第一部分 核酸的分离纯化及鉴定

1、Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edn., Cold Spring Harbor, New York 2001.Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5th Edn., John Wiley, Indianapolis, JN 2002.陈德富，陈喜文陈德富，陈喜文 现代分子生物学实验原理与技术现代分子生物学实验原

2、理与技术 科学出科学出版社，北京版社，北京2010卢圣栋主编卢圣栋主编 现代分子生物学实验技术（第二版）中国协现代分子生物学实验技术（第二版）中国协和医科大学出版社，北京和医科大学出版社，北京2010王伯瑶，黄宁王伯瑶，黄宁 分子生物学技术分子生物学技术 北京大学医学出版社，北北京大学医学出版社，北京京2006核酸的分离、纯化和鉴定核酸的分离、纯化和鉴定一、总论一、总论二、二、DNADNA的分离纯化的分离纯化三、核酸的进一步纯化（聚乙二醇、氯化三、核酸的进一步纯化（聚乙二醇、氯化 铯梯度离心）铯梯度离心）四、以真核生物为代表介绍总四、以真核生物为代表介绍总RNARNA的纯化的纯化问题：问题：分

3、离核酸的基本依据、方分离核酸的基本依据、方法？法？核酸分离主要需要注意的核酸分离主要需要注意的是什么？是什么？DNADNA和和RNARNA分离时的主要差分离时的主要差别？别？不同的生物体中，核酸不同的生物体中，核酸所处的环境不尽相同：所处的环境不尽相同：1 1、核酸与蛋白质结合、核酸与蛋白质结合紧密程度不同。紧密程度不同。2 2、DNADNA与与RNARNA含量有差别。含量有差别。3 3、核酸分子量大小有差别。核酸分子量大小有差别。4 4、.由于核酸性质基本相同，由于核酸性质基本相同，生物体所组成的成分基生物体所组成的成分基本相同，因此，对于不本相同，因此，对于不同的生物体核酸的分离同的生物体

4、核酸的分离方法相差不大。方法相差不大。以上是常见核苷酸结构，中以上是常见核苷酸结构，中性性PHPH下的离子状态的钠盐形下的离子状态的钠盐形式。式。组分和结构决定性质，性质组分和结构决定性质，性质是分离的基础。是分离的基础。核酸的结构特点：核酸的结构特点：分子巨大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二分子巨大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二酯键，自由氨基、磷酸基。酯键，自由氨基、磷酸基。核酸的二级结构：核酸的二级结构：DNADNA双螺旋结构；双螺旋结构；RNARNA大多为单大多为单链，链的许多区域或自身发生回折，回折区内的链，链的许多区域或自身发生回折，回折区内的多核苷酸段呈螺旋结构。多核苷酸段呈

5、螺旋结构。核酸性质核酸性质核酸性质与其结构和组分是密切相关的核酸性质与其结构和组分是密切相关的分子量大小分子量大小：RNARNA和和DNADNA的分子量都很大。的分子量都很大。RNARNA分子量分子量10104 4-10-106 6 或者更大。或者更大。DNADNA分子量分子量1.61.610106 6-2.2 -2.2 10 109 9 。性状和溶解度性状和溶解度：DNADNA多为白色纤维状固体。多为白色纤维状固体。RNARNA为白色为白色粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，都溶于都溶于2-2-甲氧乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙甲氧

6、乙醇，但不溶于一般有机溶剂（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光谱吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独特的紫外吸收光谱。核酸在特的紫外吸收光谱。核酸在240-260nm240-260nm的紫外波段有的紫外波段有强烈的吸收峰。最大吸收值在强烈的吸收峰。最大吸收值在260nm260nm附近。通过附近。通过ODOD260260/OD/OD280280 的比值可判断样品的纯度。的比值可判断样品的纯度。纯纯DNADNA的的ODOD260260/OD/OD280280 =1.8 =1.8，纯纯RNARNA的的O

7、DOD260260/OD/OD280280 =2.0 =2.0。核酸中。核酸中若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。若含杂蛋白或苯酚则比值明显降低。对于纯核酸样品只要读出对于纯核酸样品只要读出260nm260nm的的ODOD值，即可算出含值，即可算出含量，通常：量，通常：1 OD1 OD260260 =50 =50 ugug/ml/ml（双螺旋（双螺旋DNADNA）、）、 1 1 ODOD260260 =40 ug =40 ug/ml/ml（单螺旋（单螺旋DNADNA或或RNARNA）、）、 1 OD1 OD260260 =20 =20 ugug/ml/ml（寡核苷酸）。（寡核苷酸）。变性变性：加热

8、、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子：加热、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子氢键氢键的处理。变性后的核酸的处理。变性后的核酸理化性质、生物功能理化性质、生物功能都都会有显著变化，最重要表现为会有显著变化，最重要表现为粘度下降粘度下降。降解降解：酸、碱、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。：酸、碱、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。变性后表现变性后表现A260A260值增加值增加粘度下降粘度下降浮力密度增大浮力密度增大分子量不变分子量不变核酸的核酸的变变性性与复与复性性分离核酸共同要考虑的分离核酸共同要考虑的防止核酸变性与降解：防止核酸变性与降解：低温操作。低温操作。分离过程需加入必要分离过程需加入必要

