超广谱内酰胺酶和AMPC酶进展

1、超广谱超广谱-内酰胺酶和内酰胺酶和AmpCAmpC酶酶的检测及进展的检测及进展美国美国PinnerPinner RW RW报道报道 尽管强有效的抗菌药物使用于临床，尽管强有效的抗菌药物使用于临床， 19801992年年 感染性疾病总的死亡率增加感染性疾病总的死亡率增加39% 呼吸道感染的死亡率增加呼吸道感染的死亡率增加20% 败血症的死亡率增加败血症的死亡率增加83% 主要原因是耐药性在病原细菌中的播主要原因是耐药性在病原细菌中的播散：抗生素使用不当，散：抗生素使用不当，选择出耐药菌选择出耐药菌和破和破坏了正常菌群。坏了正常菌群。 抗生素占总费用的抗生素占总费用的20%50%，至少，至少50%

2、的住院病人抗生素的使用是不合理的的住院病人抗生素的使用是不合理的 选药不对选药不对 剂量不对剂量不对 疗程不对疗程不对 给药间隔不对给药间隔不对革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌耐药的播散主要是耐药的播散主要是 -产生各种产生各种-内酰胺酶内酰胺酶细菌的播散细菌的播散大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌耐药性变迁大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌耐药性变迁 氨苄敏感氨苄敏感 氨苄耐药氨苄耐药 一代头孢敏感一代头孢敏感 耐药耐药 三代头孢敏感三代头孢敏感 耐药耐药 复合制剂复合制剂 大部分敏感大部分敏感 碳青霉烯类碳青霉烯类大肠埃希菌耐药性监测结果大肠埃希菌耐药性监测结果(n=466) 0102030405060708090%

3、R哌拉西林庆大霉素阿米卡星头孢唑啉头孢噻肟头孢吡肟呱拉西林/他唑巴坦头孢哌酮/舒巴坦亚胺培南环丙沙星氨曲南氨苄西林/舒巴坦左旋氧氟沙星肺炎克雷伯菌耐药性监测结果肺炎克雷伯菌耐药性监测结果(n=500)01020304050607080%R哌拉西林庆大霉素阿米卡星头孢唑啉头孢噻肟头孢吡肟呱拉西林/他唑巴坦头孢哌酮/舒巴坦亚胺培南环丙沙星氨曲南氨苄西林/舒巴坦左旋氧氟沙星 - -内酰胺酶内酰胺酶- -最主要的灭活酶最主要的灭活酶1. 到目前已发现到目前已发现300多种；多种；2. 新的种类不断发现；新的种类不断发现；3. 对对 -内酰胺抗生素造成威胁。内酰胺抗生素造成威胁。针对针对 - -内酰胺酶

4、的对策内酰胺酶的对策1. 侧链加笨重的基团（侧链加笨重的基团（Bulky chain)： 一代一代三代三代2. 复合制剂：酶抑制剂的复合制剂复合制剂：酶抑制剂的复合制剂3. 发现新的抗菌药物发现新的抗菌药物-碳青霉烯类等碳青霉烯类等4. 正确使用抗菌药物正确使用抗菌药物 超广谱超广谱 - -内酰胺酶内酰胺酶（extended spectrum extended spectrum - -lactamaseslactamases，ESBLsESBLs） 是一类由质粒介导的是一类由质粒介导的2be类类 -内酰胺酶，能水内酰胺酶，能水解氧亚氨基解氧亚氨基- 内酰胺抗生素，被内酰胺抗生素，被 -内酰胺酶

5、抑内酰胺酶抑制剂如克拉维酸（制剂如克拉维酸（CA）所抑制。所抑制。 ESBLs主要由主要由KP和和EC产生，也可由其他肠杆产生，也可由其他肠杆菌科细菌如枸橼酸杆菌属、沙雷菌属、变形杆菌科细菌如枸橼酸杆菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、沙门菌属和肠杆菌属细菌产生。菌属、沙门菌属和肠杆菌属细菌产生。ESBLs的分类的分类根据基因同源性和水解底物的不同：根据基因同源性和水解底物的不同：TEM系列系列SHV系列系列CTX-M系列系列OXA系列系列其它亚型其它亚型Prevalence of Extended Spectrum -Lactamase-Producing E.coli andK. Pneumoni

