发酵过程多尺度优化案例分析(郭美锦)

1、发酵过程多尺度优化案例发酵过程多尺度优化案例郭美锦郭美锦华东理工大学华东理工大学中国中国 上海上海青霉素发酵曲线基因工程菌基因工程菌红霉素发酵曲线红霉素发酵曲线303-09-433303-09-433批基因工程菌代谢过程曲线批基因工程菌代谢过程曲线( (接种量接种量10.7%)10.7%) 发酵中期（发酵中期（70-90h70-90h）随着补糖速率的快速上升，）随着补糖速率的快速上升，RQRQ上升上升，OUROUR、CERCER出现第二高峰，即出现第二高峰，即“二次生长二次生长”。阿维菌素发酵过程曲线阿维菌素发酵过程曲线发酵过程优化与放大是发酵过程优化与放大是一个令人困惑的问题一个令人困惑的问

2、题？ 背景背景 直接参数直接参数 物理参数物理参数 化学参数化学参数温度 压力 功率输入 通气流量 泡沫水平 加料速率 基质 前体 诱导物 培养液重量 培养液体积 生物热 培 养 液 表 观 粘度 积累消耗量 基质 酸 碱 消泡剂 细胞量 气泡含量 气泡表面积 表面张力 pH 氧化还原电位 溶解氧浓度 溶解 CO2浓度 排气 O2分压 排气 CO2分压 其他排气成分 成分浓度 糖 氮 前体 诱导物 产物 中间代谢物 金属离子 脱氢酶活力 各种酶活力 细胞内成分 蛋白质 DNA RNA 成熟不成熟搅拌搅拌 间接参数间接参数摄氧率（摄氧率（OUROUR） 二氧化碳生成率（二氧化碳生成率（CERCE

3、R） 呼吸商（呼吸商（RQRQ） 总氧利用总氧利用 体积氧传递系数（体积氧传递系数（KLaKLa） 细胞浓度（细胞浓度（X X） 细胞生长速率（细胞生长速率（RxRx） 比生长速率（）比生长速率（） 细胞得率（细胞得率（Y YX/SX/S） 糖利用率糖利用率 氧利用率氧利用率 比基质消耗率（比基质消耗率（u u） 前体利用率前体利用率 产物量（产物量（P P） 比生产率（）比生产率（） 其他需要计算的值参数其他需要计算的值参数 功率、功率准数功率、功率准数 雷诺数雷诺数 细胞量细胞量 生物热生物热 碳平衡碳平衡 能量平衡能量平衡 生生理理参参数数案例分析案例分析:多拷贝毕赤酵母发酵多拷贝毕赤酵

4、母发酵 毕赤酵母（毕赤酵母（Pichia pastoris） 猪胰岛素前体猪胰岛素前体(Porcine insulin precursor,PIP)毕赤酵母研究背景毕赤酵母研究背景毕赤酵母简介毕赤酵母简介： 经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。毕赤酵母表达系统特点：毕赤酵母表达系统特点：真核系统真核系统受甲醇严格调控的强启动子（受甲醇严格调控的强启动子（P PAOX1AOX1，P PGAPGAP，

5、P PFLDFLD等）等）成熟的高密度培养技术成熟的高密度培养技术 高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达）高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达） 外源蛋白基因遗传高稳定性外源蛋白基因遗传高稳定性 重组蛋白表达策略重组蛋白表达策略高密度高密度防蛋白降解防蛋白降解分泌效率分泌效率翻译效率翻译效率转录水平转录水平高拷贝数高拷贝数高表达高表达Typical profiles of Pichia pastoris with MutS type工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （1）：不同碳源不同碳源图图 3 葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图葡萄糖为碳源

6、时生长阶段发酵过程曲线图 图图4 甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图 图图 葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图 图图 甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图 PART 1:r-Phytase工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （2）：不同阶段不同阶段 图图 发酵不同时期发酵不同时期RQ值值 PART 1:r-Phytase图图7甘油为碳源时过渡阶段发酵过程甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和和DO曲线曲线 图图8 葡萄糖为碳源生长时过渡阶段发酵过程葡萄糖为

7、碳源生长时过渡阶段发酵过程OUR和和DO曲线曲线 图图 甘油为碳源时过渡阶段发酵过程甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和和DO 图图 葡萄糖为碳源生长时过渡阶段葡萄糖为碳源生长时过渡阶段OUR和和DO曲线曲线 工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （3）：不同碳源启动时间不同碳源启动时间PART 1:r-Phytase工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （4）：启动时间与强度启动时间与强度PART 1:r-PhytasePAOX ActivationStart inductionOUR/CER increase here

8、诱导阶段主要代谢途径关键酶酶学过程在线参数综合分析诱导阶段主要代谢途径关键酶酶学过程在线参数综合分析 糖酵解途径中关键酶丙酮酸脱氢酶复合体（糖酵解途径中关键酶丙酮酸脱氢酶复合体（PDCPDC）的活性）的活性 三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶（三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶（IDEIDE）活性）活性 HMPHMP途径中的关键酶途径中的关键酶6-P-6-P-葡萄糖脱氢酶葡萄糖脱氢酶( (G-6-PG-6-P) )活性活性 甲醇完全氧化代谢的甲醛脱氢酶甲醇完全氧化代谢的甲醛脱氢酶( (FADFAD) )、AOXAOX的活性的活性呈呈下降下降趋势（趋势（RQRQ：0.750.75）呈呈上升上升趋

