基因工程-第三章 基因工程的载体

1、Chapter 3 Gene Cloning Vector载体载体 （Vector） 基因克隆载体基因克隆载体(gene cloning vector): 能承载外源基因，能承载外源基因，将其带入受体细胞得以稳定维持的将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA 分子。分子。载体的功能（载体的功能（Function of Vector）运送外源基因高效转入受体细胞。运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。克隆载体的结构特征克隆载体的结构特征(Character of V

2、ector)(1) 针对受体细胞的针对受体细胞的可转移性可转移性；(2) 自主复制自主复制功能；功能；(3)显著的显著的筛选标记筛选标记；(4)特定的特定的多克隆位点多克隆位点；(5)安全性；安全性； 载体分类：载体分类：1 1）根据构建克隆载体所用的）根据构建克隆载体所用的DNA 来源分为：来源分为：质粒载体质粒载体病毒或噬菌体载体病毒或噬菌体载体质粒质粒DNA与病毒或噬菌体与病毒或噬菌体DNA 组成的载体组成的载体质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA 片段组成的载体等。片段组成的载体等。2）根据应用对象分：）根据应用对象分：原核生物克隆载体原核生物克隆载体植物克隆载体植物克隆载体动物克隆载

3、体动物克隆载体3）按照功能分：）按照功能分：克隆载体克隆载体: 克隆一个基因或克隆一个基因或DNA片断片断表达载体表达载体: 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体1 质粒克隆载体质粒克隆载体1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件1.3

4、 质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建质粒载体以质粒质粒载体以质粒DNA 分子为基础构建的克隆载体，含有质分子为基础构建的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。 1.1.1 质粒组成与构型质粒组成与构型1.1.2 质粒质粒DNA大小大小1.1.3 质粒质粒DNA的复制的复制1.1.4 质粒的不亲和型质粒的不亲和型1.1.5 质粒迁移质粒迁移1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质与构建克隆载体相关的质粒性质1.1.1 质粒组成与构型质粒组成与构型p质粒质粒(plasmid)是一

5、种寓于宿主细胞中染色体外的裸露是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露DNA 分子，一个质粒就是一个分子，一个质粒就是一个DNA分子。分子。p数量：数量：每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少者几个，多者上百个。数，少者几个，多者上百个。p存在广泛：存在广泛：许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒。发现含有质粒。DNA构型：构型：p在宿主细胞内，质粒一般以在宿主细胞内，质粒一般以ccc-DNA 的形式存在。的形式存在。p体外在理化因子作用下，质粒可能成为开环体外在理化因子作用下，质粒可能成为

6、开环 DNA和线形和线形DNA 分子。分子。1.1.2 质粒质粒DNA大小大小p质粒质粒DNA 分子小的不足分子小的不足2kb，大的可达，大的可达100 kb以上，多数以上，多数在在10kb 左右。左右。1.1.3 质粒质粒DNA的复制的复制p质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自我复制。质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自我复制。COP因子：因子：决定质粒的拷贝数，指挥细胞合成阻遏物，决定质粒的拷贝数，指挥细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻遏物的量也积累到足以当质粒复制到一定的拷贝时，阻遏物的量也积累到足以阻止质粒的复制。阻止质粒的复制。Rep基因：基因：指挥宿主细胞合成

7、一种调节蛋白，促进质粒指挥宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。的复制。Par基因：基因：保证细胞分裂时质粒正确分配到子细胞。保证细胞分裂时质粒正确分配到子细胞。“严紧型严紧型” 质粒（质粒（Stringent Plasmid）：）：低拷贝数，低拷贝数，每个宿主细胞仅含每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。份的拷贝。“松弛型松弛型” 质粒（质粒（Relaxed Plasmid） ：高拷贝数的高拷贝数的，每个宿主细胞可达到，每个宿主细胞可达到10-60份拷贝。份拷贝。1.1.4 质粒的不亲和性（质粒的不亲和性（plasmid incompatibility）p质粒的不亲和性，也称不相容性质粒的不亲

8、和性，也称不相容性: 在没有选择压在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存。能在同一宿主细胞中稳定地共存。大肠杆菌质粒现已鉴别出大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。是不相容的。1.1.5 质粒迁移质粒迁移(Plasmid Mobilization)v通过接合作用通过接合作用,质粒可以转移到新的宿主细胞中。质粒可以转移到新的宿主细胞中。Tra基因：基因：指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物，促使宿