9、的核酸解聚酶的抑制剂（如：的核酸解聚酶的抑制剂（如： 乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）、柠檬）、柠檬酸盐、皂土、酸盐、皂土、8-8-羟基喹啉、羟基喹啉、SDSSDS、苯酚等）、苯酚等）脱蛋白脱蛋白：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白形式存在：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白形式存在 ，核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过程中需使用脱蛋白剂。（如：氯仿、苯酚、程中需使用脱蛋白剂。（如：氯仿、苯酚、SDSSDS、蛋白酶等使、蛋白酶等使蛋白质降解或变性，达到与核酸分离的目的。蛋白质降解或变性，达到与核酸分离的目的

10、。DNADNA和和RNARNA的分离的分离：1 1、利用、利用DNADNA和和RNARNA在不同盐浓度下，在不同盐浓度下，溶解度溶解度不同进行分离（不同进行分离（DNADNA在在1-2 M1-2 M时溶解度大，时溶解度大，RNARNA溶解度小。相反，溶解度小。相反，RNARNA在低盐浓度在低盐浓度0.14 M0.14 M时溶解度大，时溶解度大，DNADNA小。）小。）2 2、通过使用、通过使用DNADNA或或RNARNA酶酶，达到，达到DNADNA和和RNARNA分离的目的。分离的目的。3 3、通过调节、通过调节PHPH值进值进行分离（行分离（DNAPHDNAPH值中性或微碱，值中性或微碱，R

11、NARNA酸性在水相）。酸性在水相）。4 4、根据分、根据分子量不同，进行子量不同，进行梯度离心梯度离心，进行分离。，进行分离。核酸的收集核酸的收集： 多用乙醇、异丙醇多用乙醇、异丙醇细菌培养细菌培养从从LBLB琼脂扳上挑取一个单菌落。琼脂扳上挑取一个单菌落。接种到含有适当抗生素的接种到含有适当抗生素的20 ml20 ml液液体体LBLB中。中。3737摇床培养过夜（摇床培养过夜（ODOD0.60.6）。）。 将上述培养液转入将上述培养液转入500 ml500 ml含含抗生素抗生素的液体的液体LBLB培养基中。培养基中。 37 300 rpm 37 300 rpm 约约3-4 hr3-4 hr

12、（OD=0.4OD=0.4）。）。 加入加入2.5ml 2.5ml 氯霉素氯霉素（34 mg/ml34 mg/ml溶于溶于乙醇），使终浓度为乙醇），使终浓度为170 ug170 ug/ml/ml。 300 rpm 37 300 rpm 37 继续培养继续培养 12-16 hr12-16 hr。 离心离心 4 4000 rpm 15 min4 4000 rpm 15 min。 弃上清。弃上清。 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于100 ml100 ml预冷的预冷的STESTE中。中。 离心离心 4 4000 rpm 15 min4 4000 rpm 15 min。 弃上清，收集细菌细胞。弃上清，收

13、集细菌细胞。 LBLB培养基培养基 TryponeTrypone 10g 10g Yeast extract 5g Yeast extract 5g NaCl NaCl 10g 10g 加水至加水至1L 1L STESTE：0.1 mol/L NaCl0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.CL10 mmol/L Tris.CL（PH8PH8）1 mmol1 mmol/L EDTA/L EDTA（PH8PH8） 质粒是染色体外的质粒是染色体外的DNADNA分子，大小可为分子，大小可为1 kb1 kb到到200 200 kbkb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分大

14、多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒按复制方式分为两种类型：质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒和严紧型质粒松弛型质粒和严紧型质粒大多数基因工程使用松弛型质粒。大多数基因工程使用松弛型质粒。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因增或表达的重要媒介物，这种基

15、因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。工程中具有极广泛的应用价值。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA DNA 1 1、酚提取法：、酚提取法：将收获的细胞重悬在将收获的细胞重悬在20ml20ml含含2020蔗糖的蔗糖的TESTES中。中。加入加入新鲜配制的溶菌酶新鲜配制的溶菌酶到终浓到终浓度为度为1 mg/ml1 mg/ml（枯草杆菌和大（枯草杆菌和大肠杆菌）或肠杆菌）或5 mg/ml5 mg/ml（苏芸金（苏芸金杆菌）。杆菌）。3737保温保温303090 min90 min，原生质，原生质游离出来。游离出来。向原生质溶液中加向原生质溶液中加8 8SDSSDS20 20 mlml和和5M N

16、aCl5M NaCl 10 ml 10 ml。6868保温保温5 min5 min。将溶液储于将溶液储于44冰箱，冰箱，8 hr8 hr以以上或过夜。上或过夜。取出后，立即在取出后，立即在44离心离心18000 18000 rpm, 30 minrpm, 30 min。取上清。取上清。 向上清中加入等体积的重蒸酚向上清中加入等体积的重蒸酚（PH6-7PH6-7），轻摇。），轻摇。置冰箱置冰箱15 min15 min，离心取水相。，离心取水相。重复一次。重复一次。再用等体积的再用等体积的氯仿氯仿异戊醇异戊醇（2424：1 1）抽提）抽提1 12 2次。次。离心取水相。离心取水相。加入等体积的加入

