朱玉贤 分子生物学 第9章 原核基因表达调控

1、第九章第九章 原核核基因表达调控原核核基因表达调控Controlling of the Gene Expression of Prokaryote第一节第一节 基因表达调控概述基因表达调控概述DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制基因表达基因表达(gene expression)-基因转录及基因转录及翻译的过程。翻译的过程。rRNA、tRNA的合成属于基因表达的合成属于基因表达l 中心法则中心法则(the central dogma)：为什么基因功能要调控？为什么基因功能要调控？l 基因表达的时间性和空间性基因表达的时间性和空间性时间特异性时间特异性某一基因的表达严格按特定的时间顺序发

2、生某一基因的表达严格按特定的时间顺序发生 Hb (hemoglobin) 22 22 22 2 2 2 22% 97% 1%2% 97% 1% - -样亚基样亚基 - -样亚基样亚基Each of the -like and-like globin gene families is organized into a single cluster that includes functional genes and pseudogenes.空间特异性空间特异性(spatial specificity) 在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序

3、出现同组织空间顺序出现 同形异位现象同形异位现象( (homeosishomeosis): ): 果蝇头部长触角部位长出脚来果蝇头部长触角部位长出脚来 同形异位盒基因同形异位盒基因(homeobox) :高度保守的一段核苷高度保守的一段核苷酸序列（酸序列（180bp）,控制胚胎发育的基因控制胚胎发育的基因l 遗传信息表达的方式遗传信息表达的方式 组成型表达（组成型表达（constitutive expression）Housekeeping geneHousekeeping gene 诱导型表达诱导型表达 （inducible expression by signaling molecular

4、）Luxury geneLuxury gene 顺、反因子间互作方式的基因表达调控顺、反因子间互作方式的基因表达调控EpistasisEpistasis effect effectl 原核生物对环境的适应，相关的应答原核生物对环境的适应，相关的应答真核生物的细胞分化真核生物的细胞分化, , 组织特化组织特化 , , 个体发育个体发育以及环境对个体表型的影响都是以及环境对个体表型的影响都是基因表达的结果基因表达的结果l 基因表达的调控涉及基因表达的调控涉及RNA转录的开转录的开/关，数量，选择性加工关，数量，选择性加工蛋白质翻译速率，数量，加工与蛋白质翻译速率，数量，加工与 降解和分泌降解和分泌

5、l 原核生物与真核生物基因原核生物与真核生物基因 表达调控机制具有惊人的相似性表达调控机制具有惊人的相似性共同的起源与共同的分子基础共同的起源与共同的分子基础调控机理上调控机理上调控层次上调控层次上核酸分子间的互作核酸分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作transcriptional levelposttranscriptional leveltranslational levelposttranslational level l 转录水平上的调控是最为经济转录水平上的调控是最为经济, 灵活，又是最为重要，复杂的调控灵活，又是最为重要

6、，复杂的调控 在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点 精细调节基因表达的水平精细调节基因表达的水平, 以保证生物体对环境的适应以保证生物体对环境的适应 cis factor & trans factor 间严格而又灵活的互作间严格而又灵活的互作 保证保证RNA polymerase 的进行式转录的进行式转录 （不中断，准确终止）（不中断，准确终止）第二节第二节 原核基因调控机制原核基因调控机制内容提要：操纵子学说操纵子学说原核基因调控机制的类型与特点原核基因调控机制的类型与特点转录水平上调控的其他形式转录水平上调控的其他形式 一、一、

7、操纵子学说操纵子学说1、操纵子模型的提出、操纵子模型的提出l 19401940年，年， MonodMonod发现细发现细菌的菌的“二次生二次生长曲线长曲线”。l 19511951年，年，MonodMonod与与JacobJacob合作，发现两对基因：合作，发现两对基因： Z Z基因基因：与合成：与合成-半乳糖苷酶有关；半乳糖苷酶有关； I I基因基因：决定细胞对诱导物的反应。：决定细胞对诱导物的反应。l SzilardSzilard：I I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物