9、指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，实现遗传物质的转移。主细胞与受体细胞表面结合，实现遗传物质的转移。分为两种：分为两种： 接合型质粒接合型质粒(Conjugative Plasmid)：含有自我复制基因、：含有自我复制基因、接合转移接合转移Tra基因基因，拷贝数少，分子大。，拷贝数少，分子大。非接合型质粒非接合型质粒(non-Conjugative Plasmid)：能够自我复制，：能够自我复制，但不含但不含Tra基因，这类质粒不能从一个细胞自我转移到另基因，这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞；较安全，且拷贝数多，分子小，适于构建克隆一个细胞；较安全，且

10、拷贝数多，分子小，适于构建克隆载体。载体。1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒v显性质粒：显性质粒：也称表达型质粒，质粒携带一些除与自身复制也称表达型质粒，质粒携带一些除与自身复制和转移相关的基因外，还有别的基因使得宿主细胞出现新和转移相关的基因外，还有别的基因使得宿主细胞出现新性状。性状。v隐蔽质粒：隐蔽质粒：宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表现。宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表现。显性质粒的相关基因：显性质粒的相关基因：抗性基因：抗性基因：抗菌素抗性基因，抗菌素抗性基因，Apr，Tcr，产毒素基因：产毒素基因：大肠杆菌素基因（大肠杆菌素基因（Col-质粒）。质粒）。降解基

11、因：降解基因：降解重金属、有机物和农药等。降解重金属、有机物和农药等。致瘤基因：致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，质粒，Ri质粒。质粒。1 质粒克隆载体质粒克隆载体1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件1.3 质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建(1) 能自主复制，即本身是复制子能自主复制，即本身是复制子(2) 具有多种限制酶的单一切割位点，即多克隆位点具有多种限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本

12、身的复制功能；的复制功能； (3) 在基因组中有在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。于检测的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。；分子量要小，多拷贝，易于操作。；(5)构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件（小组装各种元件（小DNA片段）。片段）。1.2 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件天然质粒：天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。改造的质粒。 天然质天然质 粒粒相对分子质量相对分子质量拷贝数拷

13、贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记复制类型复制类型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr严紧严紧ColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适点少、选择标记不合适如何识别载体上的各种元件及其功能：如何识别载体上的各种元件及其功能：1.3.1 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构及其衍生载体的构1.3.3 农杆菌农杆菌Ti质粒载体的构

14、建质粒载体的构建1.3.5 酵母酵母2um质粒克隆载体质粒克隆载体1.3 质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建 （1）pBR322： p-plsmid，,B R分别为该质粒的两位主要构建者分别为该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母，姓氏的头一个字母，“322”为实验编号。为实验编号。,含有含有双抗基因（双抗基因（Apr，Tcr）和）和Col E1复制起始子。复制起始子。 优点：优点： 具有较小的分子量，具有较小的分子量，4363bp。 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。含有含有24种单一

15、的限制性内切酶识别位点，且种单一的限制性内切酶识别位点，且BamHI、SalI和和PstI等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上，当将外源抗性基因上，当将外源DNA片段插入到这些位点时，可片段插入到这些位点时，可用抗生素基因的失活来筛选重组体。用抗生素基因的失活来筛选重组体。 具较高的拷贝数，具较高的拷贝数，经过扩增之后，每个细胞中可累积经过扩增之后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。个拷贝。pBR322质粒载体的筛选质粒载体的筛选插入失活筛选法插入失活筛选法(2) 衍生衍生pUC质粒载体质粒载体由美国加利福尼亚大学（由美国加利福尼亚

16、大学（University of California）J.Messing和和J.Vieria于于1987年构建。年构建。包括如下四个组成部分：包括如下四个组成部分：i) 来自来自pBR322质粒的质粒的复制起点复制起点(ori)；ii) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因(ampr) ； iii) 大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖酶基因半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码的启动子及其编码-肽链的肽链的DNA序列，此结构特称为序列，此结构特称为lacZ基因基因；iiii) 位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段端的一段多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning sit

17、es, MCS）区段。区段。pUC 18-19多克隆位点表达性载体（Expression Vector）： 根据宿主细胞的不同，表达蛋白质的载体大致可分为：原根据宿主细胞的不同，表达蛋白质的载体大致可分为：原核生物表达载体和真核生物表达载体。由于真核生物种核生物表达载体和真核生物表达载体。由于真核生物种类繁多，又分为酵母表达载体，植物表达载体，昆虫类类繁多，又分为酵母表达载体，植物表达载体，昆虫类表达载体和哺乳类表达载体等等。表达载体和哺乳类表达载体等等。原核生物表达性载体（Prokaryotic Expression Vector）：pGEX Vector (GST tag Expresso