6、ae spp. In the Asia-Pacific Area(1998-99)aNation (no. tested)Japan(22)Korea(4)China(10)Taiwan(6)Philippines(9)Indonesia(3)Malaysia/singapore(6)Thailand(8)E Coli8.15.019.716.713.323.37.015.7Klebsiella spp5.548.823.321.731.133.338.045.6Common protocol, Etest method (68 medical centres sampled in 1998-

7、99).% by species group:.ECKP地区 总检出率(%) 总例数 检出数 检出率(%)总例数检出数检出率(%)浙一38571933.3431944.2舟山29.321314.320945嘉兴5021733.3221463.6湖州21.113430.8400台州52.7291241.4191052.6宁波63.6231356.59777.8温州36159601000市一25.8208401100绍兴321564010220衢州16.736616.76116.7丽水27.318529.315426.7金华28.014428.611327.3总计35.72829634.01806

8、938.3 表表 浙江省各地区浙江省各地区EC和和KP中中ESBLs检出率检出率E. coli & Klebsiellae POOL OF ZHEJIANG 2000 ImiCeftaCefp/CefotCeftrCefiPip/Ticar/Amox/GentaAmiCiproGroupNpenemzidime SulbactaximeiaxonepimetazobactClavClavmicinkacinfloxacinESBL-s630.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.3 23.8 22.2 25.4 3.2 38.1 ESBL-r981.0 85.7 44.9 9

9、8.0 99.0 41.8 46.9 88.8 71.4 70.1 51.0 76.5 % ESBL-r60.9ChiSqr-109.5 36.7 148.8 152.8 33.2 27.6 66.9 35.3 28.8 38.0 22.3 *Prob0.90.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 1/8 Caz MIC* AmpC (?)7Caz / Clav MIC 8 mg/l* ESBL-r isolates have MICs 1mg/l to one or more 3rd generation -lactams* Prob

10、ability based on Chi-Square value that excess 2nd agent resistance among ESBL-r occurs by chance* Possible plasmid-mediated Type I cephalosporinase (indifferent to clavulanate.) Multiresistance in ESBL-r * IsolatesPercent of group resistant to indicated agent浙江省大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌浙江省大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌ESBL发生率发生率E

11、. coli & Klebsiellae POOL OF CHINA ICU 2000ImiCeftaCefp/CefotCeftrCefiPip/Ticar/Amox/GentaAmiCiproGroupNpenemzidimeSulbactaximeiaxonepimetazobactClavClavmicinkacinfloxacinESBL-s3850.3 0.0 1.0 0.0 0.0 0.3 5.5 22.9 21.3 24.4 2.1 37.4 ESBL-r3572.2 86.0 38.7 90.8 89.6 39.3 37.6 75.1 68.1 59.6 34.5 6

12、5.5 % ESBL-r48.1ChiSqr4.5 567.7 167.0 621.4 603.1 182.4 113.9 200.2 163.3 93.7 133.1 57.8 *Prob0.050.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 1/8 Caz MIC* AmpC (?)33Caz / Clav MIC 8 mg/l* ESBL-r isolates have MICs 1mg/l to one or more 3rd generation -lactams* Probability based on Chi-Square v

13、alue that excess 2nd agent resistance among ESBL-r occurs by chance* Possible plasmid-mediated Type I cephalosporinase (indifferent to clavulanate.) Multiresistance in ESBL-r * IsolatesPercent of group resistant to indicated agent大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌大肠杆菌及肺炎克雷伯氏菌ESBL发生率发生率加强实验技术人员培训加强实验技术人员培训及时检测及正确报告ESBL对药敏

14、进行适当的修正-内酰胺酶的检测内酰胺酶的检测1酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。2基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控 基因。基因。3转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上；转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上； 在不在整合子中。在不在整合子中。 收集菌株收集菌株 耐药表型分析（纸片药敏试验和耐药表型分析（纸片药敏试验和E-试验分析）试验分析） 提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析