8、。去掉该阻遏物。l JacobJacob：结构基因旁有开关基因（：结构基因旁有开关基因（操纵基因操纵基因），），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。的表达。乙酰基转移酶乙酰基转移酶半乳糖苷半乳糖苷透性酶透性酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶操纵子操纵子2、乳糖操纵元、乳糖操纵元结构结构调节基因调节基因Control elementStructural genes 调节蛋白调节蛋白 结构基因不转录结构基因不转录 诱导物诱导物 结构基因转录结构基因转录调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白激活蛋白激活蛋白正转录调控正转录调控负转录

9、调控负转录调控二、二、 原核基因调控机制的类型与特点原核基因调控机制的类型与特点l 根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，的应答，可分为：可分为：正转录调控正转录调控和和负转录调控负转录调控可诱导调节可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 例：例：大肠杆菌的乳糖操纵子大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因分解代谢蛋白的基因l 根据操纵子对某些能调节它们

10、的小分子的应答，根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可分为可诱导调节可诱导调节和和可阻遏调节可阻遏调节两大类：两大类：调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因阻遏蛋白阻遏蛋白诱导物诱导物mRNA酶蛋白酶蛋白酶合成的诱导酶合成的诱导操纵子模型操纵子模型诱导物如果某种物质能够促如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱它，这种物质就是诱导物。导物。例：例：色氨酸操纵子、色氨酸操纵子、合成代谢蛋白的基因合成代谢蛋白的基因调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋

11、白酶蛋白调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物辅阻遏物（corepressor）如果某种物质能够阻止细菌产生合成这如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。可阻遏调节可阻遏调节l 负转录调控系统负转录调控系统又可分为：又可分为：负控诱导：负控诱导：阻遏阻遏蛋白蛋白+诱导物诱导物结结构基因转录；构基因转录；负控阻遏负控阻遏：阻遏阻遏蛋白蛋白+辅阻遏物辅阻遏物结构基因不转录。结构基因不转录。l 正控系统又可分正控系统又可分为：为：正控诱导：正控诱导：诱导诱导物的存在使激活物的存在使激活蛋白处于活性状蛋白处于活性状

12、态；态；正控阻遏：正控阻遏：辅阻辅阻遏物遏物的存在使激的存在使激活蛋白处于非活活蛋白处于非活性状态性状态。第三节第三节 乳糖操纵子乳糖操纵子( (laclac operonoperon) )内容提要：内容提要：乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构酶的诱导酶的诱导laclac体系受调控的证据体系受调控的证据乳糖操纵子调控模型乳糖操纵子调控模型影响因子影响因子LacLac操纵子中的其他问题操纵子中的其他问题一、一、 乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构lacI, 1045bp，独立，独立PilacZYA二、二、 酶的诱导现象酶的诱导现象-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解底物的酶只有在底物存在时才出现！分解底物的酶

13、只有在底物存在时才出现！ 无乳糖时，几个无乳糖时，几个-gal/cell-gal/cell 加入乳糖时，加入乳糖时，50005000个酶分子个酶分子 再去掉乳糖，再去掉乳糖，laclac mRNA mRNA下降下降 乳糖能激发乳糖能激发lac mRNA的合成的合成 乳糖的诱导作用是由酶前体乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合转化而来，还是诱导新酶合成？成？ 培养基（培养基（3535S-aa, S-aa, 无乳糖）无乳糖） E.coliE.coli繁殖繁殖培养基（无培养基（无3535S -S -aa, aa, 加入乳糖）加入乳糖） -gal(-gal(无无3535S) S)三、三、

14、调控机理调控机理体外结合竞争实验体外结合竞争实验: : 阻遏物阻遏物RNA RNA polpol, off, off RNA RNA polpol阻遏物，阻遏物， onon1. 阻遏状态阻遏状态2 诱导状态诱导状态诱导作用：在可诱导的操纵元中，诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性子后，开启基因的转录活性3 诱导物不是乳糖！不是乳糖！生成生成lac诱导物诱导物乳糖代谢乳糖代谢Allolctose 异构乳糖异构乳糖 别乳糖别乳糖细胞内细胞内-半乳糖苷酶来源半乳糖苷酶来源?4、gratuitous inducer 安慰诱导

