原位杂交技术

1、李成仁李成仁组织胚胎学教研室组织胚胎学教研室TelTel：752220752220，EmailEmail：中心法则中心法则免疫组织化学免疫组织化学？核酸分子原位杂交核酸分子原位杂交一、核酸分子原位杂交的基本概念( (一一) )定义定义用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交酸中的互补序列杂交, , 从而对组织细胞中的核酸进行从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。定性、定位和相对定量分析。 简称原位杂交简称原位杂交( (二二) ) 基本原理基本原理碱基互补配对原理碱基互补配对原理加热变性加热变性杂交反应杂交反应酶标记

2、的抗探针标记物的抗体酶标记的抗探针标记物的抗体酶显色反应酶显色反应带标记物的探针带标记物的探针定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA双链解开双链解开 成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、 甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。( (三三)DNA)DNA变性变性(denaturation)(denaturation)本质本质是双链间氢键的断裂是双链间氢键的断裂解链解链曲线曲线热变性热变性变性变性是在一个相当窄的温是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范度

3、范围内完成，在这一范围内，双链围内，双链DNADNA变性一半变性一半所需要的温度称为所需要的温度称为DNADNA的的解链温度，又称熔解温度解链温度，又称熔解温度, , Tm)Tm)。其大小与。其大小与G+CG+C含量成含量成正比。正比。熔解温度熔解温度(, (, Tm)Tm)Tm=Tm=（G+CG+C）%0.41+69.30.41+69.3 在在适当条件下，变性适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复双螺恢复双螺旋旋构象，这一现象称为复性构象，这一现象称为复性。 热热变性的变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性经缓慢冷却后即可复性，又称为退火。，又称为退火。DNADNA复性

4、复性复性复性RNADNA( (一一) )定义定义：是含有互补顺序的外源性被标记的是含有互补顺序的外源性被标记的DNADNA或或RNARNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定内特定DNADNA或或RNARNA顺序定位的特殊试剂，顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上核酸分子结合上二、探针二、探针（probeprobe）( (二二) )探针的分类探针的分类根据探针的核酸性质分为根据探针的核酸性质分为 DNADNA探针、探针、RNARNA探针、探针、cDNAcDNA探针、探针、cRNAcRNA探针

5、、探针、寡核苷酸探针寡核苷酸探针 1. 1. cDNA(cDNA(complementary DNA)complementary DNA) 克隆于质粒中，可以无限繁殖，克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽取之不尽 较不易较不易被降解被降解 标记方法可靠易行标记方法可靠易行优点优点互补于互补于mRNAmRNA的的DNADNA分子分子（长度为数百（长度为数百- -数千碱基对）数千碱基对）优点：优点： 杂交效率比杂交效率比DNADNA探针高探针高 在检测在检测mRNAmRNA时所形成的时所形成的RNA-mRNARNA-mRNA杂交体比杂交体比DNA-mRNADNA-mRNA杂交体稳定杂交体稳定 缺点

6、：缺点：容易受容易受RNARNA酶的污染而被降解酶的污染而被降解2. 2. RNARNARNARNA是单链分子（探针长度是单链分子（探针长度50-30050-300碱基对）碱基对） 根据靶分子而设计序列在根据靶分子而设计序列在DNADNA合成仪上合成合成仪上合成 优点：形成杂交体快速优点：形成杂交体快速( (序列短，杂交时易于穿透序列短，杂交时易于穿透) ) 缺点：特异性较低（短链和简单）缺点：特异性较低（短链和简单）3. 3. 寡核苷酸寡核苷酸短链探针短链探针( (长度长度10-5010-50个核苷酸个核苷酸) )1. 1. 标记物标记物 3 3H H、3232P P、3535S S、125

7、125I I等。等。 ( (三三) )探针的标记探针的标记( (1 1) )放射性标记物放射性标记物特点：敏感性高特点：敏感性高 半衰期，放射性污染，成本高，耗时长半衰期，放射性污染，成本高，耗时长Vermot J. 2000. Endocrinology.Xie HR et al. 2007. PANS35S35S (2)(2)非放射性标记物非放射性标记物 生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。碱性磷酸酶等。 特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时短，标记探针可较长时间的保存和使用短，标记探针可较长