17、等体积的乙醚乙醚抽提抽提1 12 2次。次。向水相加两倍体积向水相加两倍体积9595冷冷乙乙醇醇。2020过夜或过夜或7070半小时。半小时。离心离心15000 rpm, 20 min, 15000 rpm, 20 min, 沉淀沉淀DNADNA。7575的乙醇洗涤一次，室温的乙醇洗涤一次，室温或真空干燥。或真空干燥。沉淀溶于沉淀溶于PH8PH8的的TETE缓冲液中。缓冲液中。2 2、碱裂解碱裂解法法 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于10 ml 10 ml SlutionSlution 1 1中。中。 加入加入1ml1ml新配制的新配制的溶菌酶溶菌酶。 加入加入20ml20ml新配制新配制Sl

18、utionSlution 2 2，充，充分混匀。分混匀。 放置放置5 510 min (0)10 min (0)。 加入加入15 ml15 ml预冷的预冷的SlutionSlution 3 3 混混匀匀 置冰上置冰上10 min 10 min 离心，离心，44，10000 rpm/min, 10000 rpm/min, 15min 15min 取上清并加入取上清并加入0.60.6倍体积的倍体积的异丙异丙醇醇充分混匀充分混匀 室温放置室温放置1010分钟分钟 离心，室温离心，室温5000 rpm, 15 min 5000 rpm, 15 min 弃上清，用弃上清，用7070乙醇洗涤乙醇洗涤弃乙醇

19、，干燥。弃乙醇，干燥。 用用3 ml TE(PH8)3 ml TE(PH8)溶解核酸沉淀溶解核酸沉淀可用氯化铯溴化乙锭梯度平衡可用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀继续纯化离心或聚乙二醇沉淀继续纯化 SlutionSlution I I 50 mmol50 mmol/L /L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol25 mmol/L Tris/L TrisCl(PH8) Cl(PH8) 10 mmol10 mmol/L EDTA(PH8)/L EDTA(PH8) Slution2Slution20.2 mol/L NaOH0.2 mol/L NaOH( (用时用用时用10 mol/L10 mol/

20、L储存液稀释储存液稀释) ) 1 1 SDS SDS Slution3Slution35 mol/L5 mol/L乙酸钾乙酸钾 60 ml60 ml冰乙酸冰乙酸 11.5 ml11.5 ml水水 28.5 ml28.5 ml 3 3、煮沸煮沸裂解法：裂解法： 将细菌沉淀物重悬于预冷的将细菌沉淀物重悬于预冷的10 10 ml ml STETSTET中中 加入加入1 ml(10 mg/ml,1 ml(10 mg/ml,溶于溶于10 10 mmolmmol/L Tris,PH8)/L Tris,PH8)新配制的溶新配制的溶菌酶菌酶 室温下放置室温下放置10 min10 min明火加热至沸腾，并不停摇

21、晃明火加热至沸腾，并不停摇晃 立即将其浸入沸水中立即将其浸入沸水中40 s40 s 再将其浸入冰水中再将其浸入冰水中5 5分钟分钟离心，离心，4 15000 rpm,30 min4 15000 rpm,30 min取上清，用乙醇或异丙醇沉淀取上清，用乙醇或异丙醇沉淀可继续用氯化铯溴化乙锭梯可继续用氯化铯溴化乙锭梯度离心纯化度离心纯化 STET 0.1 mol/L NaCl10 mmol/L Tris.Cl(PH8) 1 mmol/L EDTA(PH8) 5 TritonX100 4 4、SDSSDS裂解法：裂解法： 将细菌沉淀物重悬于将细菌沉淀物重悬于10 ml10 ml，预冷的，预冷的101

22、0蔗糖，蔗糖，50 mmol50 mmol/L /L Tris.Cl(PH8)Tris.Cl(PH8)溶液中溶液中 加入新配制的加入新配制的溶菌酶溶菌酶溶液溶液加入加入8 ml 0.25 mol/L 8 ml 0.25 mol/L EDTAEDTA(PH8)(PH8)溶液，摇匀。溶液，摇匀。置冰上置冰上10 min10 min加加4ml 10% 4ml 10% SDSSDS, ,马上用玻璃棒迅速混匀内容物。马上用玻璃棒迅速混匀内容物。立即加入立即加入6 ml 6 ml 5mol/L NaCl5mol/L NaCl( (使终浓度为使终浓度为1 M)1 M)混匀。混匀。置冰上置冰上 1 hr 1

23、hr离心离心 15000 rpm, 30 min15000 rpm, 30 min取上清取上清 酚：氯仿和氯仿酚：氯仿和氯仿各抽提一次各抽提一次取水相，并加两倍体积取水相，并加两倍体积乙醇乙醇，混匀。，混匀。放置室温下放置室温下1 12 2小时小时 离心，离心，4 5000 rpm 20 min4 5000 rpm 20 min。弃上清，用弃上清，用7070乙醇洗涤乙醇洗涤离心，离心，4 5000 rpm 20 min4 5000 rpm 20 min，取沉淀。，取沉淀。用用3ml TE(PH8) 3ml TE(PH8) 溶解溶解DNADNA可用氯化铯溴化乙锭梯度离心继续纯化可用氯化铯溴化乙锭