15、物安慰诱导物 义务诱导物义务诱导物 可诱导半乳糖苷酶产生，可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物但不是其底物 IPTG，异丙基硫半乳糖苷异丙基硫半乳糖苷 X-gal, 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-半乳糖半乳糖（发色底物）（发色底物）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶去阻遏去阻遏葡萄糖葡萄糖+别乳糖别乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG 不是不是-半乳糖苷酶半乳糖苷酶可切割的底物可切割的底物 CH2OH CH3 HO O SCCH3 H CH3 OH HH H H OH图16-6 异丙基-硫代半乳糖苷的分子结构四、四、 阻遏蛋白的作用机制阻遏蛋白的作用机制1、阻遏蛋白结构、阻遏蛋白结构38KD，4 聚体聚体

16、，一个亚基结合一个一个亚基结合一个IPTG分子分子lacI 组成型转录组成型转录 Pi 弱启动子，弱启动子， 510个个cell具有二重性具有二重性 阻止转录（与阻止转录（与lacO结合）结合） 开始转录（与开始转录（与诱导物诱导物结合）结合） 阻遏蛋白的阻遏蛋白的结构域结构域 头段：头段：-NH2端，端，lacO结合区（大沟）结合区（大沟） 绞链区：绞链区： 核心段：核心段：诱导物结合诱导物结合-COOH： 两组亮氨酸两组亮氨酸拉链，形成四聚体。拉链，形成四聚体。4个亚基的核心片段接触形成四聚个亚基的核心片段接触形成四聚体体阻遏蛋白单体的结构 Helix-turn-helix Core do

17、main1 Core domain2 1 51 80 360 DNA binding Hinge Inducer binding Oligomerization 图 16- 阻遏蛋白单体的结构和功能 对称轴，对称轴，+11 对称序列，对称序列，6bp2、阻遏蛋白的结合位点、阻遏蛋白的结合位点lacO的结构的结构3、 组成型突变： lacOc cis-dominant组成型突变： lacI- lacIlacI- -/lacI/lacI细胞表型？细胞表型？ Repressor has lost lacI S genesythesizes Iducer-binding site defective

18、repressor that cannot bind inducer; it binds permanently to operator lacI S Operantor lacI + wild-type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 图图 16- Uninducible lac S mutations are dominant 3、不可诱导突变（超阻遏）：lacIs 等位基因间的互补等位基因间的互补（interallelic complementation）。 负的互补负的互补（negative comp

19、lementation） lacI-d的产物和的产物和lacI+的产物组成多聚体时，阻的产物组成多聚体时，阻遏蛋白无活性。遏蛋白无活性。 反式显性反式显性（trans-dominant） 显性失活显性失活（dominant negatives）Mutations map the regions of the lacl gene responsible for different functions. The DNA-binding domain is identified by lacI-d mutations at the N-terminal region; lacl- mutations

20、 unable to form tetramers are located between residues 220-280. Other lacI- mutations occur throughout the gene. lacIs mutations occur in regularly spaced clusters between residues 62-300. 4、阻遏蛋白对、阻遏蛋白对RNA pol功能的影响功能的影响 阻遏蛋白和阻遏蛋白和RNA RNA polpol可同时与可同时与DNADNA结合结合 RNA RNA polpol 与启动子结合的平衡常数与启动子结合的平衡常数

21、 1.91.910107 7 有阻遏蛋白时有阻遏蛋白时, 2.5, 2.510109 9 结合着的结合着的RNA RNA polpol不能转录不能转录. . 但加入诱导物后但加入诱导物后, , 释放出阻遏蛋白释放出阻遏蛋白, , 变为开放型启动子复合物变为开放型启动子复合物. . 阻遏蛋白实际上使阻遏蛋白实际上使RNA RNA polpol贮存在启动子上。贮存在启动子上。这一模式是否存在于其它操纵元系统中？这一模式是否存在于其它操纵元系统中？+ glucose- glucoseTime (hr)Units of -galactosidase+ lactoseGlucose added五、五、

