细胞培养技术ppt

1、二在现代医学和生物科学研究中应用广泛二在现代医学和生物科学研究中应用广泛优点：优点：1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学和肿瘤学 等多种学科研究等多种学科研究.2.直接观察细胞的变化可便于摄影。直接观察细胞的变化可便于摄影。3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。到成体、正常组织到肿瘤。在现代医学和生物科学研究中应用广泛在现代医学和生物科学研究中应用广泛4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组便于使用各种技术：相差

2、、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况细胞状况。5.是是分子生物学和基因工程学分子生物学和基因工程学的研究对象，也的研究对象，也是其主要的组成部分。是其主要的组成部分。6.易于施用易于施用物理、化学生物物理、化学生物的实验研究。的实验研究。7.易于提供大量易于提供大量生物性状相似生物性状相似的实验对象的实验对象,耗资耗资少比较经济。少比较经济。8.成为生物制品成为生物制品单克隆抗体单克隆抗体生产和基因工程等生产和基因工程等的材料来源。的材料来源。缺点：缺点： 组织和细胞离体后独立生存在人工的组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环

3、境，仍有培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大很大差异差异。 因而利用培养细胞做实验因而利用培养细胞做实验时，时，不应视为体内细胞完全相同不应视为体内细胞完全相同，把实，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。的结论。七七. 细胞生存环境、条件和代谢细胞生存环境、条件和代谢 培养细胞生存途径和物质代谢与体内培养细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。定差异。（一）环境（一）环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无生存的首要条件。

4、保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。胞生存的基本条件。 (二二)温度温度：人哺乳动物：人哺乳动物：36.50.5;鸟类：鸟类：38.5; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过度上升不超过39时时, ,细胞代谢强度与温度细胞代谢强度与温度成正比。成正比。39401小时小时, ,受损伤的细胞可能恢复；受损伤的细胞可能恢复；41421小时小时, ,严重损伤严重损伤, ,个别细胞恢复；个别细胞恢复；43以上以上1小时小时，细胞全部死亡。，细胞全部死亡。温度不低于温度不低于0时时, ,细胞

5、代谢有影响细胞代谢有影响, ,无伤害作用无伤害作用; ;置于置于 2535，细胞能生存，但生长速度减慢；细胞能生存，但生长速度减慢；放在放在 4 数小时数小时, ,再放回再放回 37 细胞仍继续生长。细胞仍继续生长。细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时时, ,细胞因胞质结冰受损而死亡。细胞因胞质结冰受损而死亡。 (三三)气体环境和氢离子浓度气体环境和氢离子浓度气体气体：氧气和二氧化碳氧气和二氧化碳 氧气氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。增殖和合成各种所需成分。氧气分压氧气分压1

6、99589975Pa,适用于封闭式单层适用于封闭式单层细胞培养细胞培养;开放式培养开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于细胞置于95空气加空气加5二氧化碳二氧化碳混合气体环境中。混合气体环境中。 CO2 : 细胞代谢产物细胞代谢产物,也是细胞所需成分。其主也是细胞所需成分。其主要作用维持培养基要作用维持培养基的的pH值。大多数细胞的适宜值。大多数细胞的适宜pH7.27.4，偏离此范围对细胞将产生有害的偏离此范围对细胞将产生有害的影响。影响。有些细胞存在差异。如有些细胞存在差异。如羊水细胞羊水细胞培养检测染色培养检测染色体时体时pH为为7.6。 细胞耐酸比耐碱性大一些细胞

7、耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更在偏酸性环境中更 有利于细胞生长。有利于细胞生长。 为了维持培养液恒定的为了维持培养液恒定的pH，最常用最常用磷酸缓冲磷酸缓冲剂剂方法。方法。 磷酸缓冲剂中磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给可供给CO2但容易逸出，但容易逸出，适用：适用：封闭式培养的细胞。封闭式培养的细胞。（无（无CO2培养箱培养箱） Hanks平衡液平衡液: 含有低浓度含有低浓度的的NaHCO3,当打开含有当打开含有Hank液培养瓶时液培养瓶时，CO2迅速逸出而导致迅速逸出而导致酚酚红指示剂变红红指示剂变红，表明培养，表明培养液液pH变碱变碱，细胞，细胞在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。

8、在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。 羟乙基哌嗪乙硫磺酸羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-Hydroxyethyl Piperazine-N-Ethanesulfonic Acid缩写缩写HEPES) HEPES： 对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：防止防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能观察时能维持恒定的维持恒定的pH。细胞生存所需基本物质细胞生存所需基本物质（四）细胞生存所需基本物质（四）细胞生存所需基本物质 与体内基本相同，除碳水化合物、氨基与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一

