外周血循环肿瘤细胞检测技术进展

1、外周血循环肿瘤细胞检测技术进展主要内容主要内容循环肿瘤细胞检测的意义循环肿瘤细胞检测的意义循环肿瘤细胞检测的基本原理循环肿瘤细胞检测的基本原理纳米材料技术在循环肿瘤细胞检测中的应用纳米材料技术在循环肿瘤细胞检测中的应用微流控技术在循环肿瘤细胞检测中的应用微流控技术在循环肿瘤细胞检测中的应用循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）1896年年Ashworth在患者外周血中发现与原发肿瘤细在患者外周血中发现与原发肿瘤细胞胞 体积和形态相似的细胞；体积和形态相似的细胞；目前目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原

2、发灶或转移灶进入外周血循环的一类肿瘤细胞。灶或转移灶进入外周血循环的一类肿瘤细胞。 Ashworth TR. Aust Med J, 1869, 14: 146-147Allard WJ, Matera J, Miller MC, et al. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6897-6904研究研究CTCs的临床意义的临床意义 TNM分期的重要补充分期的重要补充 疗效监测和预后判断疗效监测和预后判断 个体化治疗的指导个体化治疗的指导 转移复发的早期预警转移复发的早期预警 血循环转移的机制血循环转移的机制TNM分期的重要补充分期的重要补充CTCs的临床意义的临床意义疗效

3、监测和预后判断疗效监测和预后判断CTCs的临床意义的临床意义个体化治疗的指导个体化治疗的指导CTCs的临床意义的临床意义转移复发的早期预警转移复发的早期预警CTCs的临床意义的临床意义血循环转移的机制血循环转移的机制CTCs的临床意义的临床意义CTCs特点特点 外周血含量低：110个CTC/mL血液1 个CTC/109 个血细胞； CTCs特性、形态及细胞标志随着内环境改变而改变，无统一鉴定标准。CTC的的检测步检测步骤骤检测检测富集富集以特异性抗体经抗原抗体吸附筛选根据细胞大小进行富集免疫细胞化学结合纳米材料物理学免疫学免疫/化学CTC富集方法富集方法免疫磁性分离免疫磁性分离阳性选择法阳性选

4、择法MACS、Cellsearch系统以及系统以及CTC-Chip阴性排除法阴性排除法CD45磁珠去除白细胞（磁珠去除白细胞（IMB法）法）抗原抗体吸附筛选抗原抗体吸附筛选 光镜下(放大倍数400倍)免疫磁珠吸附目标细胞分子生物分子生物学方法学方法(PCR)CTC检测检测免疫细胞免疫细胞化学方法化学方法(ICC(ICC、 EPISPOT)EPISPOT)流式细流式细胞技术胞技术CellTracks AutoPrep SystemCellSearch 检测CTCs 流程图1 1、不同肿瘤表面抗体的表达量存在差异、不同肿瘤表面抗体的表达量存在差异 2 2、肿瘤发展过程中细胞的去上皮化、肿瘤发展过程

5、中细胞的去上皮化 CTC研究现状研究现状磁珠体积很小，不损伤细胞、不影响细胞功能、磁珠体积很小，不损伤细胞、不影响细胞功能、不影响细胞的特异染色不影响细胞的特异染色( (细胞膜，细胞质，细胞细胞膜，细胞质，细胞核核) )，显微镜下可直接观察或计算机计数。，显微镜下可直接观察或计算机计数。前期应用微米磁珠，比表面积小、尺寸大、稳定前期应用微米磁珠，比表面积小、尺寸大、稳定性差、易聚沉，致细胞分离效率低，难洗脱并保性差、易聚沉，致细胞分离效率低，难洗脱并保持细胞活性；持细胞活性；检测成本高、样品用量多、样品检测时间长、检检测成本高、样品用量多、样品检测时间长、检测过程封闭等诸多不足测过程封闭等诸多