22、lac operon的正调控的正调控 诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动物并不能启动laclac基因表达基因表达, ,有其它因素参与有其它因素参与1、代谢物阻遏效应、代谢物阻遏效应 实验：在实验：在laclacGluGlu培养上培养上 E.coliE.coli只利用只利用G G，只有，只有G G 耗尽时，才会利用耗尽时，才会利用laclac葡萄糖抑制葡萄糖抑制lac mRNA的的转录：转录： 葡萄糖对葡萄糖对laclac操纵元表达操纵元表达的抑制是间接的的抑制是间接的 乳糖的降解是通过乳糖的降解是通过cAMPcAMP与与 CAPCAP结合起作用

23、的结合起作用的CAP, catabolite activator protein 由由crp编码编码（1 1）它可能直接和）它可能直接和RNA RNA PolPol相互作用；相互作用；（2 2） 作用于作用于DNADNA，改变其结构，从而，改变其结构，从而 帮助帮助RNA RNA PolPol结合。结合。 NH2 P P POCH2 ATP OH OH Glucose DNA Adenylcyclase Ihibition ? RNA pol + cyclic AMP + protein factor needed for NH2 transcription to tack place OCH

24、2 “ X” Protein factor Cyclic AMP (catabolite) RNA P O OH Stimulation Phosphodiesterase NH2 P OCH2 5AMP OH OH 图 16- Control of catabolite-sensitive transcription through cyclic AMP + + + + + + + + 转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低时浓度低时不促进转录不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAP2 2、CAPCAP的正

25、调控的正调控ATPATP腺甘酸环化酶腺甘酸环化酶cAMPcAMP（环腺甘酸）（环腺甘酸） 协调调节协调调节（负性调节与正性调节协调合作）（负性调节与正性调节协调合作）结论：结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCo

26、me on, let me throughNo wayJose!CAPCAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.

27、Yipee!The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseAlright, Im off to the races . . .Come on, let me through!3、

28、CAP结合位点结合位点 CAPCAP为二聚体，为二聚体， 45KD 45KD ，被，被cAMPcAMP激活激活 结合位点结合位点22bp I -70 -5022bp I -70 -50 II -50 -40 II -50 -40ARAR由于序列的差异，使不同基因受由于序列的差异，使不同基因受cAMPcAMP激激活的水平不同活的水平不同结合位点序列保守结合位点序列保守4、CAP的结合对的结合对DNA构型的影响构型的影响 DNADNA弯曲弯曲 弯曲点位于弯曲点位于CAPCAP结合位点二重对称的中心结合位点二重对称的中心 弯曲弯曲使使CAPCAP能与启动子上的能与启动子上的RNA RNA polpo

29、l 接触接触（1 1）CAPCAP结合位点与结合位点与转录起始点的位置转录起始点的位置 CAPCAP与与转录起始点转录起始点的距离，相距数个的距离，相距数个整双螺旋整双螺旋 CAPCAP结合位点在结合位点在启启动子动子的上下游，都的上下游，都能发挥作用能发挥作用5、CAP对转录的影响对转录的影响（2 2）基因转录对）基因转录对cAMPcAMPCAPCAP系统的依赖性，系统的依赖性， 与启动子本身的效率有关与启动子本身的效率有关cAMPcAMP-CAP-CAP复合物的结合，使位点复合物的结合，使位点II II附近的富含附近的富含GCGC区域双螺旋结构稳定性降低，因而区域双螺旋结构稳定性降低，因而