9、定量的无机酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。代谢方式与体内细胞不尽相同。糖：糖：六碳糖是主要的能源通过糖酵解六碳糖是主要的能源通过糖酵解 形成形成 乳酸和通过柠檬酸乳酸和通过柠檬酸 形成形成 COCO2 2。 胚胎细胞和一些转化细胞的培养基胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。中常见到乳酸堆积现象。糖是合成某些糖是合成某些氨基酸氨基酸的原料；的原料；经过乙酰经过乙酰辅酶辅酶A A（CoACoA）合成脂肪合成脂肪；经过糖解磷酸通路能经过糖解磷酸通路能合成核酸合成核酸。各种糖的

10、吸收取决于它们进入细胞的能各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力力, ,其中葡萄糖最强其中葡萄糖最强, ,半乳糖最低。半乳糖最低。2. 氨基酸：氨基酸： 12种氨基酸种氨基酸：精氨酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸异亮氨酸(Zle)、亮氨酸亮氨酸(Leu)、赖氨酸赖氨酸(Lys)、蛋氨酸蛋氨酸(Met)、苯丙氨苯丙氨酸酸(Phe)、苏氨酸苏氨酸(Thr)、色氨酸色氨酸(Trp)、组组氨酸氨酸(His)、酪氨酸酪氨酸(Tyr)、缬氨酸缬氨酸(Val)是是细胞蛋白质合成的原料。细胞蛋白质合成的原料。 所有细胞都需要所有细胞都需要谷胺酰胺谷胺酰胺，其特殊的作用，其特殊的作用,可促

11、进各种氨基酸进入细胞膜。可促进各种氨基酸进入细胞膜。所含的所含的 氨氨 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；是合成是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物和一磷酸腺苷时所需物;是能源和碳的来源。是能源和碳的来源。如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺谷胺酰胺。 谷胺酰胺谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在在溶液中不稳定，应放置在20冰箱保存，用前加入培养液内。冰箱保存，用前加入培养液内。已含有已含有谷胺酰胺的培养液在谷胺酰胺的培养液在4冰箱内冰箱内可放置可放置时重新加入

12、原来量的时重新加入原来量的谷胺酰胺。谷胺酰胺。 需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成分。固定组成分。脂溶性维生素脂溶性维生素对细胞生长也有作用对细胞生长也有作用,一般一般从从血清血清中得到补充。中得到补充。 3.促生长因子：促生长因子：培养液除营养成分外，培养液除营养成分外，也也需要激素类物质起需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。到促进细胞增殖生长作用。胰岛素胰岛素(110单位单位)促进细胞利用葡萄糖和促进细胞利用葡萄

13、糖和氨基酸；氨基酸；氢化可的松氢化可的松(10-810-7M)促进表皮上皮细胞促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率；胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率； 雌激素和雄激素雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。血清血清 是提供生长因子和其细胞所需物质是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。分用生物工程的方法提取并商品化。 4. 其

14、它物质其它物质： 在细胞生长过程中在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰、钼钒等。锌、硒铜、锰、钼钒等。 需要需要促细胞粘附物质促细胞粘附物质其作用是：有助其作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上组于促细胞贴附在各种底物或支持物上组织生长。织生长。 5.人工培养基：人工培养基： 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供给细胞营养和保证细胞要的是培养基，是供给细胞营养和保证细

15、胞生长组织的物质。生长组织的物质。培养基的种类分为培养基的种类分为半固体半固体和和液体培养基液体培养基两类。两类。 液体培养基：液体培养基：分为合成、天然和无血清培分为合成、天然和无血清培养基三种。养基三种。 A合成培养基：合成培养基： 成分清楚成分清楚,通过调节各种成分的数量和种通过调节各种成分的数量和种类类,再借观察细胞生物状况反应性变化再借观察细胞生物状况反应性变化,测定测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。诱导细胞进行定向分化的等。 合成培养基在应用上广泛。合成培养基在应用上广泛。B天然培养基：天然培

16、养基： 用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。因子及其它活性物质等。加入加入5血清：维持细胞不死或缓慢生长；血清：维持细胞不死或缓慢生长；加入加入血清：细胞增殖生长。血清：细胞增殖生长。血清的主要作用血清的主要作用提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。补充培养液中没有或量不足的营养成分。补充培养液中没有或量不足的营养成分。含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。提供载体蛋白，

