹气球柳条棒,牙签或棒脱脂棉花,纱布或擦镜纸放大镜(用目镜倒置也可)目镜上的灰尘用吹气球吹手指印,唾沫,油脂,用清洁剂擦拭。对小面积的光学元件,用牙签卷纸棉花,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭,见图:15对大面积的光学元件用脱脂纱布或擦镜纸滴上

25、清洁剂,由中心向外,按螺旋形运动方向轻轻擦拭。清洁完毕用放大镜检查:油浸物镜的清洁浸液物镜用毕后,必须及时清洁,否则,浸油在物镜表面会凝结成硬膜,使物镜失去而无法使用。由于浸液物镜最前端通光极小(<2)必须用牙签卷上脱脂棉蘸上混合剂多次擦拭.用放大镜仔细检查,通光孔四周是否残留的浸液否则会减小物镜的数值孔径,影响物镜的正常功能。16DME 及 DMLS 等显微镜配用的浸液物镜。由于孔大, 深度浅,只需用擦镜纸蘸上清洁剂,用手指轻轻擦拭就能除去浸液.DME,DMLS 浸液物镜前端示意图图像欠佳分析17现象措施用 40×物镜成象模糊经常与 100 倍油镜同时使用,物镜前端不沾上浸油

26、用棉花签,清洁剂,清除浸油物镜前端有指印或其它脏东西用棉花签,清洁剂清除标本上无盖玻片或盖玻片太厚改用 0.17 厚度的盖玻片聚光镜可变孔径开得太大将可变孔径光阑大小打开为物镜的2/33/4长期未使用,储存又不当, 物镜内镜片发雾,生霉送工厂修理物镜前透镜沾有腐蚀性液体,未及时清除,使镜片失去送工厂修理物镜内部渗入浸油送工厂清除浸油物镜不跌落,各透镜中心走动送工厂清除浸油用 100×物镜成象模糊没有使用浸油滴上浸油没有使用规定的浸油用规定浸油浸油中气泡未排除在物镜工作位置上,利用转换器多次正反向转动,排除气泡室温与浸油标准温度(23 左右)相差太多,以致油折射率发生变化调节室温放置显

27、微镜,工作台或工作环境振动太大,以致图像抖动不停减少振动,或远离振动源标本切片太厚标本厚度 23u 为佳物镜前端镜片残留的的浸油用棉花签,清洁剂反复清除几种特殊的观察方法暗视场观察法暗视场观察法可以通常的动植物组织切片、血液图片、硅藻片,但在观察透明的活体标本方面如含有细菌的液体更显出其优越性。值得指出的是,它还能观察到小于物镜分辨率本领的微粒。这些微粒在的背景中以亮点形式出现，使观察者能观察到它们的存在和移动。有人称此为超显微术。要实现暗场效应,最简单的方法是在普通的阿贝聚光镜下方小孔径角大于物镜数值孔径即可。左图为暗场观察法的光学原理图。图中：1. 环形光阑2. 阿贝聚光镜3. 物镜一块环

28、形光阑,使照明的最集光镜射出的光束,经暗场环形光阑后以环状光束射向阿贝聚光镜,然后以环状的光锥照明标本,光锥最小角度即照明孔径角，它必须大于物镜的数值孔径。如果标本片内无任何东西,那么,照明光线不可能进入物镜,视场内漆黑一片。反之,标本片内存在某些东西如细菌等微粒，那么由于光的衍射与散射作用，这些光线就进入物镜并成象， 视场内将看到漆黑的背景中存在许多明亮的标本象。用插片方式实现简易暗场,价格低廉,但只能与放大率40x 的物镜配合使用。由于阿贝聚光镜内的杂散光及色差等因素视场背景难达到完全漆黑的程度。18显微镜总放大率过大,成无效放大总放大率在 1000NA 内物镜内部渗油送工厂清除内部浸油操