30、-10-10区的熔解区的熔解温度降低，促进开放型启动子复合物的形成温度降低，促进开放型启动子复合物的形成（3 3） CAPCAP激活转录的方式激活转录的方式 CAPCAP直接作用于直接作用于RNA RNA polpol 亚基亚基 缺失缺失RNA RNA polpol 亚亚基的基的C C末端时，失末端时，失去受去受CAPCAP激活的能力激活的能力 作用于作用于DNADNA，改变其改变其结构结构6.3.6 lac operon 的其它问题的其它问题1lac operon的功能是在的功能是在正负正负两个调控体系的协调作用两个调控体系的协调作用(coordinate regulation)下实现的。下

31、实现的。阻遏蛋白封闭转录时，阻遏蛋白封闭转录时，CAPCAP不发挥作用；如没有不发挥作用；如没有CAPCAP加强转录，即使阻遏蛋白加强转录，即使阻遏蛋白从从P P上解聚仍无转录活性上解聚仍无转录活性CAP组成型合成，所以组成型合成，所以cAMPCAP复合物取决于复合物取决于cAMP含量含量腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此酶有关，因此cAMPCAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶糖等糖类代谢有关的酶降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵

32、元就不表达元就不表达 2. A基因及其生理功能基因及其生理功能 编码编码B-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！不参与乳糖代谢！ 生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒. 所以所以lacA虽不在乳虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3. lac基因产物数量基因产

33、物数量， 1：0.5：0.2 不同酶的数量差异不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节是由于在翻译水平上的调节. 方式有二方式有二:核糖体脱离核糖体脱离: 多顺反子的差别性翻译多顺反子的差别性翻译 内切酶作用内切酶作用: 在在lac mRNA分子内部，分子内部，a基因比基因比z基因更易基因更易受内切酶作用受内切酶作用4 4、操纵子的融合与基因工程、操纵子的融合与基因工程P OZYAtsxPOpur结构基因缺失lac operonpur operonSummarySummary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of

34、 lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthigh rate of expression6.4 色氨酸操纵子（trp operon）内容提要：内容提要： 色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子的色氨酸操纵子的阻遏系统阻遏系统 色氨酸操纵子的弱化机制色氨酸操纵子的弱化机制生物细胞中的氨基酸合成，生物细胞中的氨基酸合成， 也受操纵元的调节。细胞需要也受操纵元的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表

35、达，不需要时基因关闭，达到经某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。济的原则。6.4.1 色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的结构 调控基因调控基因 结构基因结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸催化分枝酸转变为色氨酸 的酶的酶trpRtrp 分支酸 邻氨基苯甲酸 磷酸核糖基 CDRP 吲哚甘油-磷酸 色氨酸 邻氨基苯甲酸 邻氨基苯甲酸合成酶 吲哚甘油 色氨酸合成酶 硼酸合成酶 链 链 60，000 60，000 4 5，000 50，000 29，000 P O l a trpE trpD P trpC trpB trpA t t 1560 1620 1353 1191 804

36、36P：起动子；O：操纵子； l：前导序列； a：衰减子； t,t ：终止子 图 16-15 E.coli trpO 的结构及其产物所催化的色氨酸合成反应磷 特点特点: : (1) (1) trpRtrpR和和trpABCDEtrpABCDE不连锁；不连锁； (2) (2) 操纵基因在启动子内操纵基因在启动子内 (3) (3) 有衰减子有衰减子(attenuator)/(attenuator)/弱化子弱化子 (4) (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列前导序列(Leader)(Leader)所所隔开隔开 6.4.2 6.4.2 TrpTrp o

37、peronoperon 的阻遏系统的阻遏系统（1） Trp R 四聚体四聚体阻遏蛋白阻遏蛋白trp 有活性的阻遏物有活性的阻遏物 SNE299trp O 不转录不转录（2 2） 阻遏蛋白的结合位点阻遏蛋白的结合位点 trpO -21 +1，反向重复序列反向重复序列 trpP -40 +18 活性阻遏物与活性阻遏物与trpO 的结合与的结合与RNA pol与启动子的结合与启动子的结合发生竞争发生竞争（3 3） 阻遏系统阻遏系统 主管转录是否启动，主管转录是否启动， 在缺乏在缺乏Trp时，时， mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般起始合成，但不能自动延伸，一般在在trpE之前终止转录之前终止转录