17、可结合维生素、脂质、金属离子等。提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。有中和毒性物质保护细胞不受伤害。有中和毒性物质保护细胞不受伤害。提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。白酶的损害。血清存在的问题血清存在的问题存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。成分不明确，影响对结果的分析。成分不明确，影响对结果的分析。不同动物、不同批次的血清和活性差别不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。较大，使培养的结果不稳定

18、。C.无血清培养基：无血清培养基： 培养基内加入培养基内加入促细胞生长因子促细胞生长因子，当前发，当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。还有现各种促细胞生长因子已达几十种。还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。提物。具有具有促进细胞生长增殖促进细胞生长增殖的作用。的作用。 6 .附着底物附着底物: 除少数悬浮型细胞外除少数悬浮型细胞外,绝大多数体外培绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上生长。不同养细胞需附着在适宜的底物上生长。不同细胞对底物要求不同，底物不适对细胞生细胞对底物要求不同，底物不适对细胞生长不良。长不良。常用的底物：常用的底物： A.

19、玻璃：玻璃：如用如用NaOH处理，性质能受到一定影处理，性质能受到一定影响响;酸中和以后再用（新的盐酸泡）易碎。酸中和以后再用（新的盐酸泡）易碎。B.一次性塑料：一次性塑料： 聚苯乙烯聚苯乙烯: 多为一次使用。多为一次使用。聚四氟乙烯包括：聚四氟乙烯包括： 充电荷：充电荷：亲水性，适用单层培养亲水性，适用单层培养不充电荷：不充电荷：疏水性，适用巨噬细胞、转化细疏水性，适用巨噬细胞、转化细胞的培养。胞的培养。聚四氟乙烯透气性好可制成薄膜，剪成小块聚四氟乙烯透气性好可制成薄膜，剪成小块后放入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，也后放入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，也便于取出，可进行染色和做电镜切片。便于

20、取出，可进行染色和做电镜切片。C.微载体：微载体： 由由聚苯乙烯聚苯乙烯和和聚丙烯酰氨聚丙烯酰氨混和混和制成制成 小球体小球体，附着面大，利于大量繁殖细，附着面大，利于大量繁殖细胞。胞。D:饲细胞饲细胞(Feeder cells)： 也称为滋养细胞，也称为滋养细胞，用用成纤维细胞成纤维细胞或其它细胞长成单层后，用大剂或其它细胞长成单层后，用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但能存活量射线照射，使细胞失去增殖能力，但能存活和有代谢活动。将其作为和有代谢活动。将其作为底物底物，其它细胞其它细胞接种接种上面；饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生上面；饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生长。长。饲细胞用

21、于：特殊难培养细胞，饲细胞用于：特殊难培养细胞，注意避免注意避免用同用同源细胞。源细胞。7.抑制细胞生长因素抑制细胞生长因素1.培养液消毒培养液消毒 2.操作不慎使有毒物质混在细胞生存的环境操作不慎使有毒物质混在细胞生存的环境中，抑制细胞生长。中，抑制细胞生长。3.血清灭活处理可除去补体和降低免疫球蛋血清灭活处理可除去补体和降低免疫球蛋白的毒性白的毒性,并不损伤多肽生长因子，但可能并不损伤多肽生长因子，但可能消灭另一些更有用的营养成分，因此有人消灭另一些更有用的营养成分，因此有人提出，提出，灭活血清不一定比不灭活血清更好。灭活血清不一定比不灭活血清更好。第二节第二节 细胞培养细胞培养 正常细胞

22、正常细胞 肿瘤细胞肿瘤细胞 正常细胞培养正常细胞培养人或动物体外培养都不易，建立细胞系更难。人或动物体外培养都不易，建立细胞系更难。原因：原因：是分化细胞；是分化细胞； 生存条件严格；生存条件严格；目前没有模拟与体内完全一样的方法；目前没有模拟与体内完全一样的方法；只要一切条件适当时仍有培养成功的可能；只要一切条件适当时仍有培养成功的可能；初代比传代容易。初代比传代容易。体外培养的上皮组织基本特点体外培养的上皮组织基本特点来源：来源：外、内、中三个胚层。外、内、中三个胚层。特征：特征：细胞排列密集，易形成细胞排列密集，易形成膜状膜状呈贴壁性生呈贴壁性生长。细胞常相互黏附，具长。细胞常相互黏附，

