高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留

1、231分析检测食品科学2011,Vol.32,No.02高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唾类药物残留林海丹，林峰,张美金,谢守新,吴映璇，邵琳智，姚仰勋（广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州510623摘要:建立同时测定动物组织中16种苯并咪唾类药物及其代谢物多残留的高效液相色谱分析方法。试样经乙酸乙酯、50g/100mL氢氧化钾溶液、1g/100mLBHT溶液（20+0.15+1,V/V提取后，正己烷脱脂，MCX固相萃取柱净化，用高效液相色谱C18柱分离，乙月青-0.025mol/L乙酸俊作为流动相，流速为1.0mL/min,梯度洗脱，紫外检测波长为292nm，外标法峰

2、面积定量。16种苯并咪唾类药物在0.0251.0mg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数r均大于0.99，动物组织样品在10、50、100仙g/k萨加水平的添加回收率在81.6%110%之间，相对标准偏差为1.8%13.1%（n=10方法的定量限为10pg/kg方法灵敏度高、重现性好，适用于动物组织中苯并咪唾类药物多残留的检测。关键词:高效液相色谱；动物组织；苯并咪唾类药物SimultaneousHPLCDeterminationof16BenzimidazolesResiduesinAnimalTissueLINHai-dan,LINFeng,ZHANGMei-jin,XIEShou-xin

3、,WUYing-xuan,SHAOLin-zhi,YAOYang-xun(InspectionandQuarantineTechnologyCenter,GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,ChinaAbstract:Ahighperformanceliquidchromatography(HPLCmethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationof16benzimidazolesresiduesinanimaltissue.Animaltissues

4、ampleswereextractedwithethylacetate-50%potassiumhydrox-ide-1%BHT(20:0.15:1,V/V,followedbytreatmentwithn-hexanefordefattingandfurtherclean-uponMCXsolidphase(SPEcartridge.ThechromatographicseparationwasperformedonaC18columnwithamobilephaseconsistingofacetonitrileand0.025mol/Lammoniumacetatesolutionata

5、flowrateof1.0mL/minbygradientelution.Detectionwavelengthwassetat292nm,andthequantitationmethodusedwasexternalstandardmethod.Thecalibrationcurvesof16benzimidazolesexhibitedgoodlinearityoveraconcentrationrangefrom0.025to1.0mg/L,withcorrelationcoefficientsabove0.99.Theaveragerecoveriesfor16benzimidazol

6、esinmeatandlivertissuesfromthreedifferentanimalspeciesrangedrom81.6%to110%atspikelevelsof10,50仙g/mLand100ng/mL,andtherelativestandarddeviationswerebetween1.8%and13.1%(n=10.Thelimitofquantificationwas10仙g/kg.Thismethodissensitive,reproducibleandsuitableforthedeterminationofbenzimidazolesinanimaltissu

7、e.Keywords:highperformanceliquidchromatography;animaltissue;benzimidazoles中图分类号：O657.72文献标识码:A文章编号：1002-6630(201102-0231-06收稿日期:2010-03-05作者简介:林海丹(1972一，女，高级工程师，硕士，主要从事食品中兽药残留和食品添加剂检测研究。：苯并咪口坐类药物(benzimidazoles是一种驱虫药，对线虫、绦虫、吸虫都具有强的驱杀作用，在兽医临床上应有广泛。苯并咪唾类药物的结构中均含有苯环和咪唾的C-4和C-5稠合而成的双环体系。在苯并咪唾母核的C-2和C-5位

8、置含有不同的取代基衍生出具有驱虫作用的药物。根据C-2位取代基的不同将苯并咪唾类药物分为嚷苯咪唾类和氨基甲酸酯两类。常用的苯并咪唾类药物包括阿苯咪口坐、奥芬达口坐、芬苯达口坐、氟苯咪坐、甲苯咪坐、嚷苯咪坐和丙氧苯咪陛。由于一些苯并咪唾类药物及其代谢物在动物和靶动物安全评价实验中表现出致畸和致突变的作用，许多苯并咪唾类药物在体内很快代谢，一些代谢物，如亚碉化物、羟化产物等仍具有胚胎毒性，因此许多国家已将苯并咪唾类药物和其代谢物同时作为监控对象。美国、日本等国家和组织2011,Vol.32,No.02食品科学分析检测232都将苯并咪唾类药物列入Bg制使用的兽药药物中，并制订出各种苯并咪唾类驱虫药物