15、 根据结果判定酶的类群，选择相应根据结果判定酶的类群，选择相应PCR引物扩增引物扩增 阳性阳性 阴性阴性 整合子整合子PCR初筛初筛 阳性阳性 阴性阴性 鸟枪法克隆可表达鸟枪法克隆可表达 -内酰胺酶基因内酰胺酶基因 测定测定PCR产物序列产物序列 PCR扩增全扩增全 测定全克隆片段测定全克隆片段 可变区并测序可变区并测序 序列序列整合子检查整合子检查 提取质粒接合实验提取质粒接合实验 克隆并转化到克隆并转化到DH5表达表达-内酰胺酶内酰胺酶 阳性阳性 阴性阴性 钙转或钙转或MgCl2或电转化或电转化 （1）耐药表型分析：纸片药敏试验和E-试验测定MICs（2）酶性质分析：提取酶粗提物进行a.三

16、相水解试验。b.等电聚焦电泳。c.酶动力学分析。（3）基因分析：a.PCR扩增及PCR产物测序。b.PCR扩增整合子全可变区，分析其中结构和可能的-内酰胺酶基因。c.鸟枪法克隆可表达的-内酰胺酶基因，分析基因结构。（4）转移性分析：A.质粒：a.质粒接合试验。b.转化试验：电转化、钙转化或MgCl2转化 B.整合子：a.PCR扩增整合子全可变区及PCR产物序列测定。ESBLs和AmpC-内酰胺酶的检测一、ESBLs的检测1纸片法： 表1 肺克、产酸克雷伯、大肠埃希菌、奇异变形杆菌ESBLs产株纸片法初筛和确证实验2 MIC法： 表2 肺克、产酸克雷伯、大肠埃希菌、奇异变形杆菌ESBLs产株MI

17、C法初筛和确证实验实验方法 初筛试验 表型确证试验培养基 MH MH 抗菌药物浓度 头孢泊肟 10g 或 头孢他啶 30g 头孢他啶 30g 或 头孢他啶/克拉维酸 30/10g 氨曲南 30g 或 和 头孢噻肟 30g 或 头孢噻肟 30g 头孢曲松 30g 头孢噻肟/克拉维酸 30/10g （同时用多于一种抗生素可提高试验灵敏度） （确证试验要求同时做上述四种纸片） 孵育条件 同标准纸片扩散法 同标准纸片扩散法结果 头孢泊肟抑菌圈 17mm 有一种抗生素出现加有克拉维酸纸片抑菌圈 头孢他啶抑菌圈 22mm 没有加克拉维酸纸片抑菌圈5 mm=产ESBL 氨曲南抑菌圈 27mm 头孢噻肟抑菌圈

18、 27mm 头孢曲松抑菌圈 25mm =可疑产ESBL质量控制 阴性对照 ATCC25922 阴 性对照 ATCC25922加有克拉维酸 （参考质控标准） 没有加克拉维酸抑菌圈 2mm 阳性对照 ATCC700603 头孢泊肟抑菌圈 9-16mm 头孢他啶/克拉维酸抑菌圈 头孢他啶抑菌圈 10-18mm 头孢他啶抑菌圈5 mm 氨曲南抑菌圈 9-17mm 头孢噻肟抑菌圈 17-25mm 头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈 头孢曲松抑菌圈 16-24mm 头孢噻肟抑菌圈3 mm 验方法 初筛试验 表型确证试验培养基 CAMHB CAMHB 抗菌药物浓度 头孢泊肟 4g /mL或 头孢他啶 0.25-128

19、 g /mL 头孢他啶 1g /mL或 头孢他啶/克拉维酸 0.25/4-128/4g 氨曲南 1g /mL或 和 头孢噻肟 1g /mL或 头孢噻肟 0.25-64 g /mL 头孢曲松 1g /mL 头孢噻肟/克拉维酸 0.25/4-64/4g （同时用多于一种抗生素 （确证试验要求同时做上述 可提高试验灵敏度） 四种纸片） 孵育条件 同标准MIC法 同标准MIC法结果 生长=可疑产ESBL 有一种抗菌素生素出现加有克拉维酸 （例： MIC 2 g /mL） 的MIC没有加克拉维酸的MIC 3个对 倍稀释度 =产ESBL质量控制 阴性对照 ATCC25922 =无生长 阳性对照 ATCC7