8、时间的保存和使用特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似特点：敏感性与放射性核素标记的探针相似 较放射性标记系统安全，方便、省时间较放射性标记系统安全，方便、省时间 定位准确，杂交背景好定位准确，杂交背景好地高辛（地高辛（Digoxigenin Digoxigenin 简写简写Dig-Dig-）类固醇半抗原分子类固醇半抗原分子人及多种动物体内不存在类似的物质，无交人及多种动物体内不存在类似的物质，无交叉反应叉反应地高辛标记探针的显色检测地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类常用免疫酶学显色检测方法有两类：Dig-HRPDig-HRP检测检测系统系统 以以DAB/HDAB/H2

9、2O O2 2为底物，结果为为底物，结果为棕色；棕色； 以以4- 4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/ H/ H2 2O O2 2为底物，结果为蓝色。为底物，结果为蓝色。Dig-AKPDig-AKP检测检测体系体系 以以BCIP/NBTBCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀为底物，结果为蓝紫色沉淀。 Diao HL. 2007. Fertil & Steril地高辛地高辛在植入在植入期子宫中的定位期子宫中的定位 2. 2. 标记标记方法方法(1)(1)DNADNA探针标记探针标记 切口移位法切口移位法 DNase IDNase I在在DNADNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口DNADN

10、A聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 核酸外切酶活性在切核酸外切酶活性在切口处将旧链从口处将旧链从5 5 末端逐步切除末端逐步切除在在DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合酶催化下，将聚合酶催化下，将dNTPdNTP连接到切口的连接到切口的3 3 末端末端-OH-OH上，合成新上，合成新的的DNADNA链，同时将标记的核苷酸掺入链，同时将标记的核苷酸掺入随机引物法随机引物法随机引物能与各种单链随机引物能与各种单链DNADNA模板结合模板结合DNADNA聚合酶按聚合酶按5 53 3 方向合成一新的方向合成一新的DNADNA链。链。带标记的核苷酸掺入到新合成的带标记的核苷酸掺入到新合

11、成的DNADNA分子中分子中(2)(2)RNARNA探针标记探针标记在体外转录技术中与探针制备同时完成在体外转录技术中与探针制备同时完成(3)(3)寡核苷酸探针标记寡核苷酸探针标记末端转移法末端转移法CCCCC C取材、切片取材、切片杂交杂交观察、照相观察、照相三、原位杂交技术的基本步骤三、原位杂交技术的基本步骤显色显色原位杂交技术的基本步骤与原理原位杂交技术的基本步骤与原理原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的包括：组织和器材的特殊处理包括：组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片取材、固定、切片 杂交前处理杂交前处理 探针的制备和预杂交探针的

12、制备和预杂交 杂交反应杂交反应 杂交后处理杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析检测杂交信号，进行结果分析（一）器材（一）器材的特殊处理的特殊处理DNADNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNADNA原位杂交原位杂交RNARNA：RNARNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方酶几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测法不能将其灭活。因此，当检测RNARNA或用或用RNARNA作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防

13、注意预防 1. 1. 物理物理方法：方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具器具作高温烘作高温烘烤（烤（180-200180-200干烤干烤4-64-6小时）小时） 对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒消毒 2. 2. 化学化学方法：方法： 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯( DEPC ) ( DEPC ) RNARNA酶抑制剂，有毒酶抑制剂，有毒去除或抑制去除或抑制RNARNA酶方法：酶方法：(1)(1)取材取材的器具用火焰灼烧的器具用火焰灼烧过或高温消毒过或高温消毒(2)(2)标本标本尽早固定，固定剂可灭活部分尽早固定，固定剂可灭活部