38、 粗调开关粗调开关6.4.3 弱化作用弱化作用 （attenuation）（1） 弱化子，衰减子，弱化子，衰减子， 前导前导RNA，140bp序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构TerminatorTerminatorS312POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons1432（2） 前导肽14aa（3 3）转录弱化作用）转录弱化作用Lack of trp Lack of trp Lack of aminoacyl tRNA Lack of aminoacyl tRNA Ribosome pause at trp Ribosome pause at trp

39、 codonscodons , occluding , occluding sequence 1sequence 1Form 2:3 hairpin Form 2:3 hairpin Transcription into trpE Transcription into trpE and beyond and beyond High trp High trp Trp is inserted at the Trp is inserted at the trp codons trp codons Translate to the end of Translate to the end of lead

40、er message leader message Ribosome occlude Ribosome occlude sequence 2sequence 2Terminate transcription at Terminate transcription at (3:4 form (3:4 form terminatorterminator) )弱化子对转录调控的关键 空间结构，空间结构，10th and 11th codons encode trp residues (rare AA) 时间，核糖体停顿在时间，核糖体停顿在2个个Trp 密码子上时，产生延密码子上时，产生延宕，宕， 此时

41、此时4区未转录出来区未转录出来The leader peptide is to determiner trp availability and to regulate transcription terminationsummary6.4.4 阻遏作用与弱化作用的协调阻遏作用与弱化作用的协调 阻遏效率阻遏效率 启动子的转录起始频率在启动子的转录起始频率在R+和和R-相差相差70倍倍 弱化作用弱化作用 trp存在时，约有存在时，约有10的的RNA pol侥幸转录侥幸转录 - trp 活性阻遏物活性阻遏物 无活性阻遏物无活性阻遏物 +trpNegativerepressible Negativer

42、epressible operonoperon可以被最终合成产物所阻遏可以被最终合成产物所阻遏R P O leading seq. E D C B Atrp+为什么需要阻遏体系？为什么需要阻遏体系？ 当大量当大量Trp 存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导合，阻止先导mRNA合成。合成。 经济经济仅有少量仅有少量 trp时，时，RNApol启动，启动，但在但在L.S.处脱落，转录中断处脱落，转录中断R P O leading seq. E D C B A少量少量trp+不足以结合不足以结合 O 位点位点为什么需要弱化系统？为什么需要弱化系统？ 当

43、当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发慢，不能很快引发trp 合成。因此需要一个能快速作出反应合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。水平。6.4.5 细菌演化出弱化系统的生物学意义细菌演化出弱化系统的生物学意义 通过通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏荷载与否进行调控，更为灵敏 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA 荷载为标准进行调控更为恰当荷载为标准进行调控更为恰当 两个调控系统，避免浪费提高效率两个调控系统，避免浪费提

44、高效率 阻遏系统阻遏系统 高水平高水平trp时，不转录时，不转录 低水平低水平trp时，转录至时，转录至LS 弱化系统弱化系统 细调细调 原核生物细致的精细调控机制原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性增强原核生物对环境的适应性6.5 其他操纵子6.5.1 半乳糖操纵子半乳糖操纵子( (galactosegalactose operonoperon) )异构酶异构酶(galE)乳糖乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)半乳糖激酶半乳糖激酶(galk)。gal操纵子的特点：操纵子的特点： 它有两个启动子，其它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开可从两个

45、不同的起始点开始转录；始转录； 它有两个它有两个O区，一个在区，一个在P区上游，另一个在结构基因区上游，另一个在结构基因galE内部。内部。6.5.2 阿拉伯糖操纵子（阿拉伯糖操纵子（arabinosearabinose operonoperon) ) araBaraB基因、基因、araAaraA基因和基因和araDaraD, , 形成一个基因簇，形成一个基因簇，简写为简写为araBADaraBAD 三个基因的表达受到三个基因的表达受到araara操纵子中操纵子中araCaraC基因产物基因产物AraCAraC蛋白的调控。蛋白的调控。araara操纵子的调控有两个特点：操纵子的调控有两个特点：