9、势（趋势（RQRQ：0.75+0.50.75+0.5）6.1倍、倍、2.5倍倍 2.42.4倍、倍、5.15.1倍倍 甲醇浓度与、蛋白表达的关系甲醇浓度与、蛋白表达的关系00.20.40.60.811.20246810t/h乙醇氧化酶甲醛脱氢酶植酸酶活性植酸酶表达速率甲醇浓度甲醇消耗速率PAOX1强度与甲醇浓度关系：0.75g/LPAOX1启动与表达关系： 启动应有一定强度（过渡阶段）表达速率才能提高过高甲醇浓度的影响： 过高引起表达速率下降，同时加强甲醇完全氧化途径，浪费能量多拷贝基因菌株发酵过程特点多拷贝基因菌株发酵过程特点 图图 生长阶段与表达阶段的耗氧比较生长阶段与表达阶段的耗氧比较

10、低拷贝基因菌株与高拷贝基因菌株发酵比较低拷贝基因菌株与高拷贝基因菌株发酵比较 高拷贝菌株高拷贝菌株PIP2.0-1发酵过程图发酵过程图 低拷贝菌株低拷贝菌株YP99的发酵过程图的发酵过程图 重组蛋白表达策略重组蛋白表达策略高密度高密度防蛋白降解防蛋白降解分泌效率分泌效率翻译效率翻译效率转录水平转录水平高拷贝数高拷贝数高表达高表达拷贝数对外源蛋白表达的影响拷贝数对外源蛋白表达的影响正正效应效应CLARE, J. J. et al（1991）aMansur, M. et al（2005）Vassileva. et al（2001）Clare, J J. et al（1991）b胞内表达胞内表达分泌

11、表达分泌表达Hohenblum, H. et al（2004）Cos, O. et al（2005）Inan, M. et al（2006）30+30+拷贝数拷贝数拷贝数对外源蛋白表达的影响拷贝数对外源蛋白表达的影响负负效应效应如何优化高拷贝数毕赤酵母菌外源蛋白表达如何优化高拷贝数毕赤酵母菌外源蛋白表达策略？策略？Cos et al 2005Hohenblum et al 2004l外源蛋白折叠分泌能力下降外源蛋白折叠分泌能力下降 Hohenblum et al 2004; Inan et al 2006 高拷贝菌株构建高拷贝菌株构建6copy29copy重组毕赤酵母生长与表达重组毕赤酵母生长

12、与表达0102030405060708090 100 110050100150200250300350400OD600fermentation time (h) 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy 0102030405060700100200300400500600700800PIP(mg/L)induction time (h) 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy 多拷贝重组菌多拷贝重组菌OUR比较比较010203040506070809010011002040608010012014016018020001020304050607080901

13、0011002040608010012014016018020001020304050607080901001100204060801001201401601802000102030405060708090100110020406080100120140160180200OUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ补料诱导1-copy-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.2RQ诱导补料RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR

14、 RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.26-copy补料诱导RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.212-copy补料诱导RQOUR, CER(mmol.L-1.h-1)fermentation time (h) CER OUR RQ-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.40.60.81.01.218-copy0102030405060708090100110020406080

15、100120140160180200OUR(mmol.L-1.h-1)fermentation time（h） 1-copy 6-copy 12-copy 18-copy补料补料诱导诱导毕赤酵母在甲醇诱导时的代谢途径示意图毕赤酵母在甲醇诱导时的代谢途径示意图H2O2，ROOH， OH外源基因外源基因PIP的转录差异分析的转录差异分析PIP的转录水平增加与拷贝数成正比的转录水平增加与拷贝数成正比0 6 18蛋白伴侣基因的转录差异分析蛋白伴侣基因的转录差异分析PIP蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了0 6 180 6 18抗氧化基因的转录差异分析抗氧化基因

16、的转录差异分析高拷贝菌株可能受到氧化胁迫高拷贝菌株可能受到氧化胁迫0 6 180 6 18H2O2，ROOH， OH活性氧（活性氧（ROS）水平水平胞内胞内ROS和和GSH水平水平甲醇代谢途径关键酶基因的转录差异分析甲醇代谢途径关键酶基因的转录差异分析高拷贝菌株甲醇代谢途径发生显著变化高拷贝菌株甲醇代谢途径发生显著变化018601860186中心代谢途径关键酶基因的转录差异分析中心代谢途径关键酶基因的转录差异分析低拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）低拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）1.433.140.350.730.790.341.802.743.146.781.751.68高拷

17、贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）高拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）氧化胁迫氧化胁迫甲醇代谢显著变化甲醇代谢显著变化 拷贝数对毕赤酵母生理代拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析谢影响的转录差异分析拷贝数增加拷贝数增加蛋白合成量增加蛋白合成量增加蛋白氧化折蛋白氧化折叠通量增加叠通量增加胞内胞内GSH大量消耗大量消耗酵母代谢甲醛酵母代谢甲醛能力降低能力降低细胞调控通过降细胞调控通过降低甲醇通量来减低甲醇通量来减少胞内甲醛积累少胞内甲醛积累细胞碳源能源细胞碳源能源供给不足供给不足（PDI1，KAR上升）（GSH水平下降）（ROS上升）（AOX1下降，FLD上升）18-copy拷贝数对毕赤酵母生理代谢影拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析响的转录差异分析1.302.181.543.581.641.652.661.363.76YE补加后高拷贝菌株关键酶转录水平变化补加后高拷贝菌株关键酶转录水平变化传感技术应用传感技术应用尾气在线质谱技术尾气在线质谱技术在线显微观察仪