29、作不当,变换倍率时物镜前组碰歪送工厂修理要达到理想的暗场效果,最好采用的暗场聚光镜。这种聚光镜有干燥型,浸液型之分。干燥型暗场聚光镜有几种形式,它们的共同点是在一个透镜上有多个球面,其中两个是反射面,其余面是折射面,光束经过它们后,最小照明孔径约在 0.750.78 之间。因此,与倍率40倍物镜匹配可以获得很好的效果。下图为二种干燥型暗场聚光镜：浸液型暗场聚光镜由两个相同材料的透镜胶合而成。加上浸油后,最小照明孔径约 1.22。适合与 100 倍油浸物镜配合使用,注意:物镜中必须带有可变孔径光阑,能减少物镜的数值孔径。否则,部分照明光束将直接进入物镜而破坏暗场效果。其光学原理如下图：注意: 浸

30、液型暗场聚光镜使用时必须在载玻片与聚光镜间滴上浸油。 这种聚光镜还能与干燥型物镜配合使用。特别是高倍率的干燥型物镜,能取得很好的效率。其缺点是照明范围较小,因此与低倍率物镜,特别是 4 倍物镜,只能在视场中心部分可以进行暗19场观察，而四周无光线照明,呈现一片。暗场效果的好坏与使用时聚光镜的调节有很大关系。举简单暗场调节实例：标本上放置一半透明纸。打开可变孔径光阑,升降带有暗场插片的聚光镜,使半透明的纸上呈现明亮圆形的光斑。调整聚光镜对中螺钉,使照明光轴与物镜光轴重合,此时视场背景应均匀。常见故障20现象纠正措施视场中一片漆黑可变孔径光阑未打开浸油暗场聚光镜未滴油照明光斑呈环形,中心载玻片太厚

31、打开孔径光阑在载玻片与浸油暗场聚光镜之间滴上浸油上下调节聚光镜使光斑呈圆形对于暗场聚光镜,由于工作距离较短,载玻片厚度严格在 11.1mm 之间背景中出现许多点状亮点或划痕载玻片及盖玻片上灰尘， 麻点，划痕成象载玻片两面不有划痕, 麻点,灰尘(包括盖玻片表面)必须保持清洁透明视场背景很亮100 倍油镜物镜中无特殊的可变孔径光阑100 倍物镜中孔径光阑未关闭至 NA=1 附近100 倍物镜使用了干燥型， 暗场聚光镜聚光镜光轴与物镜光轴不重合选用带有可变孔径的100 倍油浸物镜关小可变孔径光阑改用浸液型暗场聚光镜调节聚光镜对中螺钉视场背景暗度不均匀暗场环形光阑中心与聚光镜光轴不同轴,使照明光斑非圆

32、形聚光镜光轴与物镜光轴微量编差送工厂校正调节聚光镜对中螺钉用低倍物镜(如 4 倍)时,视场中心有图像,但四周使用浸油暗场聚光镜改用干燥型暗场聚光镜相衬观察法相衬观察法用来观察无色透明或不染色的标本。因为人眼只对亮暗,颜色有识别能力。而这些无色透明的,除了折射率与周围介质不同而引起位相的不同外,其亮度与周围介质的亮度完全一样。所以用普通的明场观察无法察觉到这些透明体的存在。如下左图表示光线透过上述的标本。光与电磁波一样也是以波动的形式存在。我们用一正弦波来描述。波峰值称为振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。下图中的 1 表示,透过周围介质的正弦波。3 表示光线透过标本时产生的衍射光，它的能量很弱