24、梯度离心继续纯化挑取单菌落，接种于挑取单菌落，接种于2 ml LB 2 ml LB 液体培养基，液体培养基，3737o oC C，250 rpm250 rpm培培养约养约8 h8 h；1 1：500500接种至接种至25 ml LB25 ml LB液体培养基，液体培养基，3737o oC C，250 250 rpmrpm扩大培养过夜。扩大培养过夜。收集菌体，收集菌体，4 4o oC C、6,000 rpm6,000 rpm离心离心15 min15 min，去尽培养液，重悬，去尽培养液，重悬于于4 ml4 ml预先加入预先加入RNaseRNase A A的的Buffer P1Buffer P1，

25、振荡混匀；加入，振荡混匀；加入4 ml 4 ml Buffer P2Buffer P2，轻轻颠倒，轻轻颠倒4-64-6次混匀，室温放置次混匀，室温放置5 min5 min；加入；加入4 ml4 ml预冷的预冷的Buffer P3Buffer P3，混匀，冰上静置，混匀，冰上静置15 min15 min；4 4o oC C、15,000 rpm15,000 rpm离心离心30 min30 min，将上清转移至另一离心管，再，将上清转移至另一离心管，再次次4 4o oC C、15,000 rpm15,000 rpm离心离心15 min15 min。上清转入经上清转入经4 ml Buffer QBT

26、4 ml Buffer QBT平衡的平衡的QiagenQiagen Tip Tip，待其自然流，待其自然流干后，用干后，用10 ml Buffer QC10 ml Buffer QC洗洗2 2次，再加次，再加5 ml Buffer QF5 ml Buffer QF溶解溶解质粒质粒DNADNA；用用3.5 ml3.5 ml（0.7 V0.7 V）的异丙醇室温沉淀；）的异丙醇室温沉淀；4 4o oC C，15,000 rpm15,000 rpm离离心心30 min30 min，去上清；，去上清；2 ml 70%2 ml 70%乙醇洗涤沉淀，乙醇洗涤沉淀，4 4o oC C，15,000 rpm15

27、,000 rpm离心离心10 min10 min，小心，小心去上清；空气干燥去上清；空气干燥5-10 min5-10 min后；用后；用50 l50 l TE TE （pH8.0pH8.0）溶解。）溶解。5 5、质粒的大量制备、质粒的大量制备 取适量水稻叶片取适量水稻叶片( (约约5 g)5 g)放入研钵，加入液氮研磨成粉末，转入放入研钵，加入液氮研磨成粉末，转入50 50 mlml离心管；离心管； 加入加入15 ml15 ml提取液，剧烈摇动，使样品与提取液充分混合；提取液，剧烈摇动，使样品与提取液充分混合； 加入加入1 ml 20% SDS (pH7.2)1 ml 20% SDS (pH7

28、.2)，置于，置于65oC65oC水浴中水浴中20-30 min,20-30 min,其间缓缓其间缓缓摇动几次；摇动几次； 加入加入5 ml 5 M KAc5 ml 5 M KAc溶液，缓缓摇动混匀，冰浴溶液，缓缓摇动混匀，冰浴20-30 min20-30 min，12,000 12,000 rpm rpm 离心离心10 min10 min，将上清液转入新离心管中，再次离心；，将上清液转入新离心管中，再次离心； 取上清，加入取上清，加入10 ml10 ml预冷的异丙醇中，预冷的异丙醇中，-20oC-20oC沉淀沉淀30 min30 min，挑出絮状，挑出絮状DNADNA，干燥，干燥10 min

29、10 min，溶于，溶于700 l700 l TE TE溶液中，加入溶液中，加入5 l RNase5 l RNase A (10 A (10 mg/ml)mg/ml)，37oC37oC消化消化30 min30 min； 加入加入75 l75 l 3mol/L 3mol/L醋酸钠，混匀后，醋酸钠，混匀后，13,000 rpm13,000 rpm离心离心15 min15 min； 将上清液转入新离心管中，加入将上清液转入新离心管中，加入500 l500 l异丙醇，混匀异丙醇，混匀, ,室温沉淀室温沉淀5 5 minmin，13,000 rpm13,000 rpm离心离心15 min15 min；

30、将沉淀在室温凉干，加入将沉淀在室温凉干，加入400 l400 l TE TE缓冲液，缓冲液，4oC4oC溶解过夜。溶解过夜。1 1、聚乙二醇沉淀法纯化、聚乙二醇沉淀法纯化DNADNA取取3ml 3ml 溶于溶于TETE中的核酸溶液，加中的核酸溶液，加入入3ml 3ml 预冷预冷5mol/L LiCl5mol/L LiCl溶液，充溶液，充分混匀。分混匀。离心，离心，4 10000 rpm 10 min4 10000 rpm 10 min取上清并加入等体积的取上清并加入等体积的异丙醇异丙醇，混匀。混匀。离心，室温，离心，室温，10000 rpm 10 min10000 rpm 10 min弃上清，