14、分RNARNA酶酶(3)(3)所所用玻璃用玻璃器皿均须器皿均须DEPCDEPC水浸泡水浸泡(37 (37 ，2h)2h)，蒸馏，蒸馏水清洗后高压消毒，水清洗后高压消毒，然后然后180180处理处理3h3h以上以上(4)(4)塑料塑料器材最好用灭菌的一次性器材最好用灭菌的一次性用品或用品或DEPCDEPC处理处理整个操作过程带手套和口罩。整个操作过程带手套和口罩。( (二二) )取取 材材目的：既要目的：既要充分保留被测核酸，（特别是充分保留被测核酸，（特别是RNARNA）不）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。结构。基本与基本与免疫组织化

15、学技术免疫组织化学技术相似。相似。取材过程中避免手指、唾液和未经取材过程中避免手指、唾液和未经RNARNA酶抑制酶抑制 处理的器具接触处理的器具接触标本标本所所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用用DEPCDEPC水水清洗。清洗。为防止为防止RNARNA迅速降解，标本离迅速降解，标本离体切小，迅速体切小，迅速投入投入4 4 多聚甲醛溶液内，置多聚甲醛溶液内，置4 4冰箱冰箱内内2-42-4小时小时。再再将组织移入将组织移入3030蔗糖蔗糖PBSPBS溶液内，溶液内，4 4冰箱冰箱内过夜内过夜。次日次日可将标本储存于可将标本储存于-80 -80 低温冰箱

16、内保存。低温冰箱内保存。标本标本的储存的储存组织制片组织制片冷冻切片以厚冷冻切片以厚530um530um最佳最佳。4040烤箱烤箱内内干燥干燥2 2小时后储存在小时后储存在-80-80超低温超低温冰箱冰箱在在-20-20可保存周，在可保存周，在-70-70可保存数月之久可保存数月之久石蜡切片，一般石蜡切片，一般不提倡浸入二甲苯不提倡浸入二甲苯溶液。溶液。( (三三) )杂交杂交预处理预处理 1. 1. 切片脱蜡及切片脱蜡及水水化化 脱蜡及脱蜡及水化过程水化过程与普通石蜡切片相同与普通石蜡切片相同 要求：脱蜡要彻底，否则影响探针对组织细胞要求：脱蜡要彻底，否则影响探针对组织细胞的穿透的穿透 RN

17、ARNA杂交杂交: : 需需DEPCDEPC水替代蒸馏水稀释酒精水替代蒸馏水稀释酒精 切片入切片入DEPCDEPC水浸泡水浸泡 2. 2.增强标本通透性与核酸探针穿透性增强标本通透性与核酸探针穿透性 常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐处理和稀酸洗涤等处理和稀酸洗涤等 (1)(1)蛋白酶蛋白酶K K（甘氨酸）、胃蛋白酶（甘氨酸）、胃蛋白酶（4 4多聚多聚甲醛后固定）甲醛后固定） 酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定剂种类、切片厚度等而确定剂种类、切片厚度等而确定 (2) (2)去污剂处理去污剂处理 Triton X-1

18、00Triton X-100最常用最常用 注意：去污剂处理不当，会引起靶核苷酸的丢注意：去污剂处理不当，会引起靶核苷酸的丢失，影响标本的形态结构失，影响标本的形态结构 (3)(3)酸酐处理和稀酸洗涤酸酐处理和稀酸洗涤 防止探针与标本内的碱性蛋白发生静电效应，防止探针与标本内的碱性蛋白发生静电效应，减少杂交反应的背景色减少杂交反应的背景色3. 3. 预杂交预杂交 杂交之前使用不含核苷酸探针的杂交液在杂交之前使用不含核苷酸探针的杂交液在杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或杂交温度下预先孵育切片，以达到封闭或阻断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，阻断与核苷酸探针产生非特异性杂交点，降低背景着色的目的。