33、(图中已夸大了)。2 是曲线 1 与曲线 3 迭加的波形。因此,曲线 1 表示观察背景光的亮度,曲线 2 表示标本成象的亮度。可见曲线 1 与曲线 2 波形相同,仅仅位相不同而已,这就是明场观察所得的效果。成象光与背景光同样亮度。人眼无法察觉透明体的存在。我们设法将直射光 1 的位相改变 90°(超前或滞后).如下图,直射光 1 与衍射光 3 位相差180°.那么,波形 2 与波形 1 相比振幅略有改变,但还不足以达到满意的程度.21如果,我们设法将直射光 1 的能量衰减 75%。如下图,那么波形 2 将与横坐标重合(为了识别,图中故意夸大),与波形 1 有明显的差别。观察

34、的效果是,在较暗的背景下,看到黑色的透明体， 这就是相衬观察法。因为相衬板的膜层厚度根据绿光(e 光)镀制的,使用时应用绿色滤光照明。左图为实现相衬观察法的光学原理图。图中：1. 环形光阑2. 聚光镜3. 物镜4. 相衬板通过环形光阑的光束称为直射光。环形光阑常位于聚光镜的焦面上,光束经聚光镜后以倾斜的平行光束照明标本。再经物镜后,使环形光阑的象成在相衬板上。相衬板上镀有改变位相及减弱光能的膜层,它也是环状的,但其比环形光阑的象稍大。相衬板的环形必须完环形光阑的象(偏心),见图示,换句话说,也就是通过环形光阑的直射光,只能从环状相衬板中通过。不从环状相衬板外通过。公司有简易相衬装置与标准相衬装

35、置之分。所谓简易相衬装置由普通聚光度环形光阑插板,相衬物镜及绿色虑光片组成。不同倍率的相衬物镜必须与不同的环形光阑配合使用。未对中对中良好22相衬物镜倍率10 倍及 20 倍40 倍100 倍环形光阑插板代号Ph1Ph2Ph3由于离开公司前,环形光阑的中心与相衬环中心已校正好,因此,不再配对中望远镜。标准相衬装置由转盘聚光镜,相衬物镜,绿色滤光片,对中望远镜及二个六角螺钉扳手组成。转盘聚光镜带有五个园孔,内置 ph1,ph2,ph3 三种环形光阑,一个暗场环形光阑 DF 和一个用于明场物镜观察的通孔。通过二个六角螺钉扳手可以对四个环形光阑进行调中。对中望远镜目镜管可以观察到环形光阑图像与环形相

36、衬板对中状况。转盘聚光镜我们上面所介绍相衬图像比背景光暗,称为正相衬,反之,图像比背景明亮称为负相衬。 需要指出,相衬物镜可以作为普通的明场物镜使用,只是由于能量分布的改变,以及杂散光的增加,图像对比度稍逊一些。相衬图片偏光观察法偏光观察法主要用来研究各向异性材料的一些特性。偏光显微镜与生物显微镜的主要区别在于具有偏振元件、波片、补偿器及勃氏镜等特殊组件。偏振元件：自然光通过某个光学元件后转换成某种形式的偏振光，这种元件称为偏振元件。更确切的说，应称为起偏振器。常用的起偏振器可用来使自然光转换成直线偏振光。它们是利用反射与折射，双折射和二向色性（或称选择吸收）的原理制成的。23利用反射与折射产

37、生偏振光的元件由片堆组成；利折射产生偏光的元件由两块晶轴方向不同的晶体棱镜胶合而成。这两种方造成本比较高。最常用的则是利用二向色性材料产生偏振光。例如：把一片清洁的聚乙烯醇薄膜浸在碘溶液里，在较高的温度下拉伸，取出后烘干制成偏振薄膜，把其胶合在两块平行度都较好的薄玻璃中，就成为了一块偏振片。下图形象地表示了自然光转换成直线偏振光的示意图：同样的偏振片所处的位置不同名称也不同，如处于聚光镜前面的称为起偏振片，用来产生偏振光。位于物镜和目镜之间的称为验偏振片，用于分析偏振光。双折射各向异性材料，如：晶体，它们都具有双折射性能。光线射入的晶体，除了同晶体的晶轴（常称为光轴）同方向的光线不发生双折射外