31、用弃上清，用7070乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀保留沉淀并用保留沉淀并用500 ul500 ul含胰含胰RNARNA酶酶（20 ug20 ug/ml/ml）的）的TETE（PH8PH8溶解沉溶解沉淀。淀。室温放置半小时室温放置半小时 加入加入500 ul500 ul含含1313（W/VW/V）聚乙二聚乙二醇醇的的1.6 mol/LNaCl1.6 mol/LNaCl，充分混匀。，充分混匀。离心，离心，4 12000 rpm 5 min4 12000 rpm 5 min去上清，保留沉去上清，保留沉加入加入400 ul400 ul TE(PH8) TE(PH8)溶解沉淀溶解沉淀用用酚、酚：氯仿、氯仿酚、

32、酚：氯仿、氯仿各抽提一各抽提一次次取水相并加入取水相并加入100 ul100 ul 10 ml/L 10 ml/L乙酸铵乙酸铵混匀，并加入两倍体积乙醇混匀，并加入两倍体积乙醇室温放置室温放置10 min10 min离心，离心，4 12000 rpm 5 min4 12000 rpm 5 min回回收沉淀收沉淀加入加入200 ul200 ul 4 4的的7070乙醇，混乙醇，混匀。匀。弃上清，等乙醇蒸发殆尽弃上清，等乙醇蒸发殆尽500ul TE500ul TE（PH8)PH8)溶解沉淀溶解沉淀储存储存DNADNA于于2020或或70702 2、氯化铯溴化乙锭梯度离心、氯化铯溴化乙锭梯度离心1 1

33、、氯化铯溴化乙锭梯度平衡离、氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环心法纯化闭环DNADNA（连续梯度离心（连续梯度离心法法) )精确测量精确测量DNADNA溶液的体积溶液的体积按按1 g/ml1 g/ml的用量加入固体的用量加入固体CsClCsCl加热至加热至3030并温和混匀。并温和混匀。每每10 ml DNA10 ml DNA溶液加入溶液加入0.8 ml0.8 ml溴溴化乙锭溶液（化乙锭溶液（10 mg/ml10 mg/ml溶于水溶于水) )立即将其于立即将其于DNADNA氯化铯溶液混匀氯化铯溶液混匀离心，室温离心，室温8000 rpm 5 min8000 rpm 5 min将下层清亮红色溶

34、液转移到适当将下层清亮红色溶液转移到适当的离心管中的离心管中用轻石蜡油加满，并封口。用轻石蜡油加满，并封口。离心，离心，20 45000 rpm 16 hr20 45000 rpm 16 hr收集闭环收集闭环DNADNA从从DNADNA中除去溴化乙锭中除去溴化乙锭2 2、不连续梯度离心：、不连续梯度离心： 此方法是将不同浓度的此方法是将不同浓度的CsClCsCl溶溶液分层加到离心管中，液分层加到离心管中，这样可加速这样可加速CsClCsCl梯度的形成，梯度的形成，使离心时间减少到使离心时间减少到6 hr6 hr。 从纯化的质粒从纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭中去除溴化乙锭方法方法1 1：有机溶

35、剂抽提：有机溶剂抽提将将DNADNA溶液放入试管中溶液放入试管中加等体积的饱和加等体积的饱和1 1丁醇或异戊醇丁醇或异戊醇振荡混匀两相振荡混匀两相离心，室温离心，室温 1500 rpm 3 min1500 rpm 3 min取水相取水相反复抽提反复抽提4 46 6次直到粉红色从水相中和次直到粉红色从水相中和有机相中消失。有机相中消失。方法方法2 2： 离子交换层析离子交换层析如图所示，用吸管装一支如图所示，用吸管装一支DowexDowex AG50 AG50树脂的柱子（装柱前需将树脂进行平树脂的柱子（装柱前需将树脂进行平衡）。衡）。平衡方法如下：平衡方法如下： 1 1、适量、适量DowexDo

36、wex AG50 AG50树脂溶于树脂溶于100 ml 100 ml 1mol/L NaOH1mol/L NaOH中，搅拌中，搅拌5 5分钟，待树脂分钟，待树脂沉淀后，吸出上清弃去。沉淀后，吸出上清弃去。 2 2、加、加100ml 1mol/L HCl100ml 1mol/L HCl，继续搅拌，继续搅拌5 5分钟，树脂沉淀后，吸出上清弃去。分钟，树脂沉淀后，吸出上清弃去。 3 3、用水重复步骤两次（每次、用水重复步骤两次（每次100ml100ml），），然后用然后用TENTEN缓冲液（缓冲液（100ml100ml）重复步骤）重复步骤2 2一次。一次。 TENTEN缓冲液：缓冲液：( (0.1m