9、（包括其某些代谢物在不同动物体内（包括肌肉、组织等的最高残留限量MRL,在不同的动物和不同的组织中最大残留限量从10/砥115mg/kg不等，大多数限量是100仙g/kg欧盟和我国规定阿苯达哇的残留标识物是阿苯达唾以及其代谢物阿苯达口坐-2-氨基碉、阿苯达口坐亚碉和阿苯达口坐碉；奥芬达口坐、芬苯达口坐的残留标识物是它们的代谢物奥芬达唾碉;氟苯咪唾的残留标识物事其代谢物是2-氨基氟苯咪口坐;甲苯咪唾的残留标识物是其等效物；丙氧苯咪唾的残留标识物是其原形；嚷苯咪口坐的残留标识物是嚷苯咪口坐及其代谢物5-羟基嚷苯咪坐。目前，国内外报道的动物组织中苯并咪唾类药物残留分析的方法主要涉及有高效液相色谱和液

10、相色谱串联质谱法1-10。国内的研究主要以原药为目标物，有关代谢物的研究多数只涉及一两种组分的分析方法。Balizs11报道了15种苯并咪唾类药物及其代谢物的LC-MS/MS方法,但其大多数目标物的回收率偏低。本研究旨在建立目前我国有规定最大残留量的16种苯并咪唾类药物及其代谢物多残留的液相色谱方法，对16种苯并咪唾类药物残留分析的提取方法、净化方法和色谱条件进行系统的研究，为动物组织中该类药物的残留监控提供了可靠的技术支持。1材料与方法1.1 材料与试剂动物组织送检样品。甲醇、乙月青（HPLC级美国Tedia公司;正己烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺（DMF、氢氧化钾、盐酸、浓氨水（25%

11、28%、乙酸俊、无水硫酸钠（均为分析纯广州分析试剂厂；2,6-二叔丁基对甲酚（BHT,纯度99%德国Sigma公司；Mill-Q超纯水。标准品:奥芬达唾（Oxfendazole,CAS号53716-50-0、芬苯达哇（Fenbendazole,CAS号43210-67-9、阿苯达哇（albendazole,CAS号54965-21-8、阿苯达口坐-2-氨基碉（Albendazole-2-aminosulfone,CAS号80983-34-2、阿苯达口坐亚碉（Albendazolesulfoxide,CAS号54029-12-8、阿苯达口坐碉（Albendazolesulfone,CAS号751

12、84-71-3、甲苯咪唾（Mebendazole,CAS号31431-39-7、丙氧苯咪睡（Oxibendazole,CAS号20559-55-1、嚷苯咪唾（Thiabendazole,CAS号148-79-8、5-羟基嚷苯咪坐（Thiabendazole-5-hydroxy,CAS号948-71-0、嚷苯咪坐酯（Cambendazole,CAS号26097-80-3、氟苯咪唾（Flubendazole,CAS号31430-15-6德国Dr.Ehrenstofer公司；氨基甲苯咪坐（Mebendazole-amine,CAS号52329-60-9、羟基甲苯咪唾（5-Hydroxymebenda

13、zole,CAS号60254-95-7、2-氨基氟苯咪唾（2-Aminoflubendazole,CAS号82050-13-3德国Witega公司;奥芬达口坐碉（Oxfendazolesulfone,CAS号54029-20-8英国EdinburghPharmaceuticalProcess总司；标准品含量均在98%以上。1.2 仪器与设备高效液相色谱系统（配有Waters515泵，717自动进样器，2487双通道紫外检测器及Empower色谱工作站美国Waters公司；T25匀浆机、MS3涡旋振荡器彳惠国IKA公司；3-16PK离心机德国Sigma公司；Labrota4003减压旋转蒸发仪德