18、in Vector):pGEX Vector MCS region：pET Vector (S tag Expressoin Vector):pET Vector MCS region：真核核生物表达性载体（Eukaryotic Expression Vector）：pcDNA3.1 mammalian Expression Vector:pcDNA3.1 Vector MCS region：pEGFP-C1 mammalian Expression Vector:GFP and REP Expression Vector:pMSC puro Retroviral Vector Map:Ret

19、roviral Vector:1.3.1 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌农杆菌Ti质粒载体的构建质粒载体的构建1.3.5 酵母酵母2um质粒克隆载体质粒克隆载体1.3 质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建（Construction of Plasmid Vector）:p致癌农杆菌致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含一种内含一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引源质粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引发植物发植物在创伤部位组织增生而形成植物肿瘤在创伤部位组织增生而形成植物肿瘤 (冠瘿冠

20、瘿瘤瘤)，称此质粒为，称此质粒为Ti 质粒质粒(tumor inducing plasmid)。1.3.3 农杆菌农杆菌Ti质粒载体的构建质粒载体的构建上： 电镜下的根癌农杆菌下： 冠瘿瘤Ti质粒是双链环状质粒是双链环状DNA 分子分子，约，约200kb，分四个区：，分四个区：1） T-DNA(transfer DNA)： 25kb，进入植物细胞区域，进入植物细胞区域含有多种基因，其表达产物含有多种基因，其表达产物破坏植物细胞内源激素的平破坏植物细胞内源激素的平衡，干扰细胞分裂从而引发衡，干扰细胞分裂从而引发植物肿瘤。植物肿瘤。p T-DNA 左右两边界左右两边界(LB，RB)各有一个各有一个

21、25bp长的正长的正向重复序列向重复序列(LTS 和和RTS)，对，对T-DNA 的转移和整的转移和整合是不可缺少的。合是不可缺少的。2） Vir区：区：位于位于T-DNA 上游的一组基因，表达产物能上游的一组基因，表达产物能激活激活T-DNA 向植物细胞转移，引发植物肿瘤，显示细向植物细胞转移，引发植物肿瘤，显示细菌的致病性。菌的致病性。3) Con区：区：含有含有tra基因，农杆菌之间转移接合基因，农杆菌之间转移接合4) Oir区：区：调控质粒的自主复制调控质粒的自主复制 与大肠杆菌的质粒载体不同，构建的与大肠杆菌的质粒载体不同，构建的Ti质粒载体质粒载体不真正用于细菌，而是用于植物细胞，

22、农杆菌只不真正用于细菌，而是用于植物细胞，农杆菌只起着中间介导的作用起着中间介导的作用。构建共整合质粒载体和构建共整合质粒载体和双元载体双元载体LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记 Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori将外源基因克隆将外源基因克隆在大肠杆菌在大肠杆菌-农杆农杆菌穿梭质粒的菌穿梭质粒的T-DNA区内；区内；双元整合载体双元整合载体1.3.1 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌农杆菌Ti质粒载体的构建质粒载体的构建1.3.5 酵母酵母2um质粒克隆载体质粒克隆载体

23、1.3 质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建（Construction of Plasmid Vector）1.3.5 酵母酵母2m 质粒载体质粒载体酵母是一种最简单的单细胞异养真核生物，可以像细菌一酵母是一种最简单的单细胞异养真核生物，可以像细菌一样进行基因操作，能够在廉价的培养基上生长，可高密度样进行基因操作，能够在廉价的培养基上生长，可高密度发酵。发酵。酵母又具有真核生物的特性，具有对外源基因翻译后进行酵母又具有真核生物的特性，具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能。蛋白质加工和修饰的功能。几乎所有的酿酒酵母菌中都存在几乎所有的酿酒酵母菌中都存在2m质粒。质粒。利用利用2m质粒和

24、其染色体组分质粒和其染色体组分与细菌质粒与细菌质粒pBR322构建构建酵母质粒酵母质粒载体载体，能分别在细菌和酵母菌中，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，又称为进行复制，又称为穿梭载体穿梭载体。 2m复制起点复制起点YEP载体（游离型）载体（游离型） 质粒克隆载体的用途质粒克隆载体的用途 用于保存和扩增片段小于用于保存和扩增片段小于2kb2kb的目的基因。的目的基因。构建基因组文库和构建基因组文库和cDNAcDNA文库。文库。可用于目的基因的测序。可用于目的基因的测序。作为核酸杂交时探针的来源。作为核酸杂交时探针的来源。回顾回顾plasmid质粒载体质粒载体必须必须具备的基本条件具备的基本条件p