46、 第一，第一，araCaraC表达受到表达受到AraCAraC的自身调控。的自身调控。 第二，第二，AraCAraC既是既是araara操纵子的正调节蛋白（需操纵子的正调节蛋白（需cAMPcAMP- -CRPCRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过这种双重功能是通过AraCAraC蛋白的两种异构体来实现蛋白的两种异构体来实现的（的（PiPi和和Pr)Pr)。6.5.3 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答SOS反应的机理：由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。LexA阻遏物：是SOS DNA修复系统所有

47、基因的阻遏物RecA蛋白：是SOS反应的最初的发动因子。在单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活，表现出水解酶活性，分解LexA阻遏物。当RecA水解LexA阻遏物后，导致SOS体系（包括recA基因）高效表达，DNA得到修复6.6.1 翻译起始的调控 RBS（核糖体结合位点）：mRNA链上起始密码子AUG上游的一段非翻译区。 RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码子AUG之间的距离。 SD- 4-10（9）-AUG6.66.6 转录后水平上的调控转录后水平上的调控6.6.2 稀有密码子对翻译的影响dnaG(引物酶) RNA引物dnaG、rpoD和rpsU属于大肠杆菌基因组上

48、的同一个操纵子50个拷贝的dnaG蛋白、2800个拷贝的rpoD和40000个拷贝的rpsU几种蛋白质中异亮氨酸密码子使用频率比较蛋白质AUU/%AUC%AUA%结构蛋白37621亚基26740DnaG蛋白363232细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。6.6.3 重叠基因对翻译的影响重叠基因对翻译的影响TrpB 谷氨酸- 异亮氨酸-终止 GAA - AUC - UGA - UGG - AA AUG - GAA 甲硫氨酸 谷氨酸trpAtrpE苏氨酸苯丙氨酸终止 ACU - UUC - UGA - UGG - CU AUG

49、AUG GCU 甲硫氨酸 - 丙氨酸- trpD 翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码子保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。 6.6.4 反义反义RNARNA（antisense RNAantisense RNA）的调节作用）的调节作用u干扰干扰mRNA的互补的互补RNA ,可作为调节物质可作为调节物质 ？！？！u 可与可与mRNA结合，结合， 结合位点是结合位点是S-D, AUG, 部分部分N端密码子端密码子 与与RNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物形成双螺旋结构，作为内切酶底物 与转录产物结合，使转录提前终止与转录产物结合，使转录提前终止u 可以抑制基因的转录、可以

50、抑制基因的转录、RNA产物的加工或产物的加工或 mRNA的翻译的翻译 在细胞核和细胞质中都可以发生在细胞核和细胞质中都可以发生p 可以与靶可以与靶RNA形成双链体形成双链体p 双链体阻遏翻译起始，引起转录双链体阻遏翻译起始，引起转录终止，或产生核酸内切酶的作用终止，或产生核酸内切酶的作用位点位点p 在细胞核和细胞质中都可以发生在细胞核和细胞质中都可以发生u 小小RNARNA分子的翻译调节分子的翻译调节E coli 中外膜蛋白中外膜蛋白 ompF 的的 表达调控表达调控噬菌体，噬菌体，cII蛋白抑制晚期基蛋白抑制晚期基因转录因转录Tn10中转座酶翻译的调节中转座酶翻译的调节DNAanti-bfr

