大鼠主动脉内膜球囊剥脱后再生内皮细胞表型改变的研究

1、大鼠主动脉内膜球囊剥脱后再生内皮细胞表型改变的研究摘要目的：探索大鼠主动脉内膜球囊剥脱后，内皮修复过程中再生内皮细胞结构和功能的改变。方法：大鼠主动脉内膜球囊剥脱2周和6周对内膜进行形态学观察，同时测定血管反应性、亚硝酸盐含量和NOS的活性。结果：剥脱2周和6周后，再生内皮细胞不仅结构与正常内皮细胞不同，而且血管再生内皮依赖性舒张反应减弱、NO的释放明显减少、血管组织iNOS和cNOS活性均比正常降低；剥脱6周后的iNOS比剥脱2周时有所增加，但cNOS则无明显差别。结论：实验提示在大鼠主动脉内膜剥脱后的内皮细胞再生增殖过程中，再生内皮细胞功能发生了表型改变，从而不能有效地抑制平滑肌细胞的增殖

2、和迁移；提示再生内皮细胞功能的功能不足或紊乱可能是再狭窄病变形的重要因素之一。主题词再生；内皮；一氧化氮；大鼠 Studyb on the changes of structure and function in regenerated endothelial cells after the denudation of endothelium in rat aortic artery OU He-Sheng, LIU Nai-Kui, TANG Chao-Shu, YAO Xing-Hai, WANG Pei-Yong, CHENG YanCardiovascular Disease Rese

3、arch Center of Beijing Medical University, Beijing (100083)Abstract AIM: To investigate the changes of structure and function in regenerated endothelial cells (REC) after the denudation of endothelium in rat aortic artery.METHODS：After the denudation of endothelium in rat artery by balloon, REC stru

4、cture was revealed by H E staining, the reactivity of endothelial dependent relaxation (EDR) in vessels, release of endothelial nitric oxide(NO) and vascular nitric oxide synthase (NOS) were investigated.RESULTS： REC structures were different from normal endothelial cell; EDR in vessels after denuda

5、tion for 2 weeks and 6weeks decreased, and release of endothelial nitric oxide(NO) decreased companied with inhibited vascular inducible nitric oxide synthase(iNOS) and constructional nitric oxide synthase(cNOS).CONCLUSION：Phenotypic shift of REC during neointima formation after endothelial removal

6、by balloon-injury, and dysfunction of REC might enhance neointimal impairment during retenosis formation after angioplasty.MeSHRegeneration; Endothelium; Nitric oxide; Rats血管内皮细胞损伤及旁/自分泌功能紊乱是血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化等病变的重要发生机制1血管内皮剥脱后的再生修复包括结构和功能的修复，直接参与并调节上述病变的发生发展过程。一般认为再生内皮能有效地抑制内膜下平滑肌细胞的增殖而有利于防止再狭窄的发展。然而

7、有资料表明，大鼠主动脉内膜球囊剥脱后内皮细胞再生的高峰期(2周)，平滑肌细胞的增殖并未受抑制，而且增殖迅速，即使在内皮再生停止并完全覆盖伤口的情况下，内膜下的平滑肌细胞增殖仍处于活跃状态2，因此有理由推测再生内皮细胞存在功能不足或紊乱从而不能有效地抑制平滑肌细胞增殖。为验证这一假说，本实验验用大鼠主动脉内膜球囊剥脱的模型，观察再生内皮细胞的形态和功能的改变，以探讨再生的内皮细胞表型改变在再狭窄和动脉粥样硬化等病理发生发展中的意义，为这些病变的临床防治提供理论依据。材料与方法1.材料：大鼠由本校实验动物中心提供：3H-L-Arginie系英国Amersha International Pic.产

8、品；去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach)、Dowex AG-50等购自Sigma公司。液闪仪为FJ-2107型。2.大鼠主动脉内膜剥脱术3：选280350 g雄性Wistar大鼠随机分为3组，即剥脱2周组、剥脱6周组和假手术组。剥脱组动物用0.6%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，暴露分离左颈总动脉，并插入自制2F球囊导管至腹主动脉，注入0.1 mL生理盐水扩张球囊后缓慢外拉以剥脱内膜，反复牵拉3次。缝合伤口后置于静室饲养。3.主动脉组织学观察：取大鼠主动脉中段(经横隔处)约3 mm长，置于10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色后，在显微镜下观察血管内膜、中膜及细胞形态

9、。4.主动脉血管反应性测定4：取大鼠主动脉中段，去除周围脂肪组织后剪成3 mm长的血管环，置于盛有Krebs-Henseleit(K-H)液、37、95% O2和5% CO2平衡的浴槽中，通过张力传感器连接记录仪以记录张力变化。平衡60 min，每20 min换液一次。用10-6mol/L的NE预激2次，直到引起等张收缩，重调静息张力为2.0 g，依次做(1)NE10-910-5mol/L累积浓度收缩曲线，以产生最大的张力Tmax和ED50表示血管收缩性；(2)用硝普钠(SNP)10-910-5mol/L记录血管舒张反应性；(3)10-710-55的方法稍有改良测定血管孵育液中NO2-含量，以

10、反映血管释放NO的量。血管组织NOS活性的测定按Scott等6的方法有所改良，根据1 mol精氨酸在NOS作用下生成NO的同时产生1 mol瓜氨酸，应用液体闪烁仪测定3H标记的精氨酸生成3t检验。结果1.组织学观察：正常血管横切面可见内膜、中层和外膜，其中内膜由一层内皮细胞所组成。剥脱后2周可见内膜层明显增厚，内皮细胞有多层，排列不整，细胞呈较细长的梭形或菱形；内膜下的基层破坏，中层平滑肌明显增厚，并有平滑肌细胞向内膜下迁移形成新内膜(neointima)，剥脱6周后的病变与剥脱2周组相类似。2.血管内皮依赖性舒张反应变化：与正常血管相比较，剥脱组的血管舒张反应性明显减弱。剥脱2周组血管内皮依