14、国Heidolph公司；Mill-Q超纯水器美国Millipore公司。标准品用乙月青-水（2:8,V/V配成适当浓度的混合标准工作溶液。1.3 样品前处理称取5g样品，于50mL离心管中，力口入20mL乙酸乙酯、0.15mL50g/100mL氢氧化钾溶液和1mL1g/100mLBHT溶液置超声波水浴中振荡5min，加入1g无水硫酸钠，均质器上匀质提取30s,4000r/min离心5min，清液转移至100mL梨形瓶中；另取一离心管，加入20mL乙酸乙酯、0.15mL50g/100mL氢氧化钾溶液和1mL1g/100mLBHT溶液洗涤均质器刀头；用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头

15、的洗刀头液溶液，在涡漩振荡器上振荡2min，置超声波水浴中振荡5min,4000r/min离心5min:青液合并至100mL梨形瓶中,38c减压旋转蒸发至干。上述残渣立即用1.5mL乙月青溶解，涡旋混匀超声5min，加入1.5mL0.1mol/L盐酸，涡旋混匀，转移到15mL离心管，加5mL正己烷洗涤梨形瓶，合并转移到离心管中，涡旋混匀，4000r/min离心5min，弃上层正己烷层，加入3mL正己烷重复操作一次。脱脂后的样液加入3mL0.1mol/L盐酸，涡旋混匀，注入已预先用处理的5mL甲醇活化、5mL0.1mol/L盐酸平衡MCX固相萃取柱，依次用5mL0.1mol/L盐酸、5mL甲醇淋

16、洗，15mL浓氨水-乙月青（1:9,V/V溶液洗脱，洗脱液38c减压旋转蒸发至干，残渣加入0.5mL乙月青，置超声波水浴中振荡2min溶解残渣，加入1.5mL0.025mol/L乙酸俊涡旋混匀，过0.45卜m机滤膜，供液相色谱测定。1.4 色谱条件色谱柱:DiscoveryC18柱（250mmK4.6mm,5仙m流动相：乙月青-0.025mol/L乙酸钱，梯度洗脱；乙曲20%55%（30min内线性增加,55%保持2min,55%20%（0.1min内线性递减,20%保持8min;流速:1.0mL/min;柱温:35C;进样量:40仙L检测波长:292nm。233分析检测食品科学2011,Vo

17、l.32,No.022结果与分析2.1 提取条件的优化2.1.1 提取溶液的优化苯并咪唾类药物（BZs分子基本上是中等极性分子，其水溶度很小，考虑到乙酸乙酯和二氯甲烷的极性与BZs接近，对BZs溶解能力较强，分别对乙酸乙酯、二氯甲烷提取BZs的提取效率进行实验。实验表明二氯甲烷提取BZs，回收率低于50%;乙酸乙酯的提取效率较理想。BZs是弱碱性化合物，pH值对具有弱碱性的物质的溶解性或分配系数影响很大,调节pH值使待测组分在水相中处于中性分子状态，或达到两性分子的等电点，水溶性降低,易被有机溶剂萃取。基于以上原理考虑用碱性乙酸乙酯提取BZs，实验表明回收率有较大提高。因此确定碱性乙酸乙酯作为

18、提取溶液。2.1.2 提取溶液pH值的优化考察碱性乙酸乙酯的提取效率。分别以20mL乙酸乙酯不加碱液、加0.5mL50g/100mLKOH、0.2mL50g/100mLKOH、0.4mL50g/100mLKOH作对比实验考察提取溶剂pH值对苯并咪唾药物在动物组织中的提取效率,实验结果表明提取溶剂pH值对阿苯哒唾、丙氧苯咪唾的提取效率无明显影响，随着pH值增大，其他苯并咪唾药物的提取效率提高，但pH值太高（较高碱液浓度，0.4mL50g/100mLKOH时，曝苯咪唾酯、芬苯达口坐、氟苯咪坐、甲苯咪口坐、奥芬达唾碉、曝苯咪坐、5-羟基嚷苯咪唾提取效率下降一半，阿苯达唾-2-氨基碉、阿苯达口坐亚碉、

