传统豆腐干中主要腐败菌的分离及其系统发育

1、传统豆腐干中主要腐败菌的分离及其系统发育灯解干址中国的伐筑E贷"其主咚卓料址大畀”富會蛋白质.不饱和脂肪離.钙及金族常生素*是我国居民睹徵中忧辰曲物蚩门战的审硬来濂.除蛋孰懒外.H余必爵总基強的组底与比例同动勒蛋片相徵血H常青咎物缺乏的戟辄酸*同时大豆中还畫有丰奇的确，铁和钙等微fit元素”、由于豆廂干中背养丰富*浙以豆腐干非常容域嘴WU而引起豆厲干变威的原n堆卒种芸样的，柱不同坏境卜'引起豆腐干变质的原闵是仃竝别的总的米说汚I起H干变農的T：譽原因是微生梅引起的.严朮眾响K*冷的品庙，井冒致严市的经济損供和食帖空全2为此笔希収廊麒的豆廊干为材料进行廊败微住物的令离,羟龍绘发

2、育分析初步确定其井类地位，从而为控制豆腐干生产过稈中进荷澈牛.物沁染控制提供有价值的數冊券垮I材料与勺法IJ豆揭干料本的采栗康芈腐Kt融化的豆删干样品"低温探R林抉进fj微生物的分离检测1.2孑薦培体展、(:s琼脂培养韓：酵母件&酪蛋rm%酸2月谷氨酸钠理.柠It酸三钠3g.MgSO4-7H2Olg.CaCL-2H：()().5gK(：llgFeCh2-4U;()0.5mgLB琼脂培养基：蛋门腕10氏酵母粉5gtNuCl10g-肉汤营养琼脂培养菇：蛋白lOg牛肉音粉3g.NuCl5gaTYG培养娃：蛋白腺5g.fi?母青10乩葩荀糖r7H2()lgtC；i(：l：-2HX)(

3、).5gtXaHCO.0決上述培弄基为11而要W成分的虽其中琼脂使用S：为1Sg.pH被调戮为7-75。1.3生物的分离无蘭操作条件下移収腐败溶化的豆腐干组织液100"溶于900|iL灭慚水中.进行倍比稀秤分别収100M稀释蘭液均匀涂布于分离培养驀I：每浓度做两个平行.37养。1.4倉俅DNA的小量援取哭用Cui抽提法提収微生物总I)、A所仔操作步驟应轻柔避免DNA受到损伤而斷裂。1.5 I6SrDNA虽囚的PCR扩增PCR扩堀采用的正反向引物为27F(55GAGTTrGATCCTCGCTCAG-3r)和反向引物1492R(5-(；(；TTACCTT(；TTACGACTT-3'

4、;):引物由上海Sangon公司合成扩增体系为50口,.扩増片斯大小约1500呦IX：II反应条件：95V预变性4血叭94戏变性lmin.50iU火lmin.72X：延伸2minv3O个循坏；最后72七保持lOmin,凰囚序列比对与系统进化发克分析Hi据序列结果采用EzTaxonserver2.14I：具比较其lW株的16SrKNA基因与有效命名物种的序列相似性o根据测序结果用Blast程序从GcnBank等公共数现库中搜索出同源性较高的相关阿秣的I6SrRNA基因序列.以CIASTAI.X软件进行多序列比对'系统进化矩阵根据Kimura離型估算用MEGA4.0(MolecularEv

5、olutioiian*GeneticsAnalysis)软件采用邻接法(Neighbor-joining)聚类分析并构建出系统进化鞫同时霾貝取样1000次进行fl展S(bootstrapvalue)分析來评估系统进化树的拓扑结构的稳定性S2结果与分析2.1腐败徴生扬的分爲用实验设计的4种分离培养基对腐散的豆膺干进fj微生物的分离共分离获紂26秣茴一从蘭落形态观察去电复挑取4株形态略(IK异的菌株进fJI6SrKNA圳闵序列测定序列长度大约145(叶采用EzTaxonMrncr2.1工八比较其茴株的16SrRNA基因与仔效命名物种的序列相似性.其相似性结果W.农I根据测序的结果.轴败伯上嬰仃2种