38、，其余方向的光线均产生双折射现象。如左图：一根光线垂直射向晶体表面进入晶体后分成两根光线其中一根光线方向不变，垂直晶体另一表面射 出，称 O 光；另一根光线在晶体第一表面就发生折射，然后仍垂直晶体另一表面射出，称为 e 光。这就是双折射。同样，入射光线倾斜入射晶体，也会产生双折射。 常常将 O 光，e 光的折射率差（n0-ne）作为双折射的光量量度。若晶体厚度为 d， 则（n0-ne）d，称为光程差。左图为偏光显微镜的原理图：图中：1起偏振片2. 聚光镜3. 标本244物镜5. 验偏振片6. 目镜自然光经起偏振片后以直线偏振光射向聚光镜并照明标本。若此标本是各向异性的物体，那么每根偏振光经过标

39、本后就会产生双折射而变成两根光线，它们再经物镜及验偏振片后不是单一的各向异性物体，那么标本各部位具有不同的光程差，于是涉色。成像。如果这个标本像各处呈现不同的干由色可推知光程差，若晶体厚度已知的话，则进一步推算出双折射（n0-ne），于是可以确定标本是什么材料。起偏振片与验偏振片的透射轴常常互为 90º放置（正交），如果标本是各向同性材料，则视场中漆黑一片。如果标本是各向异性材料，那么视场将会变亮，转动其中一个偏振片，使之再次变暗，从转动角度可以推知标本属于何种旋光特性材料。波片：波片是使光波经过它们后能对两个相互垂直方向的振动增加一个固定的位相差。位相差为1/4称为 1/4 波片，

40、位相差为 1/2称为 1/2 波片，位相差为称为全波片。这些组件中常常标志出快轴的方向。所谓快轴是指光波沿着快轴射率最低。与快轴互为垂直的是慢轴，该方向的折射率最高。得快，因此该方向的折1.1/4 波片1/4 波片常把直线偏振光转换成圆偏振光。当入射的直线偏振光振动的方向与波片的快轴成45 度时，转换成圆偏振光。其余角度为椭圆偏振光。见下图，252.1/2 波片1/2 波片是使直线偏振光的振动方向改变。例如，当直线偏振光的振动方向与 1/2 波片的快轴为 90 度时，则位相差改变为 180 度，振动方向转动了 90 度。见下图：3.全波片在生物标本中，有时双折射很弱，色常处于黑与灰黑之间，不足

41、以区分。实验证明，当光程差在 0.50.6 微米之间，色变化最灵敏，这种场合下，可全波片，让其附加 0.56 微米的光程差。使色艳丽地呈现出来。26补偿器：补偿器与波片的区别是前者相位差能连续可变，后者则是固定不变。补偿器可用两个光轴平 行的石英楔和一个与石英楔光轴垂直的石英平板组成。利用测微鼓轮可以移动一个石英楔，由此改变位相差。勃氏镜：勃氏镜是将物镜的后焦面成像在目镜的焦平面上，供目视观察物镜后焦面的设计成根据需要可以方便地移入光路中或移出光路。图样。它偏光显微镜除了具备上述特殊组件外，对生物显微镜中原有的光学组件还有特殊要求。物镜：物镜是由许多各向同性的光学组成。如果这些存在内应力，或者

42、有外界施加的机械力（如包边，胶合等），就会产生双折射，（应力）。破坏了正交的偏振状态，所以，物镜必须消除应力，物镜外毂上刻有 Pol 标记以示区别。聚光镜：与物镜一样，必须消除应力。工作台：使用时，由于物体常需绕物镜光轴旋转，因此采用圆工作台，其四周带有 360 度等分的精确刻度，格值为 1 度，还带有游标读数，以提高读数的精度。旋转时，物体必须仍在目视视野中，工作台的旋转中心跳动量必须在 35 微米内。有时为了精确计算出光程差，物体的移动量必须高精度地度须有定量指示。因此，对 X.Y 向移动的精转换器：物体应位于物镜的光轴上，这样才能保证物体移动时必须可调，越出视场。因此转换器孔的中心双目镜