19、阿苯达唾碉的提取回收率下降至10%以下。综合考虑选择提取溶剂每20mL乙酸乙酯加入0.15mL50g/100mL的氢氧化钾。2.1.3 抗氧化剂对提取效率的影响部分苯并咪唾类药物在样品前处理过程中易发生氧化反应而致损失，实验在样品提取中加入抗氧化剂以保护分析物，分别考察不同质量浓度的BHT溶液,实验结果表明加入1g/100mLBHT可明显提高奥芬达口坐、奥芬达唾碉、阿苯达口坐亚碉、阿苯达陛碉的提取效率，对嚷苯咪口坐、甲苯咪睡的回收率也有好的影响。2.2净化条件的优化样品用碱性乙酸乙酯提取，由于乙酸乙酯属于中等极性溶剂，有可能提取出类脂物用此提取浓缩后需去除类脂物。采用乙月青-正己烷液液分配脱脂

20、。乙月青与正己烷有一些互溶性，会产生轻度乳化，考虑加水以增加乙月青相比重，避免乳化现象，兼顾1到苯并咪唾类药物的弱碱性，其在酸性溶液中溶解度大，因此最后采用乙月青-0.1mol/LHCl-正己烷液液分配脱脂。单纯的液液分配法很难确保色谱分析时不出现基质干扰。固相萃取是一项样品前处理的新技术。考虑到BZs的弱碱性，选择WatersOasisMCX固相萃取柱进行实验该周相萃取柱为阳离子交换-反相吸附剂，对碱性物质有高选择性，获得本底更干净的提取物。兼顾到动物样品成分复杂，特别是动物肝脏样品，为防止样品过载导致回收率下降，选用大体积高容量的150mg/6cc的MCX柱。对固定萃取柱的活化、样品上柱、

21、洗涤和洗脱条件进一步实验。以0.1mol/L盐酸溶液稀释样品液，使分析组分带正电荷而被固相萃取柱保留。洗涤是除去不需要的组分或杂质，经筛选实验确定以5mL0.1mol/L盐酸溶液和5mL甲醇溶液作为洗涤溶剂除去干扰物而苯并咪唾药物仍有高回收率。调节洗脱溶剂pH值为碱性以使苯并咪唾类药物保持非离子状态或反离子状态不被保留从而从柱子上洗脱下来。采用氨水-乙月青溶液作为洗脱溶剂。实验中依次增加氨水含量的乙月青溶剂体系进行洗脱实验，实验结果表明采用浓氨水-乙月青溶液（1:9,V/V为洗脱溶液可使苯并咪唾类药物充分洗脱，同时浓氨水-乙月青溶液（1:9,V/V洗脱液的体积淋洗实验，结果表明大于12mL时可

22、以淋洗完全。最后选择15mL浓氨水-乙月青溶液（1:9,V/V作为洗脱溶剂。2.3色谱条件的优化1.5-羟基嚷苯咪唾;2.阿苯达唾-2-氨基碉;3.阿苯达口坐亚碉;4.曝苯咪电5.阿苯达唾碉;6.奥芬达哇;7.氨基甲苯咪唾;8.羟基甲苯咪出9.2-氨基氟苯咪唾;10.曝苯咪唾酯；11.奥芬达唾碉;12.丙氧苯咪口坐；13.甲苯咪口坐；14.氟苯咪口坐；15.阿苯达口坐；16.芬苯达口坐。图116种苯并咪唾类药物标准的液相色谱图Fig.1HPLCchromatogramsof16bemzimidolesstandards0.0040.0020.000U时间/min0510152025303523

23、45678910111312141516对于残留分析，由于各组分性质有别，为得到适宜的保留值和最佳峰形需采用梯度洗脱。BZs属有机碱化合物，水溶性极小。反相HPLC分析时硅胶基键合相表面残余的酸性硅醇基能强烈吸附BZs，导致保留时间过长、峰拖尾或变形。为降低游离硅醇基的二次吸附作用和增加Bzs在流动相中的溶解性，需采用调节pH（离子增强法和较高的比例的有机溶剂等方法优化流动相。经筛选采用离子增强流动相体系，以乙月青-0.025mol/L乙酸俊溶液进行梯度洗脱，分别考察CloversilC18、OR2011,Vol.32,No.02食品科学分析检测234名称线性方程相关系数名称线性方程相关系数5