6、.l!|lleudimion(tswrupnosafllfineillussubtilis.其对应的河株編号为DFG01和DFG02它们分别是Q腐干腐敢的I：要微生物根据统计以IW株DFG01为代表的腐败微生物占到64.2%,以蘭株DFG02为代衣的腐败微生物占到35.8%。农丨分肉曲栋与亲缘曲株的相似性Tab.1SimilarityrelationtonearestneighborsofstrainsisolatedSlruinSimLrilyWtDFG0IlsrutlttnufnaxrirrugirioA/j99.7DFG02Rtuillusmhlilii99.52.1届敗傲生物的系统发育

7、分折对获得的腐败微生物2个代表菌株DFG01和DFG02采用EzTaxonserverZ1工具比较其蘭株的I6SrRN.效命名物种的序列郴似性实验结果表明蘭株DFG0I尿FPseudomonas与Pieudomonasaeruginosa具仔最近的亲缘关系.其同源件fii达99.7%；另一株伯1)E(X)2居于Hacillus.与Bacillussubtil亲缘关系处近达到99.5%对分离的细蘭用Bl«t搜索软ft从GcnBank.EMBL和DDBJ等公共«(据库中进行相似件捜索.调出相似性最高的相关菌株的I6SrRNA基因序列与已知亲缘关系较近的物种采用CLLSTALX轶

8、件逍行序列比对.MEGA软件进行相似性计算进化距离矩阵计灯.聚类分析和系统进化询的构建等系统发仔分析结果见图1和图2。系统发仔农明.分离获得的的株DFG01同亲缘关系最近的物种Pseudomonas以非常髙的门展值聚类在一起形成独立的分支单元这与EzTaxonserver2工具比对分析的结果相一致(见农1)。同时菌株DF(X)2同Bacillus属的物种以极高的自展值聚类在一起J於成-个大的分支单元。这些结果农明了腐败做生物在基囚遗传学上的分类地位为进一步从宰因水半上进fr防拎提供J很好的參考依100DFOlPseudomonasaexutiosaATCC17588rtP002881)Pseu

9、doojusotibduXCC10330T<T353117)PseudoonasputxUDSIC29176667)PstudononasJaf«a0I2TAT361537)«n»eusDSM228ISB175655)0005ffl1曲栋DFG01同匸知I同激先系牧近荷栋的16SrRNA*因系统发fi树Rg.1PhylogenetictreeofthestrainDFG01isolatedandnearneighborscalculatedfrom16SrRNAgenesequencesusingtheneighbour-joningmeftitd76&qu

10、ot;GO2Bcihssub心BAXKR2t«C683835)oBcihssubfissubspxiaquosoramBCSC3A28TU138167)Bcihs24XraJ8318I3)BtciAisnhnssFO-F234850FusaeilussolCC-YMP-6T<EV213011>0005ffl2曲栋DFG02同己知同滋X萦絞近荫株的16SrRNAUI町系久Fig.2PhylogenetictreeofthestrainDFG02isolatedandnearneighbourscalcubtedfrom16SrRMAgenesequencesusingthe

11、neighbour-joinngmethod(下转第36W)3讨论豆腐干是中国大众普遍消费的苕养父品.因其含疔丰富的蛋门頂.脂肪糖类等微生物生长的理想条fllij易彼微生物汚染本尖验中发现悲臭假单匏蘭(Iudomofuisaerupifioa)W枯乍芽他H恆(Baciblussubtil)是"I-中1耍的«败菌在干牛产过程中要注意加强这方面的微生物防控。刃外其他学者研究发现对于不同的9腐产品K胳败菌也不尽相同一TuitemwongK°研究豆腐及其潘出液的腐畋恂时发现融臭假单胞|W(Pteudomonmaeruginosa)片球|WW(Pediococcusp)等是

12、主要的腐畋微生物:Hegeman10研究真空包装的石育豆腐发现乳酸细蘭和肠道蘭属上要的腐败倘；李博'研究发现GDLsJK中坚強芽他HHlfllW肠球荫是主耍的*$nv王eHi,«息引发非发酵性厲制品豆腐腐败变质的上耍细蔺是成团肠朴佝、短小芽他杆凿和巨大芽抱卄菌豆膺制品的微生物来游上嬰为療材料生产环境、伐品包装生产过程和操作人员零：冈此在原料.产阳加工贮存零环卩务必加强卫生管理确保产品品质。同时«!定微生物的分类地位fa可根据其生长Vi性制定相关防控体系也可以从分子遗传学水r上加以控制。参考文献I乍唐亮蒋止升豆JK类试制与质蝕控制技术的研宪【J安H农业科学.2011.