25、UC18/19pUC18/19质粒载体质粒载体pBR322pBR322质粒载体质粒载体TiTi质粒质粒pUC18/19质粒载体的组成特点、结构图。质粒载体的组成特点、结构图。 插入失活插入失活 -互补互补T-DNA1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体病毒由病毒由DNA(或或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，

26、利用宿主细胞的合成系统进行合成系统进行DNA(或或RNA)复制和壳蛋白的合成，实复制和壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。现病毒颗粒的增殖。2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体M13克隆载体克隆载体Cosmid 克隆载体克隆载体CaMV克隆载体克隆载体TMV克隆载体克隆载体SV40克隆载体克隆载体反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体杆状病毒表达克隆载体 2.1.1 噬菌体性质噬菌体性质 噬菌体由噬菌体由DNA和外壳蛋白组成，分为头部和尾部。和外壳蛋白组成，分为头部和尾部。2.1

27、 噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（1） DNA ：DNA 在在噬菌体中以线状双链噬菌体中以线状双链DNA 分子分子存在，全长存在，全长48 502bp。 COS 位点位点(cohesive end site):左右两端各有左右两端各有12 个核苷酸个核苷酸组成的组成的5凸出黏性末端，而且两者的核苷酸序列互补。凸出黏性末端，而且两者的核苷酸序列互补。（2）基因组基因组DNA的结构的结构v含含50个以上的基因，各司其职。个以上的基因，各司其职。A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red c

28、III N COS COSCOSCOS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 晚期晚期 溶菌溶菌约有约有20kb生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构（1）噬菌体是一种噬菌体是一种温和噬菌体温和噬菌体，对大肠杆菌具有很高的，对大肠杆菌具有很高的感染能力，以溶源状态可保存在大肠杆菌中。感染能力，以溶源状态可保存在大肠杆菌中。（2）能）能承载比较大外源承载比较大外源DNA：DNA 上约有上约有20kb 的区域对的区域对噬菌体

29、的生长不是绝对需噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源要的，可以缺失或被外源DNA 片段取代。片段取代。( 3) DNA上有上有56种限制酶识别位点（见附录种限制酶识别位点（见附录3-1），），便于便于多种外源多种外源DNA片段的克隆。片段的克隆。2.1.2 选用选用噬菌体作为克隆载体的依据噬菌体作为克隆载体的依据 限制性内切核酸酶切位点的改造限制性内切核酸酶切位点的改造点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的酶的识别序点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的酶的识别序列失效，列失效，避免外源避免外源DNA 片段插入必需区片段插入必需区；2.1.3 构建构建噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 在非

30、必需区插入选择标记基因；在非必需区插入选择标记基因； 建立重组建立重组DNA分子体外包装系统。分子体外包装系统。v重组重组DNA分子经过体外包装称噬菌体颗粒后才分子经过体外包装称噬菌体颗粒后才能有效转导受体细胞。能有效转导受体细胞。置换型载体置换型载体可被外源可被外源DNA置换的置换的噬菌体非必需区两侧有一噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。 2.1.4 噬菌体载体的类型噬菌体载体的类型p只有只有DNA的长度的长度大于大于野生型野生型噬菌体噬菌体DNA长度的长度的75而不超过其而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗时，才能被包

31、装成噬菌体颗粒，当粒，当DNA的长度短于野生型的的长度短于野生型的75%或超过或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求因此要求载体载体DNA和外源和外源DNA长度之和在长度之和在3953kb之间。之间。 插入型载体：插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体的载体，这类，这类噬菌体载体噬菌体载体称插入型载体称插入型载体。仅保留了仅保留了EcoR的单一切点的单一切点可插入长度为可插入长度为10kb的外源的外源DNA.切点又位于报告基因上，故在切开切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基并插入外源基

32、因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选主要用于建立主要用于建立cDNA文库。文库。也用于克隆外源目的基因。也用于克隆外源目的基因。2.1.5 噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用2) 组装组装 1)连接连接3) 侵染侵染置换载体置换载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体单链单链DNA噬菌体载体噬菌体载体M13 Cosmid 克隆载体克隆载体噬菌质粒载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体克隆载体TMV克隆载体克隆载体SV40克隆载体克隆载体反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗

33、病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体杆状病毒表达克隆载体2.2 单链单链DNA噬菌体载体噬菌体载体M13、f1、fd。2.2.1 优越性：优越性：1) 单链单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的为媒介的，这种复制形式，这种复制形式 的的 DNA简称简称RFDNA；2) 不论是不论是RFDNA还是还是ssDNA都能感染大肠杆菌；都能感染大肠杆菌；3) 单链单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其噬菌体颗粒的大小，是受其DNA制约，不存在制约，不存在包装限制问题；包装限制问题；4) 容易测定外源容易测定外源DNA片断的插入取向；片断的插入取向；5)

34、可产生含外源片断的单链可产生含外源片断的单链DNA分子。分子。 2.2.2 M13噬菌体的特点噬菌体的特点p外型丝状，环状单链外型丝状，环状单链DNA (6407bp)，pM13至少至少11个编码基因，个编码基因，pM13 DNA不插入到宿主基因组中不插入到宿主基因组中, 不裂解细不裂解细菌，但抑制宿主生长。菌，但抑制宿主生长。+- -+- -+- -+- -+- -+- -单链结合蛋白单链结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200copy+以以- -链链DNA为为模板合成模板合成+链链DNA滚环方式复制滚环方式复制M13的侵染循环的侵染循环2.2.3 构建构建M13噬菌体载体噬菌体载体 插入选

35、择标记基因插入选择标记基因在选择标记基因区内组装合适的多克隆位点。在选择标记基因区内组装合适的多克隆位点。M13M13克隆载体克隆载体分子结构图分子结构图v适合用于制备克隆基因的单链适合用于制备克隆基因的单链DNA。v用于制备测序用单链用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。探针，定位诱变等。2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体M13克隆载体克隆载体Cosmid 克隆载体克隆载体噬菌质粒载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体克隆载体TMV克隆载体克隆载体SV40克隆载体克隆载体反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克

36、隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体杆状病毒表达克隆载体cosmidcosmid载体：载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段克隆大片段DNADNA的载体，它是由的载体，它是由噬菌体的噬菌体的cos cos 末端末端及质粒重组而成的载体。及质粒重组而成的载体。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNADNA导入受体细胞。导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒但它不会产生子代噬

37、菌体，而是以质粒DNADNA的形式的形式存在于细胞内。存在于细胞内。2.3 Cosmid(考考/柯斯柯斯)克隆载体克隆载体 Cosmid(考考/柯斯柯斯)克隆载体克隆载体特征特征:1) 具有质粒的性质具有质粒的性质，含有大肠杆菌内源质粒复制起始，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件，可在细位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件，可在细菌中保存和大量复制。菌中保存和大量复制。2)含有含有Cosmid 位点位点，可进行体外包装；，可进行体外包装；3) Cosmid载体一般在载体一般在10kb 以下，能以下，能承载比较大的外承载比较大的外源源DNA 片段片段。2.4 噬

38、菌质粒载体，简称噬菌粒噬菌质粒载体，简称噬菌粒1）组成：噬菌粒）组成：噬菌粒是由单链噬菌体和质粒载体是由单链噬菌体和质粒载体DNA融合融合而成。而成。质粒质粒ColE1的的ori抗生素抗性标记抗生素抗性标记M13或或f1噬菌体复制起点噬菌体复制起点如如pUC118噬菌粒载体就是将野生型噬菌粒载体就是将野生型M13的基因间隔区的基因间隔区插入质粒载体插入质粒载体pUC18构建而成的。构建而成的。2）噬菌粒优点：）噬菌粒优点：载体本身分子小，约为载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作；，便于分离和操作；克隆外源克隆外源DNA的容量为的容量为10kb，而，而M13噬菌体载体是克噬菌体载体是

39、克隆隆300400bp；两种复制方式两种复制方式 噬菌粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链噬菌粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA。当用辅助噬菌体当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA。用途：用途：可用于制备单链或双链可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基，克隆和表达外源基因。因。2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体M13克隆载体克隆载体Cosmid 克隆载体克隆载体噬菌粒载体噬菌粒载体CaMV

40、克隆载体克隆载体TMV克隆载体克隆载体SV40克隆载体克隆载体反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体杆状病毒表达克隆载体CaMV花椰菜花斑病病毒克隆载体花椰菜花斑病病毒克隆载体含含1个约个约8kb的环状双链的环状双链DNA分子；分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；其感染对植物有害，不能直接做载体；p构建的含强启动子构建的含强启动子35S RNA启动子的载体可在植物启动子的载体可在植物细胞内高效表达基因。细胞内高效表达基因。 植