24、-羟基嚷苯咪唾y=1.30105x-2880.99982-M基氟苯达唾y=7.38104x-1770.9999阿苯达唾-2-氨基碉y=1.47105x-2410.9998嚷苯咪口坐酯y=1.08105x-3160.9999阿苯达口坐亚碉y=1.42105x-2020.9998奥碉达口坐碉y=1.23105x-2950.9998嚷苯达唾y=2.49105x-7880.9998丙氧苯咪唾y=5.49104x-1570.9999阿苯达口坐碉y=1.30105x-2210.9998甲苯咪口坐y=1.14105x-4180.9999奥碉达唾y=1.41105x-2750.9998氟苯咪口坐y=9.191

25、04x-3860.9999氨基甲苯咪唾y=8.62104x-3060.9999阿苯达唾y=7.85104x-3860.9999羟基甲苯咪唾y=1.45W5x-2730.9998芬苯达口坐y=1.22105x-9550.9999表116种苯并咪唾类药物的线性方程和相关系数Table1Linearequationsandcorrelationcoefficientof16benzimidazoles名称加入量/猪肉猪肝鸡肉鸡肝牛肉牛肝（pg/k蛆收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%5-羟基嚷苯咪睡5092.94.99

26、1.16.289.34.092.37.192.75.287.14.910095.61.988.86.493.22.592.310.789.75.186.15.11095.36.798.54.081.57.491.26.094.96.696.26.8苯达唾-2-氨基碉5099.34.390.05.187.24.588.36.499.45.31013.11001071.894.86.296.75.397.04.096.65.897.55.31096.29.71023.5966.298.46.71105.790.38.0苯达口坐亚碉501014.896.85.391.75.191.96.61015.

27、898.22.11001093.21014.999.55.696.94.599.56.297.03.91097.712.196.86.511010.81065.11055.394.04.8苯达哇501025.11025.097.02.998.45.81025.195.94.01001073.11054.61026.81022.599.06.798.64.21092.16.289.26.298.39.391.24.699.85.590.07.5苯达哇碉5099.24.095.86.0984.294.97.397.24.193.14.51001053.099.26.21036.096.14.496

28、.38.196.13.61098.28.61002.995.75.31024.21007.296.25.9碉达晚501013.595.55.693.64.094.17.098.95.095.53.71001062.61015.799.59.896.93.998.27.595.85.41089.89.095.47.983.57.298.312.596.09.383.96.1基甲苯咪唾5093.94.889.66.5914.094.38.695.23.589.14.9100103392.15.499.98.898.15.397.54.790.27.61096.78.191.16.71006.196

29、.53.61014.51002.9基甲苯咪唾5098.86.092.66.699.44.796.64.996.63.493.23.91001052.595.37.51028.496.23.898.13.194.45.81099.51183.64.985.38.693.64.899.36.688.65.4氨基氟苯达唾5097.77.392.35.892.63.889.86.393.85.486.57.81001023.992.14.396.26.193.93.292.94.790.65.91099.18.389.07.296.83.198.59.81044.294.25.1苯咪坐酯5098.45

30、.199.95.599.03.21025.296.97.393.54.21001052.31034.91018.41062.496.85.191.67.21097.98.691.99.198.65.094.86.11045.895.65.9碉达晚碉501004.599.24.997.43.795.66.498.16.392.65.51001053.61015.61027.296.03.496.53.594.45.7101018.998.19.81045.798.46.31014.586.74.5氧苯咪唾5092.57.895.151014.391.48.091.68.586.99.210010