37、ol/L 0.1mol/L Tris.Cl(pH8.0)Tris.Cl(pH8.0)，0.01mol/L 0.01mol/L EDTA(pH8.0)EDTA(pH8.0)，1 mol/L NaCl1 mol/L NaCl） 4 4、于、于44将树脂储存于含将树脂储存于含0.2%0.2%叠氮钠叠氮钠的的TENTEN缓冲液中。缓冲液中。吸去树脂上的缓冲液，用吸去树脂上的缓冲液，用2 2倍体积的倍体积的TETE（Ph8.0Ph8.0）洗柱，将含有溴化乙锭）洗柱，将含有溴化乙锭和氯化铯的和氯化铯的DNADNA直接加到树脂上。直接加到树脂上。收集流出物，当所有收集流出物，当所有DNADNA溶液进溶液进入

38、柱子后，用入柱子后，用1.21.2倍柱体积洗脱，倍柱体积洗脱，同时继续收集流出物。同时继续收集流出物。柱子流干后，将收集的流出物柱子流干后，将收集的流出物用用2 2倍体积的水稀释。倍体积的水稀释。用用6 6倍体积的乙醇，于倍体积的乙醇，于44下，下，沉淀沉淀DNA 15DNA 15分钟。分钟。44，12001200转转/ /分分 离心离心1515分钟，分钟，收集收集DNADNA沉淀。沉淀。用用44的的70%70%乙醇洗沉淀，按上乙醇洗沉淀，按上步重新离心，取沉淀。步重新离心，取沉淀。用适量用适量TETE（pH8.0pH8.0）溶解）溶解DNADNA。RNARNA纯化中很重要的一个任务是：严格控

39、制纯化中很重要的一个任务是：严格控制RNARNA酶酶的活性！的活性！因为，所有的组织、人的手指、试剂、容器等中因为，所有的组织、人的手指、试剂、容器等中均存在或被污染均存在或被污染RNARNA酶，所以，在对酶，所以，在对RNARNA纯化前，纯化前，需做大量的准备工作需做大量的准备工作。焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）：它是）：它是RNARNA酶的化学修饰试剂。它酶的化学修饰试剂。它和和RNARNA酶的活性基团酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活。组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活。异硫氰酸胍（异硫氰酸胍（GITCGITC）：目前认为是制备）：目前认为是制备RNARNA最有效的抑制最

40、有效的抑制剂。它除了对剂。它除了对RNARNA酶有强烈的变性作用外，还具有使细胞酶有强烈的变性作用外，还具有使细胞结构破坏，核酸从核蛋白中解离的作用。结构破坏，核酸从核蛋白中解离的作用。钒氧核苷酸复合物：是氧化钒离子和任何核苷形成的复合钒氧核苷酸复合物：是氧化钒离子和任何核苷形成的复合物。可与物。可与RNARNA酶结合，而抑制酶活。酶结合，而抑制酶活。RNARNA酶抑制蛋白：是一种对酶抑制蛋白：是一种对RNARNA酶有抑制作用的蛋白质。酶有抑制作用的蛋白质。其它如肝素、其它如肝素、DTTDTT、SDSSDS等都是等都是RNARNA酶的抑制剂，在酶的抑制剂，在RNARNA提纯提纯中经常使用中经常

41、使用常使用的常使用的RNARNA酶的抑制剂酶的抑制剂1 1、控制污染：、控制污染：专用的专用的RNARNA操作室、专用器械。操作室、专用器械。操作时戴口罩、帽子、手套。操作时戴口罩、帽子、手套。实验用器皿、吸头、离心管应为新的。实验用器皿、吸头、离心管应为新的。所配制的水溶液，尽可能用所配制的水溶液，尽可能用DEPCDEPC处理。处理。控制控制RNARNA酶的活性酶的活性2 2、已污染、已污染RNARNA酶的器具的处理酶的器具的处理在在180180的高温下干烤的高温下干烤8 8小时或更长时间。小时或更长时间。氯仿冲洗。氯仿冲洗。双氧水浸泡。双氧水浸泡。0.1% DEPC0.1% DEPC（焦碳

42、酸二乙酯）水浸泡。（焦碳酸二乙酯）水浸泡。动物组织总动物组织总RNA的制备的制备 试剂：试剂：变性液（储存于棕色瓶中）：配制体积：变性液（储存于棕色瓶中）：配制体积：52.8 ml 52.8 ml 终浓度终浓度 储存液储存液 异硫氰酸胍异硫氰酸胍 4 M 4 M 25 g 25 g 柠檬酸钠柠檬酸钠 25 mM25 mM 0.75 M(pH7.0) 0.75 M(pH7.0) 1.76 ml 1.76 ml 十二烷基氨酸钠十二烷基氨酸钠 0.5% 0.5% 10% (warm to 65) 10% (warm to 65) 2.64 ml 2.64 ml DEPC-ddHDEPC-ddH2 2