41、物根部特异性表达植物根部特异性表达植物地上部特异性表达植物地上部特异性表达用于构建植物载体的植物病毒：用于构建植物载体的植物病毒：双链双链DNA 病毒：病毒：花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)，单链单链DNA 病毒：病毒：蕃茄金黄花叶病毒蕃茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木薯花叶病毒、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒、小麦矮缩病毒(WDV)，RNA 病毒：病毒：雀麦草花叶病毒雀麦草花叶病毒(BMV)、大麦条纹花叶病毒大麦条纹花叶病毒(BSMV)、蕃茄丛矮病毒、蕃茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯马铃薯X 病毒病毒(PVX)、烟草花叶病毒、烟草花叶

42、病毒(TMV)、烟草蚀刻病毒烟草蚀刻病毒(TEV)、李痘病毒、李痘病毒(PPV)等。等。动物病毒识别宿主细胞，某些动物病毒载体能动物病毒识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整高效整合合到宿主基因组中，以及到宿主基因组中，以及高拷贝高拷贝和和强启动子强启动子等，有利等，有利于真核外源基因的克隆与表达。于真核外源基因的克隆与表达。目前利用许多哺乳动物病毒如目前利用许多哺乳动物病毒如SV40、腺病毒、痘病毒、腺病毒、痘病毒、逆转录病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。等改造后的衍生物作为基因载体。用于构建动物载体的动物病毒：用于构建动物载体的动物病毒：猿猴病毒猿猴病毒-40(SV-40)载体

43、载体优点：优点： 5243 bp共价闭合环状分子共价闭合环状分子 感染率高，几乎感染率高，几乎100寄主细胞能被感染寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分能提供完整的真核基因转录所需的成分 侵染性具有寄主特异性侵染性具有寄主特异性反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体反转录病毒是一类含反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成反转录成DNA，通过两端由数百，通过两端由数百bp组成的组成的长末长末端重复序列端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。，整合到染色体上，成为原病毒。反转录病毒整合入宿反转录病毒整合入宿主主DNADNA中的分子机制，

44、中的分子机制，其本质是转座。其本质是转座。昆虫病毒载体昆虫病毒载体优点：优点：高克隆容量，克隆外源高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达片段大小可高达100kb；高表达效率，外源高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的表达量达到细胞蛋白质总量的的25左右，甚至更多；左右，甚至更多；具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和乳动具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和乳动物物 腺病毒克隆载体腺病毒克隆载体 双链双链DNA病毒，基因组病毒，基因组36kb 单链取代单链取代腺病毒载体的优点：腺病毒载体的优点：宿主范围广宿主范围广, 对人致病性低对人致病性低在增殖和非增殖细胞中感染和表达

45、基因在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因与人类基因同源与人类基因同源不整合到染色体中，无插入致突变性不整合到染色体中，无插入致突变性能同时表达多个基因能同时表达多个基因1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体质粒载体或病毒载体携带的外源质粒载体或病毒载体携带的外源DNA 分子在宿主细胞中的分子在宿主细胞中的复制有两种情况：复制有两种情况：自主复制：自主复制：外源外源DNA产生多拷贝，但是容易丢失，导致转基因生物的产生多拷贝，但是容易丢失，

46、导致转基因生物的不稳定性；不稳定性；整合到染色体整合到染色体DNA：能稳定维持，但是插入位点不确定，可能对受体细胞基因能稳定维持，但是插入位点不确定，可能对受体细胞基因组的自稳系统产生干扰，导致出现有害的突变。组的自稳系统产生干扰，导致出现有害的突变。基因定位整合平台系统基因定位整合平台系统可克服这两者的负面效应，已广泛可克服这两者的负面效应，已广泛应用于转基因动植物的研究。应用于转基因动植物的研究。3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体3.1 基因整合平台系统的组成基因整合平台系统的组成整合平台整合平台定位整合载体定位整合载体（1）整合平台：）整合平台：指受体细胞基因组上给定的一个