13、39(13):7718-7720.2鼻Ml.箱保Y.葡備糖酸内加”JK生产过用中肚生物的变化及d堀中主经席败佔的鉴定J1.食品科学.2006.27(5):77-823CuiX1.,MaoP,ZrtigM.rlal.Slfr|)tiiiM>n<t4porasalinaprn.nnv.*|knov.anminnnl)rrof(anuly<M*4nliii|>-MMfUfJ|.IniJS)mIEvolMirmliiol.2(X)1(51):357-3634ChunJIxrJ.JungYrlu).Ezlux<m：awrb-baMIlootfortheNlrrifii

14、9;Hlionof|mikMr)<ilr«hasnlon16SiiImimiiiuIRNAgrnrM*qu<ii<<?%J.IntJSylEv<JMmibiol2«)7(57)：22542261由农3可知.回0榄型中显蔷项分别为ACJ),AB.ACX：I)%ABCI)2Jl!P值的大小可以nHi响桑荧总黄伺捉取含虽的齐因索人小顺序为：提収时何微浚时间微液功率乙醉体枳分数其中微波时何微波功仪提取时何为极"乙醉体积分数为显酱。12.2两因素何的交互作用分析Design-Expert的图形是特定的响应面Y对应于因素A.B.CJ)值构成的一个

15、三推空何在二维乎面上的等高图可以直观地反映备因素对响应值的妙响.从所紂响应面分析图上可以分析出它们之间的相H作用对响应值的形响"。结栗见图7比较6组帼可知：提収时间、微波时何微波功华对总黄|*J提収含虽的形响较为显并.农现为曲线牧陡:ifU乙醇休枳分数衣现为Uli线较为平滑.4随其数值旳增加或减少响应值变化较小：的因素交互作用由大到小为:微波时何和微波功半微波时何和乙醇体积分敌微波时何和提収时间做波功率和乙醉体枳分数微波功率和捉収时间乙醉体枳分敌和是取时何。浸提法捉収桑黄总黄AH捉収匸艺的优化巧验if结果运用Design-Expert8.0软件进行优化分析.以获紂监住的提収条件紿响应

16、Ifll分析辰适提取条件为微波时间61.63s微波功率乙醇体枳分68,28%.捉取时何2.1711.此条件卜桑黄中总黄厠提馭倉虽为299()mg/&为了实绘方便将实柴条件修改为微波时何62»微波功率550Ww乙醉体积分数70%.提収时何22h实际测定提取率为29.96ng/g,与理论预测值垒本吻合说明御到的二次冋H方ft?与实际惜况拟合较好3结论木试验先通过单闲索实验确定微波时何微波功率.乙醇体枳分数和提取温度足影响桑黄总黄AH捉収含址的主耍因素'再通过响应血分析和等高线图得出嚴佳工艺条件为：微波时何62趴微波功率55OW、乙醇体积分数68%、捉収时间2.1711该条

17、件卜的桑黄总黄伺提収含圮为2996mg/g巧模型预测值29.90ing/g相左较小农明将响应而及计引用到集黄总黄IW提JU匚艺中是可行结果可靠。参考文献1:刘存卿隊诰银林跃血药用典濟桑黄的研究进展J.苗物研究20322.53-59.(2江»WIX学降冲药大词典M1.1:海:I:沟科学技术岀tttt.19953：周“山马初乐集曲及莫药珊作用研究邊展Jtr用曲20052?(2)：50-51.4：31克陈劲声紆.桑貢"种抗癌药物活性比ttiJJ.W休人7学瓠(只学版200228(3)：247-249.5：刘艳芳杨点.肝愷等舛用鹿彻微黄总黄制测定方法研学报,2006.13(2):45-48.6张玉香.JBB