51、基因基因bfr基因基因anti-bfr RNAbfr mRNA RNARNA细菌铁蛋白细菌铁蛋白不存在不存在anti-bfr RNAbfr RNA失活失活bfr 编码细菌铁蛋白，正常转录编码细菌铁蛋白，正常转录mRNA其转录受到其转录受到Fur蛋白的调节蛋白的调节(Fur蛋白感受铁离子的变化蛋白感受铁离子的变化)例，例，细菌铁蛋白用来储存细胞中过剩的铁离子细菌铁蛋白用来储存细胞中过剩的铁离子培养基铁离子浓度高时，需要细菌铁蛋白培养基铁离子浓度高时，需要细菌铁蛋白E coli 中中 ompF 基因的翻译调节基因的翻译调节Env，编码渗透压感受器的受体蛋白编码渗透压感受器的受体蛋白ompC低渗时，

52、低渗时，ompC关闭，关闭，ompF增加增加高渗时，高渗时，ompC增加，增加，ompF下降下降ompC与与ompF是外膜蛋白，是外膜蛋白，受培养基渗透压的调节受培养基渗透压的调节6.6.5 RNA interference Gene silencing by dsRNAn植物植物：cosuppression (Rich Jorgensen, early 90s in 20th century )n真菌真菌： quelling (Cogoni et al, 1994)n动物：动物： RNA interfering Guo and Kemphues(1994): 向秀丽线虫注向秀丽线虫注射射pa

53、r-1基因的基因的antisense RNA，结果减弱了此基因，结果减弱了此基因的表达。但是，对照组注射的表达。但是，对照组注射sense RNA，也得到同，也得到同样结果？！样结果？！（1）The discovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811(Fire et al)Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationR

54、NAi现象的普遍性现象的普遍性n随后陆续发现随后陆续发现RNAiRNAi也存在水稻、烟草、果蝇及人等所也存在水稻、烟草、果蝇及人等所有的真核生物中。有的真核生物中。nRNAiRNAi能高效特医的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体能高效特医的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，内，RNAiRNAi能达到基因敲处的效果。能达到基因敲处的效果。RNA-Mediated Gene Silencing转基因沉默分为：转基因沉默分为： 转录后水平的沉默（转录后水平的沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS) 转录水平的沉默（转录水平的沉默（Transcription

55、al Gene Silencing，TGS) RNAi属于转录后水平的沉默。属于转录后水平的沉默。DICER- RNAse III, 双链特异性内切酶- 二聚体, 2 催化域, 螺旋酶和 PAZ 基序- 产生 2-3nt 3突出末端- ATP依赖的核酸酶RISC- RNA-induced silencing complex- RISC 包含siRNA- 前体被ATP激活- 发现和破坏 mRNA的互补 序列- 含有内切酶、外切酶, 切割 杂合链，紧接着降解之- ARO: PAZ domain (assembly)（2）RNAi的作用机制：的作用机制：siRNA形成阶段形成阶段RISC形成阶段形成

56、阶段效应阶段效应阶段沉默信号的放大与传递沉默信号的放大与传递RNAi 在组织间的传递在组织间的传递需要：需要： A) A) 从一个细胞到另一个细胞从一个细胞到另一个细胞 B) B) 信号进行放大信号进行放大A) SID, A) SID, 穿膜蛋白穿膜蛋白 ( (为信号运输提供通道为信号运输提供通道) )B) RdRPB) RdRP - RNA - RNA依赖的依赖的RNARNA聚合酶聚合酶 - - 存在于有些生物中存在于有些生物中 (drosophila, plants)(drosophila, plants) - - 通过扩增富集通过扩增富集siRNAsiRNA的浓度的浓度- siRNA -

57、 siRNA 为引物，靶为引物，靶mRNAmRNA为模板，合成为模板，合成 ds siRNA ds siRNARNAi放大信号放大信号dsRNARdRpDicermiRNARdRpdsRNATarget mRNARISCCleavage RNA degradation Transcriptional Gene Silencingplant: methylation in promotor regions leads to gene silencingMET as a part of RISCC.elegance: polycomb-dependent mechanism,polycomb proteins ass. with RISCchromatin remodeling: open close transitionsmall-temporal RNAslet7, lin4negative regulator of genes70nt precurser, processed by DICER, results not in dsRNAbind target and prevent ribosomal elongationRNA interference1、关于管家基因叙述错误的是、关于管家基因叙述错