6、不足纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压力，提高富集率力，提高富集率 CTC方法学现状方法学现状纳米技术纳米技术 纳米科技是指在纳米尺度(从单个原子、分子到亚微米尺度之间)上研究物质特性和相互作用，以及由纳米结构集成的功能系统。以此可获得结构可控、表面功能化的纳米材料和纳米结构； 纳米材料具有一些独特的效应，包括小尺寸效应、量子尺寸效应、界面效应以及宏观量子遂道效应，使纳米材料在性能上与具有相同组成的传统概念上的微米材料有非常显著的差异，表现出许多优异的性能和全新的功能；纳米技术增大比表面积，分散性好，降低机械压纳米技术增大比表面积，分散性好，降

7、低机械压力，提高富集率。力，提高富集率。基于非磁性纳米材料的基于非磁性纳米材料的CTC 富集富集基于纳米材料修饰表面将抗体功能化的不同形状的纳米材料(纳米颗粒、纳米线等)提高了细胞与捕获靶点的接触几率、方便将CTC 细胞从表面洗脱，减少纳米颗粒吸附对于细胞活力和分析检测的影响Sekine J, et al. Adv Mater, 2011, 23 (41):4788-4792Zhang N, et al. Adv Mater, 2012, 24 (20):2756-2760基于非磁性纳米材料的基于非磁性纳米材料的CTC 富集富集基于纳米结构表面肿瘤细胞和正常细胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性，

8、利用纳米粗糙表面(如功能化的纳米线、纳米柱)分离血液中的CTCChen W Q,et al. ACS Nano, 2013, 7 (1): 566-575Hou S, et al. Adv Mater, 2013, 25(11): 1547-1551微流控技术微流控技术 微流控技术是一种针对极小量(10-910-18 L)流体进行操控的系统科学技术; 微流控芯片是微流控技术实现的主要平台和技术装置，其主要特征是容纳流体的有效结构(通道、反应室和其他某些功能部件)至少在一个维度上为微米级尺度。纳米技术与微流控技术结合纳米技术与微流控技术结合CTC-chips纳米技术与微流控技术结合纳米技术与微流

9、控技术结合磁性纳米材料与微流控结合用于CTC 富集；非磁性纳米材料与微流控结合用于CTC富集。磁性纳米材料与微流控结合 与CellSearchTM原理类似； 微流控芯片的样品量小、流速可控及构件透明； 磁珠用量减少25%。非磁性纳米材料与微流控结合第二代第二代CTC-chipsA) The HB-Chip consists of a microfluidic array of channels with a single inlet and exit. Inset illustrates the uniform blood flow through the device. (B) A micr

10、ograph of the grooved surface illustrates the asymmetry and periodicity of the herringbone grooves. Cartoon illustrating the cell-surface interactions in (C) the HB-Chip, and (D) a traditional flat-walled microfluidic device. Flow visualization studies using two paired streams of the same viscosity

11、(one stream is green, the other clear) demonstrate (E) the chaotic microvortices generated by the herringbone grooves, and the lack of mixing in (F) traditional flat-walled devices. 旧方法旧方法: :病人血液样本通过一种表层涂有抗体的硅芯片，该抗体与肿瘤细胞结合，血液平滑流过microposts限制了与抗体覆盖层的接触。新方法：新方法：将血液标本经过一个人字形沟槽，可快速混合液体，并产生一个更乱的血流，显著增加捕获

12、细胞的数量。Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7HB-chipsBlood from metastatic prostate cancer patients and healthy donors was processed using the HB-Chip. (A) Healthy donors (n = 10, red circles) were used to select the signal intensity threshold in our automated imaging system (

13、19). The metastatic prostate cancer patient data (n = 15, green circles) had significantly higher results, with 14 15 patient samples presenting CTCs above-threshold levels. Additionally, (B) the TMPRSS2-ERG fusion transcript was detected from RNA isolated from the HB-Chip, using RT-PCR. Sequencing

14、of the gel band identified the rare gene fusion of TMPRSS2 exon 1 and ERG exon 5. (C and D) Micrographs of CTCs isolated from patients with metastatic prostate cancer costained using antibodies against PSA (green), a leukocyte marker, CD45 (red), and a nuclear stain (DAPI). Corresponding micrographs of the same cells are shown to the right of the fluorescent images, demonstrating their appearance after subsequent staining with H and E. (Scale bars: 10 m). Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7Toner M, et al. Proc Natl Acad