11、赖性舒张反应降低了78.9%(18.0%4.4% vs 85.5%6.5%，P0.01)，剥脱6周组血管内皮依赖性舒张反应降低了71.6%(24.3%6.8% vs 85.5%6.5%，Pvs2.2320.481 mool/L，P0.01)；剥脱6周组比剥脱2周组有所增加(1.5020.286 vs 0.8170.139 mol/L，P0.05)，但仍明显低于正常(1.5020.286 vs 2.2320.481 mol/L，P0.01)，如表1所示。剥脱2周组血管组织iNOS和cNOS活性均明显低于正常；剥脱6周组的iNOS和cNOS活性也明显低于正常；但剥脱2周组和剥脱6周组之间比较，2周

12、组的iNOS活性低于6周组，但cNOS活性无明显差别，结果见表2所示。表1大鼠主动脉内膜剥脱后血管孵育液中亚硝酸盐含量的变化Tab 1NO?2 in media of rat aortic artery cultures after balloon-injury(1 (164 bytes) Groupn(mol/L)2weeks60.8170.139*6weeks61.5020.286*Control62.2320.481 *P0.01，vs control表2大鼠主动脉内膜剥脱后血管组织氧化氮合酶活性的变化.min-1/mg pro)GroupniNOScNOS2weeks61.0160.2

13、32*3.5600.692*6weeks62.6180.493*5.2281.023Control66.5250.5849.3611.316 *P0.05，vs control讨论正常血管内膜是维持血管壁正常结构与功能的必要条件，血管内膜损伤及其以后发生的内皮细胞再生、血管平滑肌细胞增殖和迁移是血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化等病变特征。在大鼠主动脉内膜剥脱的模型上对内皮细胞再生的研究表明，内皮剥脱24 h后开始出现增殖，2周左右增殖速度达到最大，6周后再生停止；内皮细胞再生覆盖面积与剥脱程度有关，轻度剥脱时可完全覆盖创伤面7，而较大面积的剥脱时即使在半年以后也不能完全覆盖创伤面8；而同时对平

14、滑肌细胞增殖的观察研究显示，在内皮再生速度高峰期平滑肌细胞的增殖速度亦很快，即使在内皮再生完全覆盖创伤面的情况下平滑肌细胞也呈现增殖活跃状态2，因此再生内皮细胞能否象正常内皮细胞一样具有抑制平滑肌细胞增殖的能力值得怀疑，换言之，新生的内皮细胞是否存在细胞表型的改变从而表现出某些功能缺陷或紊乱，是十分值得探讨的问题。本实验在大鼠主动脉内膜球囊剥脱的模型上，研究再生内皮细胞的结构与功能变化。从组织切片观察到，损伤后2周的大鼠主动脉内膜明显增厚，内皮细胞层次增多，排列紊乱；细胞变得细长，可能因为相互挤压的结果；平滑肌细胞层明显增厚，并向内膜下迁移形成新内膜。剥脱6周后的主动脉内膜及平滑肌细胞层病变与

15、剥脱2周时基本相似。为了观察新生内皮的功能状况，本实验检测血管内皮依赖性舒张反应。结果发现剥脱2周和6周时均比正常血管明显降低，而剥脱2和6周组之间无明显差别，说明剥脱后再生内皮细胞依赖性舒张反应比正常内皮减弱，即使在剥脱6周后亦无明显改善。本实验的结果与De Meyer等910的体外细胞培养实验的报道结果不一致；剥脱6周后的iNOS活性比2周时有所增加，可能与平滑肌细胞增殖有关，而两组的cNOS活性并无明显区别，提示剥脱2周后内皮细胞的再生修复并不伴随细胞cNOS活性的增加。本实验NOS活性的降低可能是再生内皮细胞功能紊乱的表现之一，它将导致再生内皮细胞产生NO的能力减弱，从而导致血管平滑肌

16、细胞层增殖的抑制因素减弱。本实验NOS活性降低的原因机制不明，可能与再生内皮细胞合成内源性NOS活性的抑制物增加、抑或细胞本身NOS的合成及活性表达减少有关，确切机理有待进一步研究。作者单位：北京医科大学心血管基础研究所(北京100083)参考文献1Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Lab Invest, 1983,49:208.2Reidy MA. In vivo proliferation of vascular smooth muscle cells in vesse

17、ls with intact endothelial cover (Abstr).Fed Proc, 1986,45:683.3Madri JA, Reidy MA, Kocher O, et al. Endothelial cell behavior after denudation injury is modulated by transforming growth factor-1 and fibronectin. Lab Invest, 1989,60:755.4Nielson KC, Owman C. Contractile response and amine receptor m

18、echanisms in isolated middle cerebral artery of the cat. Brain Res, 1971,27:33.5Green LG. Analysis of nitrate ,nitrite and 15N-nitrate in biological fluids. Anal Biochem, 1982,126:131.6Scott JA, Mechoun M, Mc Cormack DG. et al. Inducible nitric oxide synthase and vascular reactivity in rat thoracic aorta: effect of aminoguanidine. J Appl Physiol, 1996,80:271.7Reidy MA, Schwartzsm. Endothelial regeneration : Tim