47、指受体细胞基因组上给定的一个DNA 区区域，是外源域，是外源DNA 定位整合的位置定位整合的位置(靶位靶位)。整合平台可以在基因区或者在基因间隔区。整合平台可以在基因区或者在基因间隔区。（2）定位整合载体：）定位整合载体：除了一般质粒载体必须具备的除了一般质粒载体必须具备的元件外，还必须含有一段或两段元件外，还必须含有一段或两段与整合平台与整合平台DNA 区区域核苷酸序列同源的域核苷酸序列同源的DNA 片段片段。p同源同源DNA 片段长度在片段长度在1kb 以上。以上。p通过通过同源重组，同源重组，定位整合载体携带的目的定位整合载体携带的目的DNA 片片段能够定位整合到整合平台段能够定位整合到

48、整合平台DNA 区域，随受体细胞区域，随受体细胞染色体染色体DNA 的复制而复制，稳定遗传。的复制而复制，稳定遗传。p利用基因整合平台系统转基因的方法也称为利用基因整合平台系统转基因的方法也称为基因基因打靶打靶或或基因定位同源重组基因定位同源重组。分为分为4 种类型：种类型：内源平台整合载体内源平台整合载体：整合平台选定在受体细胞基因组：整合平台选定在受体细胞基因组的一个的一个DNA 区；区；又可分为又可分为双交换置换载体、单交换插入载体和双交换双交换置换载体、单交换插入载体和双交换插入载体插入载体；外源平台整合载体：外源平台整合载体：有两组同源有两组同源DNADNA、整合两次。、整合两次。多

49、采用双交换插入载体多采用双交换插入载体。3.2 定位整合克隆载体的几种模式定位整合克隆载体的几种模式与与受体细胞的种属受体细胞的种属有关；有关；和和同源同源DNA 片段的长短片段的长短有关，随着载体同源有关，随着载体同源DNA 片段长片段长度增加而提高。度增加而提高。整合平台整合平台DNADNA两侧有重组酶两侧有重组酶RecBCRecBC的的chichi位点可提高重组率位点可提高重组率。3.3 定位整合克隆载体的定位整合效率定位整合克隆载体的定位整合效率噬菌粒载体噬菌粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体特点、结构特征特点、结构特征 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体回顾回顾噬菌体噬菌体噬菌

50、体噬菌体载体载体cos ends主要类型主要类型包装长度包装长度M13M13噬菌体载体噬菌体载体RF DNA整合平台整合平台定位整合载体定位整合载体1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体人工染色体载体人工染色体载体（artificial chromosome vector）：利）：利用染色体的复制元件来驱动外源用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体片段复制的载体。穿梭载体：穿梭载体：含有含有第一受体第一受体(大肠杆菌大肠杆菌

51、)内源质粒复制起始位点内源质粒复制起始位点 含有含有第二受体第二受体(如酵母菌如酵母菌)染色体染色体DNA 着丝点、端粒和复着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及选择标记基因。制起始位点的序列，以及选择标记基因。4.1 人工染色体克隆载体含义和特点人工染色体克隆载体含义和特点酵母的自主复制区酵母的自主复制区ARS序列序列 (autonomously replicating sequence) ，在酵母染色体复制和质粒复制中均，在酵母染色体复制和质粒复制中均发挥复发挥复制起点的功能。制起点的功能。人工染色体载体人工染色体载体在在第一受体细胞第一受体细胞内按内按质粒复制质粒复制形式进入形式进入高拷

52、贝复制。高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化片段重组后，转化第第二受体细胞二受体细胞，按，按染色体染色体DNA复制复制的形式进行复制和传的形式进行复制和传递。递。筛选筛选第一受体的克隆子，用抗菌素抗性选择标记；第一受体的克隆子，用抗菌素抗性选择标记；筛选筛选第二受体的克隆子，用与受体互补的营养缺陷型。第二受体的克隆子，用与受体互补的营养缺陷型。酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)的构建的构建：含酵母染色体的含酵母染色体的DNA端粒端粒(TEL)、DNA 复制起点复制起点(ARS)着丝粒着丝粒(CEN) 选择标记选择标记(HIS 和和TRP1)基因

53、基因多克隆位点多克隆位点(MCS)的的DNA 片段片段大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为载体的装载量为350-400 kb4.2 人工染色体克隆载体的构建人工染色体克隆载体的构建YAC的使用的使用细菌人造染色体细菌人造染色体( BAC)是在是在F质粒基础上构建的，其装载量范围在质粒基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb，人类人工染色体载体（人类人工染色体载体（HAC）哺乳动物人工染色体载体（哺乳动物人工染色体载体（MAC）构建基因组文库构建基因组文库容纳大的外源片段，用于构建人类和高等生物的基因组文库。容纳大的外源片段，用于构建