43、筒：对于铰链式双目镜筒其分光膜必须具有消偏振特性，这样才能保证改变瞳距时，左右镜筒中的图像的颜色和亮度不变。目镜管带有连构及限位装置，改变瞳距时确保目镜分划板的水平线位置不变。目镜：带有十字分划板，视度可调。带有固定十字分划板水平线的限位机构。27微分微分相衬观察法相衬观察法适合于观察物体表面存在微观高低差(1/10 波长到 1 个波长的梯度差)的位相物体。可以把梯度差形象地转换成浮雕形式和具有彩色对比色.且根据需要可以改变对比色。左图为微分图中：1起偏振片相衬法的光学原理图2.4.6.8.屋拉斯顿棱镜位相物体诺马斯基棱镜镜筒透镜3.5.7.9.聚光镜物镜验偏振片中间象面自然光经过振动方向为

44、45°起偏振片后成为线偏振光射向屋拉斯顿棱镜。此棱镜由二个光轴正交且平行于入射面。出射面的双折射晶体胶合而成。通常由石英晶体或方介石晶体制 成。一根入射线偏振光在棱镜的胶合斜面上分离成二个振动方 向互相垂直的寻常光(O)和非常光(e),由于棱镜位于聚光镜的焦面上,经聚光镜后 O 光和 e 光平行地剪切位相物体。然后经物镜后聚焦在物镜的后焦面上。所谓诺马斯基棱镜与屋拉斯顿棱镜相仿,其差别仅仅其中一个棱镜的光轴与出射面成一定的角度.目的使 O,e 光的交点移出,棱镜胶合面使它与物镜后焦面重合.这样,O,e 光经此棱镜后,O 光变 e 光,e 光变 O 光,但又合二为一.但振动方向不在同一

45、平面上,因此无法.为此在其后方向安置一块振动方向为 45°的验偏振片,使 O,e 光在同一振动面内.相干成象于显微镜的中间象面。综上所述,聚光镜,物镜必须消除应力。实际情况是无数对 O,e 光在物镜后焦面一个倾斜的平面,因此棱镜 6 也倾斜一定的角度。横向移动棱镜 6 可以改变光程差,来改变对比色。下列图片是用微分相衬的标本图像:28荧光观察法荧光观察法在医学领域有着广泛的用途，如免疫学研究的对象是抗原和抗体的反应问题，由 于抗体反应的高度特异性，所以当抗原体发生反应时，只要知道其中一个因子，也就可以知道 另一个因子。但是这个过程必须通过染色，荧光染色剂就应运而生。由于荧光染色的色素

46、只需极稀的浓度便能使激发出明亮的荧光。因而，染色后 体（或抗原）原有的特异活性。其光学原理示意图如下，以蓝光激发为例：破坏抗残余蓝光紫外光紫光 蓝光 绿光 黄光 红光红外光蓝光黄光黄光激发滤光片荧光标本截止滤光片光源发出多种波长的光线，经激发滤光片后只能通过某种单色的激发光，荧光标本在激发光作用下，激发出某种特定的颜色光（荧光）。由于被激发的荧光能量很弱，只能在景才易于观察到，所以增加了抑制滤光片使残余的激发光不能通过。的背早期的荧光观察采用透射照明，它有很大的缺陷，当激发光透过标本组织时，很大部分的 光线被衰减掉，到达我们需观察的标本上表面时，只能激发出微弱的荧光。近代的荧光观察采用落射照明