43、O O 29.3 ml 29.3 ml 以上混合液可放置室温下以上混合液可放置室温下3 3个月个月。用前加入。用前加入0.36ml 0.36ml 巯基乙巯基乙醇醇。加入。加入巯基乙醇后，室温下可使用巯基乙醇后，室温下可使用1 1个月个月。其于常规试剂配制不列举。其于常规试剂配制不列举。 方法方法：杀死小鼠，放血。杀死小鼠，放血。 迅速取出所需组织（按所需而定）迅速取出所需组织（按所需而定） 用用DEPC-ddHDEPC-ddH2 2O O清洗一下，立即仍到清洗一下，立即仍到液氮液氮中。中。取取4-5 ml4-5 ml变性液入一洗净的研钵中备用变性液入一洗净的研钵中备用从液氮中取出冻好的组织放入

44、一不锈钢从液氮中取出冻好的组织放入一不锈钢研钵中，倒入一些液氮，将其碾碎。（在此过程中，需保证组织不解冻）研钵中，倒入一些液氮，将其碾碎。（在此过程中，需保证组织不解冻）也可在有变性液存在下用组织匀浆机进行破碎。也可在有变性液存在下用组织匀浆机进行破碎。将已碾成粉末的组织转移至放有将已碾成粉末的组织转移至放有变性液变性液的研钵中，迅速研磨并不断加入的研钵中，迅速研磨并不断加入液氮，反复如此，直至组织完全碾碎。液氮，反复如此，直至组织完全碾碎。取数个已灭菌的新取数个已灭菌的新EPEP管中，各加入管中，各加入0.5 ml 0.5 ml 变性液和组织匀浆变性液和组织匀浆每每EPEP管中加入管中加入5

45、0 ul50 ul 3.0 M NaAc 3.0 M NaAc(pH4.7(pH4.7) )混匀（轻弹）。混匀（轻弹）。每每EPEP管中加入管中加入500 ul500 ul 水饱和酚，水饱和酚，加氯仿加氯仿- -异戊醇（异戊醇（4949：1 1），），100 ul100 ul。旋涡混合器振动旋涡混合器振动1 1分钟。分钟。冰浴冰浴 1515分钟。分钟。1200012000转转/ /分，分，4 204 20分钟。分钟。转移上层水相至另一转移上层水相至另一EPEP管中。管中。加等体积预冷的异丙醇加等体积预冷的异丙醇 0/N0/N（-20-20）。）。离心，离心，1200012000转转/ /分，分

46、，2020分钟。分钟。弃上清，沉淀溶于弃上清，沉淀溶于200ul 200ul 变性液中。变性液中。加入加入10.8 ul10.8 ul 3 M NaAc( 3 M NaAc(pH4.5pH4.5) ) 加等体积水饱和酚及加等体积水饱和酚及1/51/5体积的氯仿体积的氯仿- -异戊醇混合物异戊醇混合物旋涡混合旋涡混合1 1分钟，冰浴分钟，冰浴2020分钟。分钟。离心离心 1200012000转转/ /分，分，4 204 20分钟。分钟。转移水相至另一转移水相至另一EPEP管中，加等体积异丙醇。管中，加等体积异丙醇。-20 1-20 1小时。小时。离心离心1200012000转转/ /分，分，4

47、204 20分钟分钟弃上清，沉淀加弃上清，沉淀加120ul120ul变性液变性液Vortex Vortex 溶解溶解加等体积冷异丙醇，加等体积冷异丙醇，-20 1-20 1小时。小时。离心离心1200012000转转/ /分，分，4 204 20分钟分钟弃上清，沉淀用弃上清，沉淀用75%75%乙醇悬浮乙醇悬浮离心离心1200012000转转/ /分，分，4 104 10分钟分钟弃上清，室温或真空干燥。弃上清，室温或真空干燥。用用DEPC-ddHDEPC-ddH2 2O O溶解溶解RNARNA（检查（检查RNARNA制备质量，测制备质量，测ODOD260260/OD/OD280280用用1-2u

48、l1-2ul样品电泳观察。）样品电泳观察。） 将收集的材料从冰箱中取出，液氮中研磨成细粉。以将收集的材料从冰箱中取出，液氮中研磨成细粉。以5 g5 g组组织材料加入织材料加入16 ml Trizol16 ml Trizol抽提液的比例加入抽提液的比例加入TrizolTrizol抽提液，抽提液，用力摇匀，室温放置用力摇匀，室温放置10 min10 min；4 4C C，10,000 rpm10,000 rpm，离心，离心20 min20 min，取上清。取上清。 加氯仿和加氯仿和5 M NaCl5 M NaCl各各4 ml4 ml，用手剧烈震摇，用手剧烈震摇15 s15 s，室温放置，室温放置3

49、 3 minmin，4 4C C，10,000 rpm10,000 rpm离心离心20 min20 min，取上层水相转移至一个，取上层水相转移至一个新的离心管。新的离心管。 于上清中加入于上清中加入7.5 ml7.5 ml异丙醇，混匀，室温沉淀异丙醇，混匀，室温沉淀10 min10 min，4 4C C，10,000 rpm10,000 rpm离心离心15 min15 min，去上清，可见管壁和管底形成的胶，去上清，可见管壁和管底形成的胶状沉淀。状沉淀。 加加2 ml 752 ml 75乙醇洗涤沉淀，乙醇洗涤沉淀，4 4C C，7,500 rpm7,500 rpm离心离心5 min5 min