54、人类和高等生物的基因组文库。基因治疗基因治疗大的外源片段能容纳完整的基因家族，从而可能校正由多个突大的外源片段能容纳完整的基因家族，从而可能校正由多个突变位点引起的致病突变。变位点引起的致病突变。基因功能鉴定基因功能鉴定大的外源片段包含编码区、内含子、调控区。大的外源片段包含编码区、内含子、调控区。4.3 人工染色体克隆载体的应用人工染色体克隆载体的应用1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体启动子探针型克隆载体启动子探针型克隆载体诱导

55、型表达克隆载体诱导型表达克隆载体反义表达克隆载体反义表达克隆载体组织特异性表达克隆载体组织特异性表达克隆载体分泌型表达克隆载体分泌型表达克隆载体双启动子表达克隆载体双启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体含增强子表达克隆载体含增强子表达克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体启动子是调控基因有效转录的必备元件启动子是调控基因有效转录的必备元件。启动子探针载体含有启动子探针载体含有质粒载体必备的元件和检测部件质粒载体必备的元件和检测部件。检测部件有两部分组成检测部件有两部分组成: :遗传标记基因遗传标记基因以及以及克隆位点克隆位点。标记基因：标记基因：抗生素抗性基因和

56、绿色荧光蛋白基因抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白基因gp 等。等。5.1 启动子探针载体启动子探针载体1 1）较安全的基因表达载体：）较安全的基因表达载体：由此获得的转基因生物进入自然环境中，由于不存在合由此获得的转基因生物进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，不能表达外源基因产物，也不会导致环适的诱导条件，不能表达外源基因产物，也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡；境污染和影响生态系统的平衡；2 2）能）能人为控制基因时空的表达人为控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。应用及基础研究提供良好的手段。种类：种类：二价金属离子二价金属离子诱导启

57、动子、诱导启动子、红光诱导红光诱导启动子、启动子、热诱导热诱导启启动子和动子和干旱干旱诱导启动子等。诱导启动子等。5.2 诱导型表达载体诱导型表达载体反义核酸技术：反义核酸技术：利用人工合成或重组的与靶基因互补的一利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段段反义反义DNA 或或RNA 片段，特异性地与靶基因结合片段，特异性地与靶基因结合，能封，能封闭其表达。闭其表达。用途：用途：此技术已成为基因治疗的重要手段。此技术已成为基因治疗的重要手段。将获得的致病基因反向插入表达载体，构建成反义表达载将获得的致病基因反向插入表达载体，构建成反义表达载体。体。反义表达载体导入靶细胞后，可转录出与致病基因反义表

58、达载体导入靶细胞后，可转录出与致病基因mRNA 互补的反义互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达。，特异性地封闭致病基因的表达。5.3 反义表达载体反义表达载体高等真核生物中，一些特殊的调控序列高等真核生物中，一些特殊的调控序列(启动子等启动子等)可以调可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。已经构建已经构建v乳腺组织特异性表达载体、乳腺组织特异性表达载体、v肿瘤细胞特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、v神经组织特异性表达载体、神经组织特异性表达载体、v花药特异性表达载体花药特异性表达载体v种子特异性表达载体等。种子特异性表达载体等。

59、5.4 组织特异性表达载体组织特异性表达载体叶特异性表达叶特异性表达叶肉特异性表达叶肉特异性表达维管束特异表达维管束特异表达茎特异表达茎特异表达马铃薯马铃薯分泌型表达克隆载体分泌型表达克隆载体双启动子表达克隆载体双启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体含增强子表达克隆载体含增强子表达克隆载体1 质粒克隆载体质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体1.列举质粒载体必须具备的基本特性。列举质粒载体必须具备的基本特性。2.举例说明什么

60、是穿梭载体？举例说明什么是穿梭载体？3.什么是什么是Ti质粒和质粒和T-DNA？ 4.为什么野生型的为什么野生型的 噬菌体噬菌体DNA不宜作为基因工程载体不宜作为基因工程载体？5. 噬菌体与噬菌体与cos作载体有何区别？作载体有何区别？6.M13载体的主要用途？载体的主要用途？7.何谓何谓YAC? 主要特性是什么主要特性是什么? 8.列举主要用于植物和动物转化的质粒载体和病毒载列举主要用于植物和动物转化的质粒载体和病毒载体有哪些？体有哪些？9.什么是定位整合载体？什么是定位整合载体？思考题思考题回顾回顾plasmid质粒载体质粒载体必须必须具备的基本条件具备的基本条件pUC质粒载体质粒载体pB