20、00603 阳性对照 ATCC700603头孢泊肟抑菌圈 2 g /mL 有一种抗菌素生素出现加有克拉维头孢他啶抑菌圈 2 g /mL 的MIC没有加克拉维酸的MIC 3个对 氨曲南抑菌圈 2 g /mL 倍稀释度头孢噻肟抑菌圈 2 g /mL 头孢曲松抑菌圈 2 g /mL 如何测出如何测出ESBLsESBLs头孢噻肟头孢噻肟 克拉维酸克拉维酸头孢噻肟头孢噻肟头孢他啶头孢他啶头孢他啶头孢他啶 克拉维酸克拉维酸AmpC检测法 诱导型beta内酰胺酶(AmpC)检测法NCCLS没有推荐测试方法 对肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属，查去遏制高耐突变株，建议每3-4天对病人取样追查.Vitek法(1

21、) 0.5 g/mL CAZ 0.5 g/mL CAZ + 4 g/mL CA (2) 0.5 g/mL C TX 0.5 g/mL C TX + 4 g/mL CA 结果判定：当含CA小孔中比相应的不含CA小孔中的细菌数减少一半时，则判为阳性。病例（一）大肠埃希菌 抗菌药物 结果 抗菌药物 结果 氨苄西林 R 呋喃妥因 R 氨苄西林/舒巴坦 R 亚胺培南 S 氨曲南 R 哌拉西林/他唑巴坦 R 头孢唑啉 R 妥布霉素 R复方新诺明 R 头孢噻肟 R头孢吡肟 R 头孢哌酮/ /舒巴坦 R头孢他啶 R 头孢西丁 R头孢曲松 R 丁胺卡那 R环丙沙星 R 左旋氧氟少星 R庆大霉素 R ESBLs

22、() 病例（一）肺炎克雷伯菌 抗菌药物 结果 抗菌药物 结果 氨苄西林 R 呋喃妥因 R 氨苄西林/舒巴坦 R 亚胺培南 S 氨曲南 R 哌拉西林/他唑巴坦 R 头孢唑啉 R 妥布霉素 R复方新诺明 R 头孢噻肟 R头孢吡肟 R 头孢哌酮/ /舒巴坦 R头孢他啶 R 头孢西丁 R头孢曲松 R 丁胺卡那 R环丙沙星 R 左旋氧氟少星 R庆大霉素 R ESBLs ()三维试验 将细菌接种于MH平板35培养过夜，挑取典型单个菌落接种于3mlMH肉汤35摇床培养4h。44000r/min离心20min 弃上清，用1 ml0. l/L的磷酸盐缓冲夜(PBS,pH=7.0)重悬，44000r/min离心2

23、0min弃上清。沉淀用1mlPBS重悬。在冰浴中130W超声破碎3min。412000r/min离心30min取上清。取50ul上清液作细菌常规培养为阴性后，将上清-20保存备用。三维试验 将0.5个麦氏单位标准菌株大肠杆菌ATCC25922菌液，均匀涂布于MH琼脂平板。在平板中间贴一张含30g头孢噻肟（CTX）的纸片，用无菌手术刀在距纸片5mm处呈放射状由里向外切四道15mm1mm沟糟。由里向外分别加入30l细菌酶粗提液+10l生理盐水、30l酶粗提液+10l 2000mol/L CLA、30l酶粗提液+5l 2000mol/L CLO和5l 2000mol/L CLA、30l酶粗提液+10l 2000mol/L CLO、肺炎克雷伯菌ATCC700603和阴沟杆菌029M的酶粗提液（阳性对照）、灭菌纯化水（阴性）三维试验 35培养过夜，沟槽与抑菌圈交界出出现扩大的长菌区域即蚀环现象为阳