31、23.796.85.799.68.494.64.095.84.991.26.51094.88.694.46.392.56.087.56.81006.681.64.8苯咪唾5097.26.097.8697.83.390.75.297.44.986.45.01001032.81015.51009.995.02.898.23.593.73.01010210.695.89.21004.696.610.61025.394.36.氟苯咪唾501015.21006.41003.491.16.497.64.489.96.81001023.31014.51008.193.54.896.95.193.46.310

32、95.611.993.38.884.15.598.05.694.46.886.46.1苯达哇5097.66.896.05.794.63.792.17.292.88.389.85.210098.65.195.45.698.48.494.15.096.55.693.63.9101047.790.810.195.78.61037.31059.31025.9苯达哇501035.41026.398.63.894.36.694.14.995.73.21001034.199.97.21017.896.34.796.84.995.54.5表2不同基质样品中16种苯并咪唾类药物的添加回收率结果(n=10Tabl

33、e2Spkierecoveriesfor16benzimidazolesindifferentmatrices(n=10235分析检测食品科学2011,Vol.32,No.02DiscoveryC18等色谱柱，经实验筛选并优化确定的液相色谱条件是：DiscoveryC18柱,乙月青-0.025mol/L乙酸俊溶液梯度洗脱；乙月青:20%55%(30min内线性增力口，55%保持2min,55%20%(0.1min内线性递减,20%保持8min。流速：1.0mL/min。在该条件下的16种苯并咪唾类药物的液相色谱图见图1。2.4线性范围以峰面积-质量浓度作校正曲线，得到线性回归方程，16种苯并咪

34、唾类药物在0.0251.0mg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99线性方程见表1。2.5回收率、精密度与定量限选用不含苯并咪唾类药物的鸡肉、猪肉、牛肉、AItij鸡肝、猪肝和牛肝样品分别加入10、50、100仙g/kg的16种苯并咪唾类药物，按建立的方法处理样品，分析测定并计算其进行回收率和精密度，测得平均回收率(n=10在81.6%110%之间，相对标准偏差为1.8%13.1%,结果见表2,各基质的空白和加标样品的液相色谱图见图27。实验表明不同基质样品中16种苯并咪唾类药物在添加10仙g/k冰平时,信噪比（RSN均大于10,且回收率和精密度满意，因此以10仙g/kg乍为方法的定量

35、限。图5鸡肝空白样品（A和加标（10仙g/kg羊品（B的液相色谱图Fig.5HPLCchromatogramsofblankchickenliverandspikedchickenliver0.0040.0020.000AAU时间/min51015202530350.0020.0010.000时间/min5101520253035图3猪肝空白样品（A和加标（10仙g/kg羊品（B的液相色谱图Fig.3HPLCchromatogramsofblankporkliverandspikedporkliver0.0020.0010.000BAU时间/min51015202530351234567891

36、0111213141516图2猪肉空白样品（A和加标（10仙g/kg羊品（B的液相色谱图Fig.2HPLCchromatogramsofblankporkandspikedpork（at10ng/kg,thesameasFig.3through70.0040.0020.000BAU时间/min5101520253035123456789101112131415#0.0020.0010.000AAU时间/min051015202530350.0020.0010.000BAU时间/min510152025303512347810131415165691112图4鸡肉空白样品（A和加标（10仙g/k

37、解品（B的液相色谱图Fig.4HPLCchromatogramsofblankchickenmeatandspikedchickenmeat0.0030.0020.0010.000-0.001BAU时间/min5101520253035123456781012131415160.0040.0020.000AU时间/min1020302362011,Vol.32,No.02A食品科学3结论分析检测0.004AU0.0020.0000510152025本方法同时测定动物组织16种苯并咪唾药物及其代谢物，方法的回收率和精密度符合SN/T00051996出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编12写的基本规定,方法的定量限符合各国对苯并咪唾3035类药物监控的要求。方法实用、准确，为动物组织中苯并咪唾类药物的监控提供可靠技术支持。时间/min0.004AU0.0024568911131237101214150.000051015202516哙考文献：1张素霞，李俊锁，钱传范.牛肌肉组织中苯并咪唾类药物的基质固相分散-高效液相色谱多残留分析法J.中国兽医学报，2000,20(6:569-571.2陈