50、，弃，弃上清，沉淀重复洗上清，沉淀重复洗1-21-2次，自然干燥，最后加次，自然干燥，最后加1 ml RNase1 ml RNase- -freefree水水,65,65C C水浴溶解。如有杂质，水浴溶解。如有杂质，10,000 rpm10,000 rpm离心离心30 min30 min，取上清。取上清。 取取1 1 1 RNA1 RNA溶液以溶液以1 1：100100稀释，紫外分光光度计测定稀释，紫外分光光度计测定OD260/OD280OD260/OD280的紫外吸收值比值，检测的紫外吸收值比值，检测RNARNA的质量，并测定的质量，并测定RNARNA浓度。浓度。用用TrizolTrizol

51、试剂提取水稻的总试剂提取水稻的总RNARNA 在反应体系中加入在反应体系中加入1 g1 g水稻总水稻总RNARNA，加入，加入DEPC-DEPC-H2OH2O使总体积为使总体积为8 l8 l, ,加入加入0.5 l RNase0.5 l RNase抑制剂，抑制剂，加入加入2 l2 l Oligo(dT)18 Oligo(dT)18引物，小心混匀，于引物，小心混匀，于6565C C保温保温5 min5 min。然后于室温放置。然后于室温放置10 min10 min。 按次序加入按次序加入4l 54l 5First-strand bufferFirst-strand buffer，0.5 l RN

52、ase0.5 l RNase抑制剂，抑制剂，2 l2 l 0.1M DTT 0.1M DTT，2l 2l dNTPdNTP Mix Mix，1 l1 l MMLV MMLV反转录酶。小心混匀，室反转录酶。小心混匀，室温高速离心温高速离心5 s,5 s,将溶液收集到管底。将溶液收集到管底。 37 37C C保温保温1 h1 h，9090C C处理处理5 min5 min，水浴，水浴10 min10 min，室，室温高速离心温高速离心5 s5 s，将溶液收集到管底。，将溶液收集到管底。DNA DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应有电荷效应和和分子筛效应分子筛效应。DN

53、A DNA 分子在分子在高于等电点的高于等电点的pH pH 溶液中带负电荷溶液中带负电荷，在电场中向正，在电场中向正极移动。由于糖极移动。由于糖- -磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟双涟DNA DNA 几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，正极方向移动。在一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移速度取分子的迁移速度取决于分子筛效应，即决于分子筛效应，即DNADNA分子本身的大小和构型。具有不同的分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的相对分子质量的DNADN

54、A片段泳动速度不一样，可进行分离。片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA DNA ，也可以分离相对，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。实验原理实验原理 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于琼脂糖凝胶用于分离大于200200- -1000 bp1000 bp的片段的片段; ; 操作简单、快速，

55、且分离范围广，分辨率高操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离聚丙烯酰胺凝胶用于分离5 5500 bp500 bp的片段的片段; ; 聚丙烯酰胺凝胶用于分离聚丙烯酰胺凝胶用于分离5 5500 bp500 bp的片段；效果好、的片段；效果好、分辨率极高，相差分辨率极高，相差1 bp1 bp的的DNADNA片断就能分开，能容纳相对大片断就能分开，能容纳相对大量的量的DNADNA；用于核苷酸多态性的分析；用于核苷酸多态性的分析 。 琼脂糖凝胶电泳的基本过程琼脂糖凝胶电泳的基本过程材料材料：电泳缓冲液（常用电泳缓冲液（常用TAETAE或或TBETBE）、电泳级琼脂）、

56、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。 基本过程：基本过程：制胶制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲放入电泳槽中并加入电泳缓冲液液 取出梳子取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳一定电压条件下电泳 合适合适的时间后停止电泳的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色取出

57、凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套无毒的试剂。无毒的试剂。GelRedGelRed、 GelgreenGelgreen、 Gold Gold ViewView核酸凝胶染料核酸凝胶染料 常用的电泳缓冲液常用的电泳缓冲液缓冲液使用液浓贮存液（每升）tris-乙酸（TAE）1： 0.04mol/l tris-乙酸0.001mol/l EDTA50：242g tris碱57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/l EDTA(ph8.0)tris-磷酸（TP

58、E）1: 0.09mol/l tris-磷酸 0.002mol/l EDTA10: 10g tris碱15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/l edta(ph8.0)tris-硼酸（TBE）0.5： 0.045mol/l tris-硼酸0.001mol/l EDTA5：54g tris碱 27.5硼酸 20ml 0.5mol/l EDTA(ph8.0)碱性缓冲液1: 50mmol/l NaOH 1mmol/l EDTA1: 5ml 10mol/l NaOH2ml 0.5mmol/l EDTA（ph8.0)TAETAE、TPETPE及及TBETBE电泳缓冲液比较电泳

59、缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；容量；双链线状双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁中迁移快移快10%10%；对于高分子质量的对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或TPETPE，对于低分子质量的，对于低分子质

60、量的DNADNA，TAETAE要差要差些。超螺旋些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBETBE。凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液载样缓冲液：载样缓冲液：临上样到临上样到凝胶加样孔凝胶加样孔之前之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用： 1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内； 2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速 率向阳