19、降低背景着色的目的。 标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂标记的探针与检测标本上的靶序列结合而形成杂交体的过程。交体的过程。 这是原位杂交技术的关键步骤。这是原位杂交技术的关键步骤。包括：探针的准备包括：探针的准备 双链核酸的变性双链核酸的变性 杂交反应杂交反应( (四四) )杂交杂交反应反应探针长度：探针长度：5050100100个碱个碱基最佳基最佳探针标记物：地高辛（探针标记物：地高辛（DIGDIG）探针浓度：探针浓度：0.50.55.0g/ml;5.0g/ml;杂交液的量要适当，以杂交液的量要适当，以101020l/20l/每张切片为宜每张切片为宜 1. 1. 探针探针准备准备理论

20、热变性温度：理论热变性温度：909095 95 甲酰胺法甲酰胺法：常规：常规的加入的加入303050%50%甲酰胺于杂交液甲酰胺于杂交液中中 每每增加增加1 1%，TmTm值降低值降低0.720.72，降至，降至37-40 37-40 为宜为宜注意注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。却，以保持变性后单链状态。当靶核酸或探针为当靶核酸或探针为DNADNA时，杂交前时，杂交前需要变性为需要变性为单链单链2. 2. 探针探针和靶核酸变性和靶核酸变性探针探针预变性的探针预变性的探针高浓度高浓度盐类盐类( (柠檬酸钠柠檬酸钠)增加杂交

21、体的增加杂交体的稳定性稳定性甲酰胺甲酰胺可可降低解链温度降低解链温度硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖对对DNADNA有浓缩作用，可提高杂交有浓缩作用，可提高杂交的反应速度的反应速度1010倍以上，但不影响探针的洗脱倍以上，但不影响探针的洗脱强度强度牛血清白蛋白和鲑鱼精牛血清白蛋白和鲑鱼精DNADNA或或RNARNA用于用于阻止阻止探针与非特异位点或非目标探针与非特异位点或非目标DNADNA杂交。杂交。3. 3. 杂交杂交液的组成液的组成方法方法：杂交：杂交液滴于液滴于切片上切片上，加盖硅化的，加盖硅化的盖玻片。盖玻片。杂交杂交的的温度：在温度：在Tm-25Tm-25左右左右，大约，大约在在30306060

22、之间之间时间：时间：16162020小时，一般小时，一般过夜。过夜。PHPH：6.56.57.5 7.5 含含50%50%甲酰胺、盐浓度甲酰胺、盐浓度0.75mol/L0.75mol/L左右时，杂交温度：左右时，杂交温度： DNA DNA探针是探针是4242 RNA RNA探针是探针是50-5550-55 寡核苷酸探针寡核苷酸探针是是37374. 4. 温度温度、时间和、时间和PHPH目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。目的：尽可能洗去未杂交或非特异性吸附的探针。方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗方法：系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 RNA RNA探针杂交后漂洗液中的可

23、加入探针杂交后漂洗液中的可加入RNARNA酶酶原则原则：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到：是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高高( (五五) )杂交杂交后处理后处理( (六六) )杂交体的检测杂交体的检测 生物素标记的探针生物素标记的探针 地高辛标记的探针地高辛标记的探针 酶标记卵白抗生物素抗体酶标记卵白抗生物素抗体酶标记链霉抗生物素抗体连接酶标记链霉抗生物素抗体连接酶标记抗地高辛抗体酶标记抗地高辛抗体标记酶：标记酶：HRPHRP、AlPAlP( (七七) )原位杂交详细步骤原位杂交详细步骤1 1、二甲苯、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。脱蜡，梯度酒精水化。DEPCDEPC水洗水洗2 2次，次， DE

24、PC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分钟分钟2 2、DEPC-PBSDEPC-PBS处理的处理的Triton-X100Triton-X100处理处理1515分钟分钟3 3、DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分钟分钟4 4、TETE缓冲液稀释的蛋白酶缓冲液稀释的蛋白酶K K（5-205-20g/mg/m l l）3737孵育孵育15152020minmin 5 5、用用0.10.1mol/Lmol/L的甘氨酸溶液的甘氨酸溶液( (在在PBSPBS中中) )清洗清洗1 1minmin终止蛋白酶终止蛋白酶K K的消化，的消化，DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗

25、2 2次，次，5 5分钟分钟6 6、DEPC-PBS-DEPC-PBS-4%4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定 10-15 10-15分钟分钟7 7、DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分钟分钟8 8、2 2SSCSSC洗洗5 5分钟分钟9 9、不含探针的杂交液中、不含探针的杂交液中3737孵育孵育2 2h h1010、2 2SSCSSC洗洗5 5分钟分钟1111、含探针杂交液中含探针杂交液中3737(42-55(42-55) )孵育孵育1818h h1212、1 1SSCSSC在室温下速洗，在室温下速洗， 1 1SSCSSC在在55 55 水水浴摇洗，浴摇洗，2 21515

26、minmin，0.5 0.5 SSCSSC在在55 55 水浴摇洗水浴摇洗2 21515minmin， 0.5 0.5 SSCSSC在室温下洗在室温下洗1010minmin1313、放射自显影或酶显、放射自显影或酶显目的：保障实验结果的准确性和特异性目的：保障实验结果的准确性和特异性标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照标本对照、探针对照、杂交体对照、检测系统对照阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性阴性对照：排除非特异性杂交等因素造成的假阳性阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性阳性对照：证明杂交步骤及试剂可靠性对照实验设置愈多，实验结果的可靠性就愈大。对照实验设置愈多，实验结果的可

27、靠性就愈大。注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照注意：每次实验都应有阳性对照和阴性对照四四. . 对照实验的设置对照实验的设置 常用的实验常用的实验对照对照(1)(1)标本对照：选用已知为标本对照：选用已知为阳性或阴性的阳性或阴性的组织组织(2)(2)空白实验空白实验: : 无无探针的杂交液探针的杂交液进行杂交进行杂交(3)(3)选用选用其他生物学方法进行对照实验其他生物学方法进行对照实验 提取提取标本标本DNADNA和和RNARNA进行进行SouthernSouthern和和NorthernNorthern印记印记杂交、杂交、qPCRqPCR、RT-PCRRT-PCR等等。（4 4）RNA

28、RNA酶或酶或DNADNA酶预先处理标本后杂交反应酶预先处理标本后杂交反应（5 5）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关）选用标记的非特异性（载体）序列或不相关的核酸探针进行杂交。的核酸探针进行杂交。（6 6）探针孵育后的检测系统对照）探针孵育后的检测系统对照1. 1. 标本形态结构不佳标本形态结构不佳 取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解取材的标本不新鲜，核酸有不同程度的降解 杂交预处理中蛋白酶消化不当所致杂交预处理中蛋白酶消化不当所致 杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮杂交温度较高、孵育时间长易造成切片的飘浮或脱片或脱片五五. . 实验结果可能的问题和原因实验结果可能的问题和原因

29、2. 2. 杂交信号弱杂交信号弱 探针链太长不易深入细胞探针链太长不易深入细胞 探针的标记不好探针的标记不好 靶序列暴露程度不佳靶序列暴露程度不佳 探针和（或）靶序列的变性条件欠佳探针和（或）靶序列的变性条件欠佳 3. 3. 无杂交信号无杂交信号 标本内无靶序列的存在标本内无靶序列的存在 标本内存在靶序列，因实验某个环节的失标本内存在靶序列，因实验某个环节的失误导致后者可能降解误导致后者可能降解4. 4. 非特异性着色非特异性着色 探针特异性探针特异性 组织细胞内的内源性酶组织细胞内的内源性酶 组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体组织细胞内的某些成分与检测系统的抗体非特异性结合非特异性结合基本实验过程总结基本实验过程总结放射自显影放射自显影免疫细胞化学免疫细胞化学样品制备样品制备 切片切片探针制备、标记探针制备、标记 纯化纯化通透处理通透处理变性变性 原位杂交原位杂交 杂交体探测：杂交体探测：小结Thank you！常用试剂1 14%4%多聚甲醛（多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFAParaformaldehyde,PFA） 配法：称取配法：称取4040g PFAg PFA溶于装有溶于装有500500ml DEPCml DEPC水的玻璃容水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