47、，如下图所示：29图中 ：1光源2. 激发滤光片3. 物镜4. 标本5. 二向性分光镜6. 抑制滤光片光源7. 目镜根据不同的激发光需要，可以选用三种光源，卤素灯，高压灯和氙灯。下图列出菲利浦公司高压灯和氙灯的光谱特性曲线。高压 灯光谱特性氙灯光谱特性由图知，高压 灯是线状光谱，对于某些波长光线有很高的强度，它适用很多染色法。30氙灯在 300800nm 波长内几乎可以看作连续光谱，虽然是某些波长的强度不如 灯，但它适用于所有荧光染色法。卤素灯也是连续光谱，它在蓝光，绿光处也有较高的强度（但远低于 灯，氙灯）因此，对于只用蓝光，绿光激发的简易荧光显微镜可以选用卤素灯。通常采用 50W灯，100

48、W灯 75W 氙灯及 100W 卤素灯作荧光光源。图中物镜既起成象作用，又起聚光镜作用。为了获得很好的观察效果，在荧光很微弱的场合如细菌发出的荧光。建议采用大数值孔径物镜，如的荧石物镜，平场复消色差物镜。正因为物镜又兼聚光镜作用，所以物镜中材料，透镜间胶合剂，以及浸油必须确保在激发光下自发荧光。为了使用方便，常将激发滤光片，二向性分光镜及抑制滤光片组一个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。所谓二向性分光镜对激发光具有高 反射率，而对激发出的荧光具有高透过率。常用模块至少四种：zzzz近紫外光激发模块紫光激发模块蓝光激发模块绿光激发模块UV V BG这些模块对应着不

49、同染色法，如 B 模块常用 FITC 染色法，G 模块常用罗达明 B200 染色法。必须特别指出，激发光的波段曲线绝对不能与抑制光的波段曲线部分重迭，否则，视场中的背景光全部是激发光的颜色,而微弱的荧光完全被掩盖住,正如白天天空中无法看到星光一 样。1激发光2抑制光1激发光2抑制光31蓝光激发如用 FITC 染色法,它的激发波段为 480490nm,被激发的荧光波长为 510nm。由图知,无论激发光或抑制光在 500 nm 处均截止,无相交重迭，所以残留的激发光无法通过截止滤光片,视场背景是的,而荧光则可顺利地透过截止滤光片，形成荧光图像。公司设置了许多模块,供不同的染色法选用。注意:许多荧光

50、标本无法长期保存,特别在激发光照射下,荧光很快消失,所以在停止观察时,应该将激发光挡住,但是 灯开启到熄灭后,第二次再启动时,必须待灯源冷却后才能进行。为此,须在模块前设置一挡板,可随时关闭,开启。32滤光片模块代号激发光范围激发滤光片二向性分光镜截止滤光片A D E4 H3 I3 K3 L4 M2N2.1 TXG/R B/G/R紫外光紫外光+紫光蓝光蓝光蓝光蓝光蓝光绿光绿光绿光蓝光/绿光紫外光/蓝光/绿光BP340-380 BP355-425 BP436/7 BP420-490 BP450-490 BP470-490 BP450-490 BP546/14 BP515-560 BP530-59

51、5 BP490/20 BP575/30 BP400/20 BP495/15 BP570/30RKP400 RKP455 RKP455 RKP510 RKP510 RKP510 RKP510 RKP580 RKP580 RKP600 RKP505 RKP600 RKP415 RKP510 RKP590LP425 LP470 LP470 LP515 LP515 LP515 BP515-560 LP590 LP590 LP615 BP525/20 BP635/40 BP530/30 BP640/40 BP610/75荧光显微镜标本图像(蓝光激发)标本图像(绿光激发)33荧光模块标本图像(紫外光激发)标本图像(蓝光+紫外光激发)调 制 对 比 观 察 法调制对比观察法适合于观察表面具有微观高低差的物体。它与微分相衬情况类似，也能把物体以立体的浮雕象呈现出来。但成像原理完全不同。它是把物体中存在的几何梯度差，所导致光学梯度差产生的光强，人为地调制成比背景亮，而另一侧调制成