23、具有生长的接触性抑制有生长的接触性抑制现象。现象。 上皮组织细胞的结构和功能同样表现上皮组织细胞的结构和功能同样表现出出极性极性。细胞的增殖和分化依赖于细胞的增殖和分化依赖于促细胞生长促细胞生长因子因子的作用。上皮细的作用。上皮细胞的特殊结构，如微绒毛、胞的特殊结构，如微绒毛、紧密连接、桥粒等，在培养细胞中也可见到。紧密连接、桥粒等，在培养细胞中也可见到。 上皮组织的细胞培养条件上皮组织的细胞培养条件要求比较高要求比较高，常，常需生长在特殊的需生长在特殊的生长基质生长基质，极易失去在体，极易失去在体内巳有的分化特征，如细胞极性等。内巳有的分化特征，如细胞极性等。注意：注意： 不仅保证上皮细胞在

24、体外的不仅保证上皮细胞在体外的生长和繁殖生长和繁殖；而且应尽可能地恢复而且应尽可能地恢复和诱导上皮细胞在体和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。外培养状态下的分化。这也是上皮组织体外培养成功与否的关键。这也是上皮组织体外培养成功与否的关键。 上皮细胞体外培养的特殊条件上皮细胞体外培养的特殊条件 (1)防范微生物污染：防范微生物污染：根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。各种病原微生物

25、或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括培养中所使用的各种液体，包括细胞保细胞保存液存液、分离液分离液以及以及培养基培养基等需添加等需添加抗生抗生素素，抗生素浓度抗生素浓度比比其它组织培养高。其它组织培养高。 (2)生长基质的支持：生长基质的支持：上皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，上皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。即所谓的贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被在培

26、养器皿表面包被生长基质，生长基质，如如胶原胶原或其或其它它细胞外基质细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化使细胞极性表现更有利于培养细胞的分化使细胞极性表现更为明显。为明显。(3)特殊的培养基：特殊的培养基：培养基有培养基有M199、RPMl 1640、DMEM和和HamFl2。其中其中以以M199和和RPMl 1640较为常用。较为常用。M199和和RPMI1640培养基培养基仅适用于上皮组仅适用于上皮组织的织的短期培养和维持其生存短期培养和维持其生存，对上皮组织，对上

27、皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。的长期培养和促增殖作用并不明显。M199和和RPMl 1640DMEM和和HamFl2培养基用于上皮组织培培养基用于上皮组织培养时有其养时有其特殊作用特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。维持上皮细胞在体外培养状态的分化。DMEM和和HamFl2特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加中添加微量元素的无机离子微量元素的无机离子，更加利于细胞，更加利于细胞的生长和代谢。的生长和代谢。在实际培养时，将在实际培养时，将DMEM与与HamFl2按一定按一定比例混合用于上皮组

28、织培养。比例混合用于上皮组织培养。加入加入血清血清，但出厂血清成分复杂，含有一定，但出厂血清成分复杂，含有一定量的有毒物和抑制物。量的有毒物和抑制物。HamFl2培养基培养基的特殊性的特殊性无血清培养基：在培养基中主要添加了各无血清培养基：在培养基中主要添加了各种种促细胞生长因子促细胞生长因子，甚至还添加，甚至还添加大鼠颌下大鼠颌下腺腺或或脑垂体的粗提物；脑垂体的粗提物；以促进细胞的生长以促进细胞的生长和增殖。无血清培养基对细胞也有良好的和增殖。无血清培养基对细胞也有良好的促生长作用，但仍需完善和改进。促生长作用，但仍需完善和改进。无血清培养基无血清培养基(4)去除成纤维细胞：去除成纤维细胞：

29、 上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易的特点，很容易“疯长疯长”为培养物中的优势为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的成为上皮细胞的“细胞污染源细胞污染源”。 成纤维细胞成纤维细胞上皮细胞上皮细胞 因在上皮细胞因在上皮细胞的取材、分离、的取材、分离、种、种植

30、和传代的培养过程中，要特别注意植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维纯化，去除和抑制成纤维细胞细胞的生长的生长。 内皮细胞：内皮细胞：来源：人脐带脐静脉，动物动脉来源：人脐带脐静脉，动物动脉消化：用胶原酶比胰蛋白酶消化好。消化：用胶原酶比胰蛋白酶消化好。但要注但要注 意意 掌握掌握 消化时间和杂细胞（消化时间和杂细胞（成纤成纤维细胞和平滑肌细胞）。维细胞和平滑肌细胞）。 如消化时间过长或操作不慎、刮取过重如消化时间过长或操作不慎、刮取过重时，会造成血管内皮下层与外膜成时，会造成血管内皮下层与外膜成纤维细纤维细胞以及中膜平滑肌细胞胞以及中膜平滑肌细胞污染。由于这些杂污染。由于这些杂细胞生长较快，随着传代次数越多，其污细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。染的程度越重，从而使培养失败。 介绍排除杂细胞的方法：介